Name: 투과성이 골격 근육 섬유에 의해 생성 된 최대 아이소 포스의 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: 학습하세요 투과성 골격 근육 섬유의 최대 등장력 측정 방법을 통해 근육 수축 특성을 평가하는 기술을. 화학적 세제 처리와 레이저 간섭 패턴을 활용한 이 실험은 단일 섬유 수준에서 근기능을 정밀 분석합니다.

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<ol><li>Mendias, C. L., Kayupov, E., Bradley, J. R., Brooks, S. V., Claflin, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+specific+force+and+power+production+of+muscle+fibers+from+myostatin-deficient+mice+are+associated+with+a+suppression+of+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Decreased specific force and power production of muscle fibers from myostatin-deficient mice are associated with a suppression of protein degradation.</a> J Appl Physiol. 111 (1), 185-191 (2011).</li>
<li>Gumucio, J. P., Davis, M. E., Bradley, J. R., Stafford, P. L., Schiffman, C. J., Lynch, E. B., Claflin, D. R., Bedi, A., Mendias, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotator+cuff+tear+reduces+muscle+fiber+specific+force+production+and+induces+macrophage+accumulation+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Rotator cuff tear reduces muscle fiber specific force production and induces macrophage accumulation and autophagy.</a> J Orthop Res. 30 (12), 1963-1970 (2012).</li>
<li>Mendias, C. L., Roche, S. M., Harning, J. A., Davis, M. E., Lynch, E. B., Sibilsky Enselman, E. r, Jacobson, J. A., Claflin, D. R., Calve, S., Bedi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+muscle+fiber+force+production+and+disrupted+myofibril+architecture+in+patients+with+chronic+rotator+cuff+tears%5BTitle%5D)+AND+%22J+Shoulder+Elbow+Surg%22%5BJournal%5D)">Reduced muscle fiber force production and disrupted myofibril architecture in patients with chronic rotator cuff tears.</a> J Shoulder Elbow Surg. 1 (4), 111-119 (2015).</li>
<li>Moss, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sarcomere+length-tension+relations+of+frog+skinned+muscle+fibres+during+calcium+activation+at+short+lengths%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Sarcomere length-tension relations of frog skinned muscle fibres during calcium activation at short lengths.</a> J Physiol. 292, 177-192 (1979).</li>
<li>Chase, P. B., Kushmerick, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+pH+on+contraction+of+rabbit+fast+and+slow+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Effects of pH on contraction of rabbit fast and slow skeletal muscle fibers.</a> Biophys J. 53, 935-946 (1988).</li>
<li>Moisescu, D. G., Thieleczek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+strontium+concentration+changes+within+skinned+muscle+preparations+following+a+change+in+the+external+bathing+solution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium and strontium concentration changes within skinned muscle preparations following a change in the external bathing solution.</a> J Physiol. 275, 241-262 (1978).</li>
<li>Walker, S. M., Schrodt, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I+Segment+lengths+and+thin+filament+periods+in+skeletal+muscle+fibers+of+the+Rhesus+monkey+and+the+human%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">I Segment lengths and thin filament periods in skeletal muscle fibers of the Rhesus monkey and the human.</a> Anat Rec. 178, 63-81 (1974).</li>
<li>Gollapudi, S. K., Lin, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+determination+of+sarcomere+force-length+relationship+in+type-1+human+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Experimental determination of sarcomere force-length relationship in type-1 human skeletal muscle fibers.</a> J Biomech. 42, 2011-2016 (2009).</li>
<li>Brenner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technique+for+stabilizing+the+striation+pattern+in+maximally+calcium-activated+skinned+rabbit+psoas+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Technique for stabilizing the striation pattern in maximally calcium-activated skinned rabbit psoas fibers.</a> Biophys J. 41 (1), 99-102 (1983).</li>
<li>Claflin, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+high+and+low-velocity+resistance+training+on+the+contractile+properties+of+skeletal+muscle+fibers+from+young+and+older+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of high and low-velocity resistance training on the contractile properties of skeletal muscle fibers from young and older humans.</a> J Appl Physiol. 111, 1021-1030 (2011).</li>
<li>Lynch, G. S., Faulkner, J. A., Brooks, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+deficits+and+breakage+rates+after+single+lengthening+contractions+of+single+fast+fibers+from+unconditioned+and+conditioned+muscles+of+young+and+old+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Force deficits and breakage rates after single lengthening contractions of single fast fibers from unconditioned and conditioned muscles of young and old rats.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 295, C249-C256 (2008).</li>
<li>Frontera, W. R., Rodriguez Zayas, A., Rodriguez, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+of+human+muscle%3A+understanding+sarcopenia+at+the+single+muscle+cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Med+Rehabil+Clin+N+Am%22%5BJournal%5D)">Aging of human muscle: understanding sarcopenia at the single muscle cell level.</a> Phys Med Rehabil Clin N Am. 23, 201-207 (2012).</li>
<li>Malisoux, L., Francaux, M., Theisen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+do+single-fiber+studies+tell+us+about+exercise+training%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Sci+Sports+Exerc%22%5BJournal%5D)">What do single-fiber studies tell us about exercise training.</a> Med Sci Sports Exerc. 39 (7), 1051-1060 (2007).</li>
<li>Widrick, J. L., Stelzer, J. E., Shoepe, T. C., Garner, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+of+human+muscle+fibers+after+short-term+resistance+exercise+training%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regulatory+Integrative+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional properties of human muscle fibers after short-term resistance exercise training.</a> Am J Physiol Regulatory Integrative Comp Physiol. 238, 408-416 (2002).</li>
<li>Trappe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+spaceflight%2C+simulated+spaceflight+and+countermeasures+on+single+muscle+fiber+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gravit+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of spaceflight, simulated spaceflight and countermeasures on single muscle fiber physiology.</a> J Gravit Physiol. 9 (1), 323-326 (2002).</li>
<li>Malisoux, L., Jamart, C., Delplace, K., Nielens, H., Francaux, M., Thiesen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+long-term+muscle+paralysis+on+human+single+fiber+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of long-term muscle paralysis on human single fiber mechanics.</a> J Appl Physiol. 102, 340-449 (2006).</li>
<li>Krivickas, L. S., Walsh, R., Amato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+muscle+fiber+contractile+properties+in+adults+with+muscular+dystrophy+treated+with+MYO-029%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Single muscle fiber contractile properties in adults with muscular dystrophy treated with MYO-029.</a> Muscle Nerve. 39, 3-9 (2009).</li>
<li>Russell, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+fast+skeletal+muscle+troponin+as+a+potential+therapeutic+approach+for+treating+neuromuscular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Activation of fast skeletal muscle troponin as a potential therapeutic approach for treating neuromuscular diseases.</a> Nature Medicine. 18 (3), 352-356 (2012).</li>
<li>Krivickas, L. S., Yang, J. I., Kim, S. K., Frontera, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+fiber+function+and+rate+of+disease+progression+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle fiber function and rate of disease progression in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Muscle Nerve. 26, 636-643 (2002).</li>
<li>Mendias, C. L., Marcin, J. E., Calerdon, D. R., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+properties+of+EDL+and+soleus+muscles+of+myostatin-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Contractile properties of EDL and soleus muscles of myostatin-deficient mice.</a> J Appl Physiol. 101, 898-905 (2006).</li>
<li>Lynch, G. S., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contraction-induced+injury+to+single+permeabilized+muscle+fibers+from+mdx%2C+transgenic+mdx+and+control+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Contraction-induced injury to single permeabilized muscle fibers from mdx, transgenic mdx and control mice.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 279, 1290-1294 (2000).</li>
<li>Mizunoya, Q., Wakamatsu, J., Tatsumi, R., Ikeuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+high-resolution+separation+of+rodent+myosin+heavy+chain+isoforms+in+a+mini-gel+electrophoresis+system%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Protocol for high-resolution separation of rodent myosin heavy chain isoforms in a mini-gel electrophoresis system.</a> Anal Biochem. 377, 111-113 (2008).</li>
<li>Hill, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heat+of+shortening+and+the+dynamic+constants+of+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The heat of shortening and the dynamic constants of muscle.</a> Proc R Soc Lond B Biol Sci. 126, 136-195 (1938).</li>
<li>Bottinelli, R., Canepari, M., Pellegrino, M. A., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force-velocity+properties+of+human+skeletal+muscle+fibres%3A+myosin+heavy+chain+isoform+and+temperature+dependence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Force-velocity properties of human skeletal muscle fibres: myosin heavy chain isoform and temperature dependence.</a> J Physiol. 495, 573-586 (1996).</li>
<li>Edman, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+velocity+of+unloaded+shortening+and+its+relation+to+sarcomere+length+and+isometric+force+in+vertebrate+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The velocity of unloaded shortening and its relation to sarcomere length and isometric force in vertebrate muscle fibres.</a> J Physiol. 291, 143-159 (1979).</li>
<li>Brenner, B., Eisenberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate+of+force+generation+in+muscle%3A+Correlation+with+actomyosin+ATPase+activity+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Rate of force generation in muscle: Correlation with actomyosin ATPase activity in solution.</a> PNAS. 83, 3542-3546 (1986).</li>
<li>Moss, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+calcium+on+the+maximum+velocity+of+shortening+in+skinned+skeletal+muscle+fibres+of+the+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Muscle+Res.+Cell+Motil%22%5BJournal%5D)">The effect of calcium on the maximum velocity of shortening in skinned skeletal muscle fibres of the rabbit.</a> J. Muscle Res. Cell Motil. 3, 295-311 (1982).</li>
<li>Pate, E., Wilson, G. J., Bhimani, M., Cooke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+dependence+of+the+inhibitory+effects+of+orthovanadate+on+shortening+velocity+in+fast+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Temperature dependence of the inhibitory effects of orthovanadate on shortening velocity in fast skeletal muscle.</a> Biophys J. 66, 1554-1562 (1994).</li>
<li>Ashley, C. C., Moisescu, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+changing+the+composition+of+the+bathing+solutions+upon+the+isometric+tension-pCa+relationship+in+bundles+of+crustacean+myofibrils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of changing the composition of the bathing solutions upon the isometric tension-pCa relationship in bundles of crustacean myofibrils.</a> J Physiol. 270, 627-652 (1977).</li>
<li>Godt, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-activated+tension+of+skinned+muscle+fibers+of+the+frog.+Dependence+on+magnesium+adenosine+triphosphate+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium-activated tension of skinned muscle fibers of the frog. Dependence on magnesium adenosine triphosphate concentration.</a> J Gen Physiol. 63, 722-739 (1974).</li>
<li>Fabiato, A., Fabiato, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculator+programs+for+computing+the+composition+of+the+solutions+containing+multiple+metals+and+ligands+used+for+experiments+in+skinned+skeletal+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+de+Physiologie+%28Paris%29%22%5BJournal%5D)">Calculator programs for computing the composition of the solutions containing multiple metals and ligands used for experiments in skinned skeletal muscle cells.</a> Journal de Physiologie (Paris). 75, 463-505 (1979).</li>
<li>Chase, P. B., Kushmerick, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+physiological+ADP+concentrations+on+contraction+of+single+skinned+fibers+from+rabbit+fast+and+slow+muscles%29%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of physiological ADP concentrations on contraction of single skinned fibers from rabbit fast and slow muscles).</a> Am J Physiol. 268, C480-C489 (1995).</li>
<li>Godt, R. E., Maughan, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swelling+of+skinned+muscle+fibers+of+the+frog%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Swelling of skinned muscle fibers of the frog.</a> Biophysical Journal. 19, 103-116 (1977).</li>
<li>Kawai, M., Wray, J. S., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+lattice+spacing+change+on+cross-bridge+kinetics+in+chemically+skinned+rabbit+psoas+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The effect of lattice spacing change on cross-bridge kinetics in chemically skinned rabbit psoas muscle fibers.</a> Biophys J. 64, 187-196 (1993).</li>
<li>Millman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+filament+lattice+of+striated+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">The filament lattice of striated muscle.</a> Physiol Rev. 78 (2), 359-391 (1998).</li>
<li>Edman, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+properties+of+mouse+single+muscle+fibers%2C+a+comparison+with+amphibian+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Contractile properties of mouse single muscle fibers, a comparison with amphibian muscle fibers.</a> J Exp Biol. 208, 1905-1913 (2005).</li>
<li>Phillips, S. K., Woledge, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+isometric+force%2C+maximum+power+and+isometric+heat+rate+as+a+function+of+sarcomere+length+in+mouse+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv%22%5BJournal%5D)">A comparison of isometric force, maximum power and isometric heat rate as a function of sarcomere length in mouse skeletal muscle.</a> Pflügers Archiv. 420, 578-583 (1992).</li>
<li>Stephenson, D. G., Williams, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+sarcomere+length+on+the+force-pCa+relation+in+fast+and+slow-twitch+skinned+muscle+fibres+from+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of sarcomere length on the force-pCa relation in fast and slow-twitch skinned muscle fibres from the rat.</a> J Physiol. 333, 637-653 (1982).</li>
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투과성이 하나의 골격근 섬유의 수축 특성의 평가는 광범위한 맥락에서 근육 기능을 조사하기 위해 사용된다. 예를 들면 노화 (12)의 효과를 평가 한 연구, 10,13,14 운동, 우주 비행 15, 부상 2,3,16, 약물 치료 17, 18, ​​질병 (19)과 섬유의 구조와 기능에 유전자 조작 (20, 21)를 포함한다. 때문에 직접 자신의 고유 구성에 근원 섬유의 수축 성능을 평가하는 능력,이 기술은 존재하는 잠재적 교란 효과의 근원 섬유 기능의 부재에 대한 이해를 형성하기에서 매력적인 플랫폼을 제공 할 때 신경 근육 신호 전송 및 여기에 의한 칼슘 방출 연구 대상 시스템에 포함되어 있습니다. 또한, 단 섬유의 기능 시험은 이러한 것과 수축성 단백질 식별 결과를 보완하기 위해 사용될 수있다면역 조직 화학 또는 겔 전기 + 웨스턴 블롯 (22)를 통해 얻을. 골격근의 주요 기능 중 하나는 힘을 발생하는 것이다. 따라서 SF 오, 수축 시스템의 본질적인 힘 생성 능력의 측정, 근육 생리학에 중대한 관심사이다. SF 오의 신뢰성 평가는 섬유 CSA와 F 오 양의 정확한 측정이 필요합니다. 섬유이기 때문에 CSA를 추정 할 때, 일반적으로, 그 길이를 따라 단면적도 단면 원형 없으며, 유니폼, 큰주의를 기울여야합니다. 이를 위하여, 측정은 90 °로 분리 된 두 가지 관점에서, 각 위치에서, 섬유의 길이를 따라 여러 위치에서 실시하고있다. F 오 신뢰성 대책 칼슘 농도 t와 활성 용액을 이용하는, 두껍고 얇은 필라멘트의 오버랩을 최대화하기 근절 길이를 조정하는, 수동적 인 힘 차지 등 여러 세부 사항에주의를 필요최대 활성화 모자 결과, 원하는 실험 온도를 유지하고, 실험 하루 전에 섬유의 최적 보관 조건 (온도 및 시간)을 유지. 여기에 설명 된 단계는 최대 메트릭 힘을 평가하기위한 절차를 설명하는 반면, 골격근 섬유의 다른 중요한 기능적인 특성을 평가하기 위해 종종 바람직하다. 이것은 섬유의 기계적 조작을 추가로 포함하는 실험 프로토콜을 확장함으로써 달성 될 수있다. 예를 들어, 섬유는 상이한 부하에 대해 일련의 단축되는 속도의 측정 력 파워와 속도 파워 10,23,24 관계를 산출 할 수있는 힘의 속도 관계의 판정을 허용한다. 또한, 언로드 된 쇼트닝의 ​​속도는 슬랙 유도 단축 단계 및 measuri 일련인가 이루어져 &quot;슬랙 테스트&quot;(25)을 이용하여 결정될 수있다섬유에 의해 요구되는 시간은 ng를 슬랙을 제거한다. 자주보고 또 다른 운동 매개 변수는 K TR, 일시적으로 모두 분리 기계 섭동 다음 힘 재개발에 대한 속도 상수 (26) crossbridges입니다. 마지막으로, 칼슘 농도 및 활성 구동력 발생 ( &quot;힘 PCA 관계&quot;) 사이의 관계는 관심 18 종종이고 임계치 아래에서 수축을 활성화하기위한 레인 징 칼슘 농도 용액의 일련의 광 노출에 의해 결정될 수있다 그 충분한에 시스템은 최대 활성화 따라서 최대 힘 (F O를) 유도합니다. 언급 된 장비의 대부분이 단일 섬유 수축력을 평가하기위한 필요하지만, 다른 장비가 절대적으로 필요하지 않습니다. 길이 제어부는, 예를 들어, 섬유의 신속한 또는 정확한 연장 또는 단축이 필요한 실험 프로토콜에 필수적인하지만 (힘 레코드의 제로 힘 수준이 여전히 몇 가지 방법으로 확인해야하지만) 최대 아이소 메트릭 힘을 평가하는 절대적으로 필요하지 않습니다. 실험 챔버 내에 섬유를 배치 할 때, 단면 영역을 평가하는 동안 유용한 측으로부터 섬유의 관찰을 허용 프리즘은, 반드시 필요하지 않다. 또한, 다른 대안은 챔버 또는 급속 충전을 가능하게 단일 챔버의 수동식 시스템 고안 및 솔루션 비우는 포함한 사용될 수있는 다양한 실험 용액에 섬유를 노출하기위한 수단을 포함한다. 예컨대 15 ° C로서 서브 생리 실험 온도는 일반적으로 기계적 1,2,3,5,8,12,17,27 측정의 재현성을 향상시키기 위해 사용하는 동안 마지막으로, 다른 온도 23 유효 데이터를 생성 할 수있다 솔루션의 특성에 대한 온도 (칼슘 농도, 산도 등)의 영향으로 28 한 고려된다. </P&gt; 시험 용액의 조성물은 여기에 기재된 광 투과성이 기술의 가장 중요한 측면들이다. 용액 조성물에 관한 고려가 복잡하고이 문서의 범위를 벗어납니다. 프로토콜 섹션의 5 단계에서 설명하는 솔루션은 일정한 이온 강도, 양이온 성분 및 삼투압 6,29을 유지하면서 솔루션을 활성화로 미리 활성화로부터 전송시 투과성이 섬유의 빠른 활성화에 중점을두고 설계되었습니다. 용액 조성물에 다른 방법은 다른 연구 그룹에서 주목할만한 성공을 사용하고 일반적으로 공개 바인딩 상수 및 계산 도구 27,30,31 활용되어왔다. 다양한 활성화 용액에 칼슘 이온의 농도는 힘 - PCA 평가로서 준 최대 활성화와 관련된 연구에 중요하다. 이러한 것과 같은 섬유가 완전히 활성화되는 실험 들어 설명D 여기서, 활성 용액 중의 칼슘 농도는 통상적으로 그것의 정확한 지식은 덜 중요하게, 최대 힘을​​ 달성하기 위해 필요한 마진에 의해 편안하게 초과한다. 크레아틴 인산의 첨가는 달리 수축 활성과 연관 될 것이다 intramyofibrillar ATP와 ADP의 변동을 버퍼링 중요하다. 크레아틴 키나제가 ADP에 크레아틴 인산으로부터 포스페이트 전달을 촉진 할 필요가있다. 고온에서 작동 또는 빨리 섬유 (32)에 고속 단축 측정 포함한 높은 ATP 회전율, 결과 실험 조건 하에서, 크레아틴 키나제는 섬유에 결합 된 유지 내인성 크레아틴 키나아제를 보충 용액에 첨가되어야한다. 덜 까다로운 실험 조건 들어, ATP 재생 시스템 (27)은 덜 중요하다. 투과성이 단일 섬유 기술의 한계는 다음과 같습니다. 이러한 테스트에 의해 생성 된 데이터를 정의실험 장치에 부착 된 특정 근원 섬유 단위의 수축 특성. 따라서,이 세그먼트는 차례로, 근육 내의 섬유의 총 수의 작은 부분을 나타내는, 수득되는 다핵 섬유 전체의 단지 작은 부분을 캡처한다. 수사관들은 이렇게 조심스럽게 실험에서 도출 결론을 지원하는 데 필요한 샘플링을 고려해야한다. 또한, 섬유의 기능에 대한 운동 교육 개입의 영향을 평가하는 것은 평가 섬유가 실제로 훈련 기간 동안 모집 있다고 가정합니다. 프로토콜은 섬유의 천연 세포 내 환경을 모방하려고하지만, sarcolemma의 투과성으로 공정은 비특이적이고, 반드시 수용성 세포 성분 자유롭게 입욕 용액 내로 확산 할 수있다. 막 투과성의 또 다른 결과는 섬유 볼륨 (33)의 팽창에 의해 입증 삼투압 균형의 변화이다.섬유 팽윤 myofilament 시스템 34,35 감소 된 칼슘 민감성 결과 액틴과 미오신 필라멘트 사이의 거리를 증가 시키지만, 큰, 삼투 적으로 활성 인 화합물 (34)의 도입에 의해 역전 될 수있다. 고려하는 최종 제한 실험 장치에 섬유를 부착하는 데 사용되는 기술의 결과이다. 이것은 불변 기능적 결손 참석과, 부착 지점에서와 근처 필라멘트 시스템 내의 공간적 관계 왜곡 요구한다. 구체적으로는, 상기 광섬유와 연결 지점에 인접하는 영역의 기능적 손상되고 이에 의해 측정 시스템에 인공적 시리즈 탄성 기여한다. 요약하면, 우리는 시험관 내에서 화학적으로 투과성이 골격근 섬유의 힘 발생 능력을 평가하는 방법을 설명 하였다. 이 기사의 초점은 최대 아이소 메트릭 힘 generatin의 평가되었지만인간 골격근 섬유의 g 용량은, 실험 방법은 변성 및 종, 또는 다른 포유 동물의 범위에 걸쳐 운동 파라미터와의 관계를 결정하는 데 다양한 확장 될 수있다.

골격근의 주요 기능은 힘을 발생하는 것이다. 근력은 운동 신경 활동 전위, 신경근 전달, 근육 섬유 활동 전위, 세포 내 칼슘의 방출, 및 규정 및 수축성 단백질의 시스템의 활성화를 포함 이벤트 복잡한 시퀀스를 통해 생체 내에서 유도된다. 구동력 발생이 시퀀스의 최종 결과이기 때문에, 힘의 결핍은 개별 단계 중 하나 이상의 오류로 인해 발생할 수있다. 투과성이 섬유 제조의 중요한 속성은 근원 섬유 장치는 나머지와 관련된 유일한 규제 및 수축 기능을, 생체 내에서 구동력 발생에 필요한 단계의 대부분을 제거한다는 것이다. 조사는 칼슘과 에너지 (ATP)를 활성화의 전달에 대한 제어를 가정하고 그 나라의 공동의 고립 된 규제 및 수축 구조의 평가를 할 수있는 단순화 된 시스템과 보상nfiguration. 생체 내에서 관찰 근육 기능의 변화를 평가할 때 투과성이 골격근 섬유를 사용하여 힘 측정 따라서 가치가있다. 예를 들어, 우리는 미오 스타틴 결핍 마우스 (1)로부터 섬유의 힘 발생 능력을 특성화하는 만성 회전근 2,3- 다음 나타내 영구 근육 약화의 원인을 평가하기 위해이 기술을 사용했다. 현대 광 투과성이 방법론은 초기 연구 영향력 4,5- 추적 연구 그룹 번호로 현재 사용된다. 기술은 문헌에 기재되어있다하더라도, 그들은 아직 비디오 포맷으로 제시되어 있지 않다. 이 문서의 목적은 화학적으로 투과성이 골격근 샘플들로부터 단일 섬유의 최대 힘 발생 능력을 측정하기 위해 업데이트, 유효하고 신뢰성있는 방법을 설명하는 것이다. 이, 본 명세서에서 개별 섬유 세그먼트 (달성하기 ̶0; 섬유 &quot;)은 섬유의 사전 - 투과성이 번들로부터 추출하고 편안한 함유 용액 실험 챔버 내에 배치되어, 정의 기능 그중 10 &lt;㎚이다 칼슘 농도이다. 섬유이어서 강제 변환기에 일단과 길이 컨트롤러 타단에 부착되어있다. 최적 근절 길이로 유지 섬유, 그것은 최대 활성화하여 최대 메트릭 수축력을 유도하기에 충분한 칼슘 농도를 갖는 활성 용액에 전송된다. 포스 데이터 획득 및 저장 퍼스널 컴퓨터를 사용하여 분석한다.

<table><tbody><tr><td>캡이 있는 폴리스티렌 배양 시험관</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>14-956-3D</td><td></td></tr><tr><td>0.5ml 나사 캡 마이크로 원심분리기</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>02-681-334</td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml 마이크로 원심분리기 캡과 O-링</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>02-681-358</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 cryobox</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>5055-5005</td><td></td></tr><tr><td>pH 측정기</td><td>Mettler-Toledo</td><td>FE20</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>08-757-11YZ</td><td></td></tr><tr><td>비멸균 봉합사 10-0 모노필라멘트</td><td>애셔웨이 라인 꼬기</td><td>S30002</td><td></td></tr><tr><td>곤충 핀</td><td>정밀 과학 도구</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>집게 - Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Microdispirting Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ8</td><td></td></tr><tr><td>마이크로미터</td>는 <td>Parker Hannifin</td><td>3936M</td><td></td></tr><tr><td>온도계</td><td>Physitemp</td><td>BAT-12</td><td></td></tr><tr><td>수조 순환기를</td> 구동합니다.<td>Neslab Instruments</td><td>RTE-111</td><td></td></tr><tr><td>온도 컨트롤러</td><td>Aplha Omega Instruments</td><td>시리즈 800</td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW 소프트웨어</td><td>National</td> <td>Instruments-Computer</td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td>Varied-Chamber</td><td></td></tr> <tr><td>system</td><td>Aurora Scientific</td><td>802D</td><td></td></tr><tr><td>길이 컨트롤러</td><td>Aurora Scientific</td><td>312C</td><td></td></tr><tr><td>힘 변환기</td><td>Aurora Scientific</td><td>403A</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">시약</td></tr><tr><td>K-proprionate</td><td>TCI America</td><td>P0510</td><td></td></tr><tr><td>Imadizole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0125</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&bull; 6H20</td><td>시그마-알드리치</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Brij 58</td><td>시그마-알드리치</td><td>P5884</td><td></td></tr><tr><td>EGTA (산)</td><td>시그마-알드리치</td><td>E0396</td><td></td></tr><tr><td>Na2H2ATP&bull; 0.56H2O</td><td>시그마-알드리치</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마-알드리치</td><td>G6279</td><td></td></tr><tr><td>헤페스(산)</td><td>시그마-알드리치</td><td>H7523</td><td></td></tr><tr><td>MgO</td><td>시그마-알드리치</td><td>529699</td><td></td></tr><tr><td>HDTA(산)</td><td>TCI America</td><td>D2019</td><td></td></tr><tr><td>CaCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4830</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>KOH (1 N)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>35113</td><td></td></tr><tr><td>HCL (1 N)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>318949</td><td></td></tr><tr><td>Na2CrP&bull; 4H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>pH 10 표준</td><td>Fisher Scientific</td><td>SB115</td><td></td></tr><tr><td>pH 7 표준</td><td>Fisher Scientific</td><td>SB107</td><td></td></tr></tbody></table>

투과성이 골격 근육 섬유에 의해 생성 된 최대 아이소 포스의 측정

Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

화학적으로 피부가 벗겨지거나 투과된 골격근 섬유의 수축 특성을 분석하는 것은 단일 근육 세포 수준에서 근육 기능을 평가할 수 있는 강력한 수단을 제공합니다. 단일 근육 섬유 연구는 기초 과학과 임상 연구 모두에 유용합니다. 기본 연구의 경우, 단일 근섬유 수축성 측정을 통해 힘 생성의 기본 메커니즘을 조사하고 유전자 조작의 맥락에서 근육 기능을 분석할 수 있습니다. 임상적으로 단일 근육 섬유 연구는 부상과 질병이 근육 기능에 미치는 영향에 대한 유용한 통찰력을 제공하며 근육 병리학에 대한 이해를 안내하는 데 사용될 수 있습니다. 이 비디오 기사에서는 개별 골격근 섬유 세그먼트를 준비 및 분리하고, 힘 측정 장치에 부착하고, 최대 등척력을 생성하도록 활성화하고, 생성된 힘을 정규화하기 위해 단면적을 추정하는 데 필요한 단계를 간략하게 설명합니다.

건강, 화학적으로 투과성이 단일 섬유 모양의 유니폼을 표시하고 높은 배율에서 볼 때 일관성있는 줄무늬의 간격이 있어야합니다. 집게를 조작 할 때 유연 또는 명백한 구조적 손상이 섬유는 폐기해야합니다. 단계 15 동안 촬영 고배율 디지털 이미지는 섬유의 중간 부분을 따라 5 쌍의 직경 측정을 위해 분석된다. 섬유 CSA는 타원형 단면을 가정하고도 7a에 도시 된 바와 같이 5 개인 CSA 측정 값을 평균 추정된다. 그림 7b는 또한 하나의보기에 섬유 치수가 다른 뷰 (즉, 교차에 쌍으로 크기에 비해 상당히 다를 수 있습니다 방법을 설명하는 역할을한다 절) 일반적으로, 라운드, 아니다. 인간 느리고 빠른 섬유 대표 힘 트레이스는 각각도 8a 및도 8b에 나타낸다. Voltag강제 변환기의 E 출력 테스트 동안 획득 및 데이터 획득 및 분석 소프트웨어 (LabVIEW를) 이용 (MN)를 강제로 변환된다. (9) 도면은 감산함으로써 계산된다 최대 활성 힘 (F에서 O)을 평가하기 위해 사용되는 방식을 도시 최적의 근절 길이의 섬유를 유지하기 위해 필요한 힘 편안한 상태에있는 동안 (수동 힘, F, P), 최대 섬유 활성화 중에 개발 된 큰 아이소 메트릭 힘 (총 힘, F T)에서. 제로의 힘에 대응 힘 변환기의 출력 이후이며, 일반적으로 상이한 입욕 챔버들 각각에 대해 서로 다른, 우리는 잠시에 제로 - 힘 레벨을 캡처 미리 활성화 및 솔루션을 활성화 모두 섬유를 늦추지 실험 기록. 섬유 CSA에 의해 최대 활동력 정상화 특정 포스 (SF 오)의 더 많은 정보 값을 생성하는 데 사용됩니다. 이 고려 섬유의 CSA 걸리기 때문에, SF 오 </sUB는&gt;함으로써 이종 섬유 사이의 크기의 비교를 허용하는 기능, 섬유의 수축에있어서의 내재적 힘 발생 능력의 척도를 제공한다. 이것은, 그러나, CSA 측정들이 다른 세포 내 구조가 차지하는 비율 대 수축에 의해 점유 된 필라멘트 섬유의 비율을 구별 할 수없는 것을 주목해야한다. 일반적인 건강의 특성, 마우스 및 Gumucio 등을위한 Claflin 등. 2011 인간 10, Mendias 등. 2011 1 성인 섬유. 쥐 2012 년 2 표 3에 자세히 설명되어 있습니다. 사용하여 생성 된 표 3에 제시되는 모든 데이터 이 문서에서 설명하는 기술. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="text-align:center"><tbody><tr><td rowspan="3" style="border:0px #fff solid"></td><td colspan="4"> 사람의 (광근 lateralis) </stronG&gt; </td><td> 쥐 (EDL) </td><td nowrap="nowrap"> 쥐 (하근) </td></tr><tr><td colspan="2"> 남성 </td><td colspan="2"> 여자 </td><td> 남성 </td><td> 남성 </td></tr><tr><td> 유형 1 </td><td> 유형 2A </td><td> 유형 1 </td><td> 유형 2A </td><td> (입력하지 않음) </td><td> (입력하지 않음) </td></tr><tr><td> CSA (μm의 2) </td><td> 4880-6900 </td><td> 5270-8380 </td><td> 3870-5470 </td><td> 4010-5610 </td><td> 1850-3080 </td><td> 5290-8010 </td></tr><tr><td> F 오 (MN) </td><td> 0.79-1.17 </td><td> 1.02-1.54 </td><td> 0.64-0.97 </td><td> 0.71-1.07 </td><td> 0.14-0.25 </td><td> 0.55-0.97 </td></tr><tr><td> SF 오 (kPa의) </td><td> 142-182 </td><td> 165-210 </td><td> 156-193 </td><td> 172-214 </td><td> 67-94 </td><td> 102-131 </td></tr><tr><td> N </td><td> 129 </td><td> (160) </td><td> 149 </td><td> (207) </td><td> (37) </td><td> (94) </td></tr></tbody></table> 인간의 광근에서 건강한 성인 섬유의 표 3. 일반적인 특성 10 lateralis, 마우스 신근 심지 longus 1 쥐 하근은 2 근육. 최적의 근절 길이는 모두 마우스에 대한 인간의 섬유 7,8 2.7 μm의 2.5 μm의 (36에서 설정 한 37)와 쥐의 섬유 (38). 실험 패 F 범위 (25 일, 75 번째 분위)는 1.39-1.73 mm, 1.17-1.53 ​​MM 각각 인간, 마우스 및 쥐에 대한 1.32-1.59 mm이다. 도시 된 범위는 25 번째와 75 번째 분위수를 나타내며 N 테스트 섬유의 수이다. 테스트 기간 동안 경험 한 가장 일반적인 문제는 힘 응 답 결과 봉합 루프 슬립을 포함도 10a에 도시 된 것과 같은 &quot;캐치&quot;, 그리고 갑자기 방향 또는 (휴식)에 반환하는 힘으로 응답하는 섬유의 일부 또는 전체 두께 눈물 E 제로 섬유는 여전히 해결책을 활성화에 몰입하는 동안 (그림 10B). 슬립, 눈물 또는 브레이크가 실험 기간 동안 발생하는 경우, 섬유는 폐기되어야하고, 섬유 실패 레코드를 유지하는 것이 또한 유익 할 수있다 (11) 비록 데이터는 제외. 발생할 수있는 또 다른 부정적 결과는 동안 미리 활성화 액 (도 10C)에서 섬유의 조기 활성화이다. 사전 활성화 용액에 활성화 부분 (즉, 칼슘 농도의 증가에 잘 의도 미리 활성화) 상당한 교차 오염을 잘 보여준다. 이때, 모든 화장실 흡입되어야하고, 탈 이온수로 잘 헹구고. 챔버 사이에 분할 표면을 건조도 recommen입니다이 분야에서 습기 나 결로 등 DED는 화장실 사이의 솔루션의 심지가 발생할 수 있습니다. 결정은 포함하거나 데이터가 궁극적으로 실험 초점에 따라 달라집니다 및 연구를 설계 할 때 따라서 고려되어야한다 제외합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig1.jpg" /> 그림 1 : 봉합 루프 (10-0 모노 필라멘트 나일론 봉합사). <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig2.jpg" /> 그림 2 :. 번들 해부 집게가 왼쪽 손에은 미세 절제 가위는 오른쪽에 있습니다. 레드 라인은 섬유의 길이 방향 축이 손목과 가위의 유리한 방향을 나타냅니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig3.jpg" /> 그림 3 : </stron표지 요소와 g는&gt; (A) 검사 장치. () 투명 바닥과 실험 챔버. (b) 길이 제어기. (C) 포스 트랜스 듀서. (d) 광원. (E) 디지털 디스플레이와 길이 컨트롤러 XYZ 마이크로 미터 거리에 있습니다. 디지털 디스플레이 (F) 스테이지 마이크로 미터 거리에 있습니다. (G) 포스 트랜스 듀서 XYZ 마이크로 미터 거리에 있습니다. 교정 레이저 회절 대상 스크린 (H) 플랫폼. (I) 제진 테이블. (나) 실험 챔버의 근접 촬영보기. 길이 제어기로부터 연장 (j) 스테인리스 부착면. 강제 변환기로부터 연장 (K) 스테인리스 부착면. (L) 사이드 뷰 프리즘. 열전 냉각 모듈 (M) 주택. 보고 챔버 테에 대한 (N) 열전대mperature. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig4.jpg" /> 그림 4 : 실험 챔버로 해부 접시에서 섬유를 전송하는 데 사용 100 μL 피펫 팁을 수정. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig5.jpg" /> 도 5 :. 실험 장치에 단 섬유를 실장 (A)를 제조 봉합 루프는 스테인레스 스틸의 표면에 부착 나사. (B) 섬유는 실험 챔버로 옮겼다. (C) 섬유가 제거 과량 봉합 봉합 루프들의 제 한쌍 스테인리스 부착 표면에 고정. (D) 제 봉합 루프의 맨 위에 나사 제자리에 묶어 봉합 루프의 두 번째 쌍. <img alt="그림 6"SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 52695 / 52695fig6.jpg&quot;/&gt; 도 6 : 근절 길이 보정 대상 화면에 레이저 간섭 패턴의 돌출부에 의해 평가된다 (a) 레이저 광원.. (b)의 거울. (c) 목표 화면. (D) 레이저 간섭 패턴. <img alt="도 7a" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig7A.jpg" /><img alt="그림 7B" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig7B.jpg" /> 그림 7 : 최적의 근절 길이의 섬유 단면적 (A) 결정 (2.7 μm의 = 인간). 타원형 단면 가정, CSA 다섯 섬유의 중앙부를 따라 위치와 다섯 개의 개별 측정의 평균의 각 섬유 CSA로보고 계산됩니다. 도 2a는 평면도 직경을 나타내고있다<html> 타원의 한 ​​축은,도 2b는 측면도 입자경을 나타내는 타원의 다른 축이다. (B) 모두 상단 및 측면도에서 찍은 다섯 대응하는 직경 측정의 각 섬유를 나타내는 대표적인 이미지. <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig8.jpg" /> 그림 8 : 건강한 인간 광근의 대표 힘의 흔적은 근육 섬유를 lateralis (1) 섬유 (CSA : 5710 μm의 2, F 오 : 0.89 Mn 및 SF 오 : 156 kPa의)를 입력합니다.. (: 9510 μm의 2, F 오 : 1.66 Mn 및 SF 오 : 174 kPa의 CSA) (B) (2A) 섬유를 입력합니다. 섬유 미오신 중쇄 타입 전기 영동 분리 및은 - 염색 기술 (22)의 사용을 통해 결정되었다. OAD / 52695 / 52695fig9.jpg &quot;/&gt; 그림 9 : 최대 활성 힘 (F 오)의 계산 사전 활성화 용액에 시작 길이 컨트롤러의 여유 유도 운동하는 동안 섬유 힘 응답 () 확장보기.. F P는 휴지 섬유와 2.7 ㎛의 근절 길이를 유지하는 데 필요한 힘이다. (b)는 길이 컨트롤러 여유 유도 운동의 확장 된보기. F P - 그 F 오 = F (T)를 참고. <img alt="그림 10" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig10.jpg" /> 그림 10 : 힘의 상승하는 동안 힘 추적에 &quot;캐치&quot;에 의해 입증 (A) 봉합 루프 슬립. 확인 루프 섬유를 활성화하기 전에 안전으로 확인합니다. 활성화시 (B) 섬유 휴식. 봉합 루프 장소 중에 가난한 섬유 무결성 또는 공격적인 섬유 몸싸움으로 할 수 있음, 표준. 때문에 칼슘과 사전 활성화 챔버의 오염 (C) 조기 부분 섬유 활성화 2+.

화학적으로 피부 또는 투과성이 골격근 섬유의 수축 특성의 분석은 하나의 근육 세포의 수준에서 근육 기능을 평가함으로써 강력한 수단을 제공한다. 이 문서에서 우리는 준비하는 유효하고 신뢰할 수있는 기술 개요 및 테스트는 시험 관내에서 골격 근육 섬유를 투과성이.

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 화학적으로 투과된 골격근 샘플 내 개별 섬유의 최대 등척성 힘 생성 능력을 측정하는 것입니다. 이는 먼저 근섬유 막을 화학 세제에 노출시켜 세포 외액과 세포 내액 사이의 장벽을 제거함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 소량의 섬유 다발에서 개별 섬유를 추출하여 실험 장치에 부착하는 것입니다.다음으로, 레이저 간섭 패턴을 사용하여 개별 섬유의 최적 근절 길이를 설정합니다. 마지막으로, 최대 등척성 수축력을 유도하기 위해 칼슘을 투여합니다. 결과적으로, 투과성 단일 섬유 기법은 전체 근육 구조와 관련된 복잡성 없이 골격근의 수축 특성을 평가할 수 있게 해줍니다.프로토콜을 성공적으로 수행하기 위한 핵심 단계들을 학습하는 것이 어려울 수 있으므로, 이 방법의 시각적 시연이 유용합니다. 먼저 함께 제공된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 해부, 보관 및 테스트 용액을 준비하십시오. 다음으로, 핀셋을 사용하여 USP 10 zero 단필라멘트 나일론 봉합사의 가닥으로 봉합 루프를 준비하십시오.이중 오버핸드 매듭(double overhand knot) 기법을 사용하여 테스트할 섬유마다 4개의 루프를 준비합니다. 매듭이 형성되면 이를 현미경 아래에 두고 IPS GTI 표시를 기준으로 지름이 약 750 micrometer가 되도록 크기를 줄입니다.그 후, 루프와 양옆의 500 µm 길이의 짧은 꼬리 부분만 남기고 남은 봉합사를 잘라냅니다. 개방 생검 또는 바늘 생검을 통해 얻은 소량의 근육 조직을 냉각된 해부 용액이 담긴 접시에 옮기고, 조직이 계속 잠겨 있도록 해부 용액을 더 추가합니다. 현미경으로 샘플을 관찰하고, 섬유의 종축이 연구자의 오른쪽 어깨 방향으로 정렬되도록 조작합니다.그 다음, 왼손에는 포셉을, 오른손에는 미세 해부 가위를 잡고 샘플의 모서리 부분을 고정하여 디쉬에 고정시킵니다. 섬유 사이의 세로 가장자리를 따라 다발을 조심스럽게 해부하기 시작합니다. 포셉이나 핀으로 인해 손상된 조직은 제거하여 폐기합니다.해부 과정이 끝나면, 다발을 해부 용액에서 비이온성 세제가 첨가된 차가운 신선한 해부 용액 2.5 milliliters가 들어 있는 3 milliliters 바이알로 옮깁니다. 샘플을 얼음 위에서 30분 동안 배양하며 가끔씩 부드럽게 흔들어 주고, 배양하는 동안 다발이 계속 잠겨 있도록 합니다. 그 후, 다발을 신선한 해부 용액이 든 바이알로 옮기고 짧고 부드럽게 흔들어 남아 있는 세제를 제거합니다.세척이 완료되면, 다발들을 냉각된 보관 용액이 들어 있는 바이알로 옮기고 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 4°C 보관 장소에서 바이알을 꺼내 모든 다발을 약컵이나 해부 접시로 옮깁니다. 보관 준비를 위해, 개별 라벨이 부착된 크라이오 바이알에 200~400 µL의 신선한 보관 용액을 채운 후 다발들을 옮기며, 이때 다발이 튜브 벽에 붙거나 표면에 떠 있지 않은지 확인합니다.그런 다음 튜브의 캡을 닫고 샘플을 -80 °C에서 보관하십시오. 여기에서 보여주고 동반된 텍스트 프로토콜에 설명된 것과 같은 실험 장치를 설정하십시오. 그런 다음 첫 번째 실험 챔버에는 이완액을, 두 번째 챔버에는 사전 재활성화액을, 세 번째 챔버에는 활성화액을 채우십시오.장치를 이완액에 넣은 상태에서 챔버의 온도가 15 °C로 일정하게 유지될 때까지 조정하십시오. 준비된 두 개의 봉합사 루프를 힘 변환기(force transducer)와 길이 제어기(length controller) 양쪽에서 뻗어 나온 스테인리스강 부착 표면에 끼웁니다. 다음으로, 분석하고자 하는 섬유 다발을 얼음 위에서 약 15분 동안 해동한 후, 신선하고 차가운 이완액이 채워진 실리콘 엘라스토머 코팅 페트리 접시로 옮깁니다.양 끝에 핀을 꽂아 번들을 고정하고, 포셉을 사용하여 번들이 완전히 잠겼는지 확인하십시오. 한쪽 끝의 섬유를 잡고 길이 방향을 따라 부드럽게 추출하기 시작하십시오. 섬유와 세포외 기질 사이의 유착으로 인해 과도한 장력이 발생하여 결과적으로 신장에 의한 손상이 일어날 수 있으므로, 번들에서 섬유를 추출할 때 주의해야 합니다.추출한 섬유를 소량의 이완액과 함께 변형된 피펫 팁에 넣고, 핀셋으로 조심스럽게 안내하여 이완액이 들어 있는 실험 챔버로 옮깁니다. 피펫 팁에서 섬유를 꺼내 길이 조절기에 고정합니다. 첫 번째 봉합 루프를 사용하여 섬유의 반대쪽 끝을 힘 변환기 방향으로 조작하고, 동일한 절차를 사용하여 섬유를 고정합니다.미세 해부 가위(micro dissecting scissors)를 사용하여 과도한 봉합사를 제거합니다. 그다음, 두 번째 루프를 첫 번째 루프 위로 통과시킨 후, 길이 조절기 부착 표면의 끝에서 0.2 millimeters 이내의 지점에 섬유를 고정합니다. 섬유의 힘 변환기(force transducer) 끝부분에서도 두 번째 루프를 사용하여 동일하게 반복합니다.실험 챔버의 측벽과 광섬유가 평행하도록 Y축 방향으로 길이 조절기의 위치를 조정하십시오. 그런 다음 프리즘 측면 뷰를 사용하여 광섬유를 관찰하고, 광섬유가 챔버 바닥과 평행해질 때까지 Z축 방향으로 길이 조절기의 위치를 조정하십시오. 광섬유가 어떤 방식으로든 손상된 경우, 해당 광섬유는 폐기하고 새 광섬유를 부착해야 합니다.레이저를 켜고 레이저가 섬유의 중심을 통과하도록 스테이지의 위치를 조정하십시오. 그런 다음, 타겟 스크린에서 원하는 회절광 간격이 관찰될 때까지 길이 조절기 X축 마이크로미터 드라이버를 사용하여 섬유의 장력을 높이거나 낮추어 근절 길이를 설정하십시오. 최적의 근절 길이가 설정되면, 가장 안쪽의 두 봉합사 사이의 거리를 측정하십시오.접안렌즈의 수직 십자선이 내부 봉합사의 가장 안쪽 경계에 맞춰지도록 챔버의 위치를 잡고 영점을 조절합니다. 마이크로미터 드라이브의 디지털 판독값을 확인하며 접안렌즈의 수직 십자선이 가장 안쪽 봉합사에 일치할 때까지 현미경에 대해 스테이지를 x축 방향으로 이동시킵니다. 디지털 디스플레이에 표시되는 섬유의 길이를 확인하여 해당 길이를 유지하고, 현미경 장착 카메라를 사용하여 섬유 중앙 부분의 상단 및 측면 뷰를 고배율 이미지로 캡처합니다.이 이미지들을 사용하여 섬유의 단면적을 계산하십시오. 챔버 제어 소프트웨어를 사용하여 섬유를 사전 재활성화 용액이 들어 있는 챔버로 이동시키고 그곳에서 3분 동안 배양하십시오. 섬유가 비활성화 용액에 있는 동안 수동 장력을 측정한 다음, 섬유를 활성화 용액이 들어 있는 챔버로 이동시키고 급격한 상승에 이어 힘이 평탄해지는 구간(plateau)이 나타날 때까지 최대 등척성 힘이 발달하도록 하십시오.다음으로, 길이 조절기를 사용하여 섬유 부착 지점 사이의 거리를 크고 빠르게 짧게 줄였다가, 다시 신속하게 원래 길이로 되돌려 0에 해당하는 힘 변환기 출력을 확인합니다. 여기에 표시된 힘은 타원형 섬유의 상단 및 측면 뷰에서 본 모습입니다. 단면적은 섬유 길이를 따라 다섯 지점에서 직경을 측정하고, 결과로 얻은 다섯 가지 면적의 평균을 계산하여 결정하였습니다.이 비디오에서 보여주는 기술을 사용하여 인간의 지근 및 속근 섬유의 힘 추적선을 측정하면, 속근 섬유가 지근 섬유보다 더 높은 속도로 힘을 생성한다는 것을 알 수 있습니다. 인간, 생쥐 및 쥐 근섬유의 전형적인 특성을 측정하여 여기에 제시하였습니다. 표시된 범위는 25~75분위수를 나타내며, N은 테스트한 섬유의 수입니다.종마다 비특이적 힘(specific force)의 차이가 크다는 점에 유의하십시오. 여기에 설명된 절차는 추가적인 개입을 통해 단일 골격근 섬유의 최대 내재적 힘 생성 능력을 평가하며, 여기에는 길이-힘(length force), 힘-속도(force velocity) 및 힘-칼슘(force-calcium) 관계 등 골격근 생리학의 중요한 측면들이 포함됩니다.

measurement-maximum-isometric-force-generated-permeabilized-skeletal

Research

연구

JoVE Journal

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