투과성이 골격 근육 섬유에 의해 생성 된 최대 아이소 포스의 측정

이 절차의 전반적인 목표는 화학적으로 투과된 골격근 샘플에서 개별 섬유의 최대 등척력 생성 용량을 측정하는 것입니다. 이것은 먼저 근육 섬유 막을 화학 세제에 노출시켜 세포 외와 세포 내 내용물 사이의 장벽을 제거함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 작은 섬유 다발에서 개별 섬유를 추출하여 실험 장치에 부착하는 것입니다.

다음으로, 레이저 간섭 패턴을 사용하여 개별 섬유에 대한 최적의 sarcomere 길이를 설정합니다. 마지막으로, 최대 등척성 수축력을 이끌어내기 위해 칼슘이 투여됩니다. 궁극적으로, perme single fiber technique은 전체 근육 구조와 관련된 복잡성 없이 골격근의 수축 특성에 대한 평가를 제공합니다.

이 방법을 시각적으로 시연하는 것은 프로토콜을 성공적으로 수행하기 위한 핵심 단계를 배우기 어려울 수 있으므로 유용합니다. 먼저 해부, 보관 및 테스트 솔루션을 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 준비합니다. 다음으로, 집게를 사용하여 USP 10 제로 모노필라멘트 나일론 봉합사 가닥에서 봉합 루프를 준비합니다.

더블 오버핸드 매듭 기술을 사용하여 테스트할 모든 섬유에 대해 4개의 루프를 준비합니다. 형성되면 매듭을 현미경 아래에 놓고 크기를 약 750마이크로미터 직경으로 줄입니다. IPS GTI 마킹을 가이드로 사용합니다.

그런 다음 여분의 봉합사를 잘라내고 양쪽에 루프와 작은 500마이크로미터 꼬리만 남깁니다. 개복 또는 바늘 생검을 통해 얻은 작은 근육 조직 덩어리를 식힌 해부 용액이 담긴 접시에 옮기고 조직이 물에 잠긴 상태로 유지되도록 더 많은 해부 용액을 추가합니다. 현미경으로 샘플을 검사하고 섬유의 세로축을 조사자의 오른쪽 어깨 쪽으로 정렬하도록 조작합니다.

그런 다음 왼손에는 집게를, 오른손에는 마이크로 해부 가위를 사용하여 모서리에 샘플을 고정하여 접시에 고정합니다. 섬유 사이의 세로 가장자리를 따라 다발을 부드럽게 해부하기 시작합니다. 집게나 핀으로 손상된 조직은 모두 제거하고 폐기하십시오.

해부 과정의 결과, 해부 용액의 번들을 비이온 세제가 첨가된 2.5ml의 신선한 냉각 해부 용액이 들어 있는 3ml 바이알로 옮깁니다. 얼음 위에서 30분 동안 가끔씩 부드럽게 저어 샘플을 배양하고 배양 내내 다발이 물에 잠긴 상태로 유지되도록 합니다. 그런 다음 번들을 새 해부 용액이 들어 있는 바이알에 옮기고 부드럽고 짧게 저어 남아 있는 세제를 제거합니다.

헹구고 나면 다발을 냉장 보관 용액이 들어 있는 바이알에 옮기고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 다음 날, 섭씨 4도의 보관 중인 바이알을 꺼내 모든 다발을 약 컵이나 해부 접시에 옮깁니다. 보관을 준비하기 위해 200-400마이크로리터의 새 보관 용액으로 채워진 개별 라벨이 부착된 극저온 바이알에 번들을 옮기고 번들이 튜브 측면에 달라붙거나 표면에 떠 있지 않은지 확인합니다.

그런 다음 튜브를 덮고 샘플을 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 여기에 표시된 것과 같은 실험 장치를 설정하고 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 명시합니다. 그런 다음 첫 번째 실험 챔버를 이완 용액으로, 두 번째 챔버를 사전 재활성화 용액으로, 세 번째 챔버를 활성화 용액으로 채웁니다.

이완 용액에 있는 장치를 사용하여 섭씨 15도로 안정될 때까지 챔버의 온도를 조정합니다. 준비된 봉합 루프 중 두 개를 힘 변환기와 길이 컨트롤러에서 확장된 스테인리스강 부착 표면에 끼웁니다. 다음으로, 관심 섬유 다발을 얼음에서 약 15분 동안 해동한 다음 신선하고 차갑게 식힌 이완 용액으로 채워진 실리콘 엘라스토머 도금 페트리 접시에 옮깁니다.

양쪽 끝에 핀으로 번들을 제자리에 고정하고 집게를 사용하여 잠겼는지 확인합니다. 한쪽 끝에서 섬유를 잡고 세로 축을 따라 부드럽게 추출하기 시작합니다. 다발에서 섬유를 추출할 때 섬유와 세포외 기질 사이의 접착은 과도한 장력을 유발하여 궁극적으로 스트레치로 인한 손상을 유발할 수 있으므로 주의해야 합니다.

추출이 완료되면 소량의 이완 용액과 함께 변형된 피펫 팁에 섬유를 넣고 겸자로 부드럽게 안내하는 이완 용액이 포함된 실험 챔버로 옮깁니다. 피펫 팁에서 파이버를 제거하고 길이 컨트롤러에 고정합니다. 첫 번째 봉합 루프를 사용하여 광섬유의 다른 쪽 끝을 힘 변환기 쪽으로 조작하고 동일한 절차를 사용하여 광섬유를 고정합니다.

마이크로 해부 가위를 사용하여 과도한 봉합사를 제거합니다. 다음으로, 두 번째 루프를 첫 번째 루프 위에 끼우고 길이 컨트롤러 부착 표면 끝에서 0.2mm 이내의 지점에 파이버를 고정합니다. 광섬유의 힘 변환기 끝에서 두 번째 루프로 반복합니다.

광섬유를 실험 챔버의 측벽과 평행하게 정렬하기 위해 Y축 방향으로 길이 컨트롤러의 위치를 조정합니다. 그런 다음 프리즘 측면도를 사용하여 광섬유를 조사하고 광섬유가 챔버 바닥과 평행해질 때까지 Z축 방향으로 길이 컨트롤러의 위치를 조정합니다. 광섬유가 어떤 식으로든 손상된 경우 광섬유를 폐기하고 새 광섬유를 부착해야 합니다.

레이저를 켜고 레이저가 광섬유의 중심을 통과하도록 스테이지의 위치를 조정합니다. 그런 다음 대상 화면에서 회절된 빛의 원하는 간격이 관찰될 때까지 길이 컨트롤러 X축 마이크로미터 드라이버를 사용하여 광섬유의 장력을 높이거나 줄여 sarcomere 길이를 설정합니다. 최적의 sarcomere 길이를 설정한 후 가장 안쪽의 두 봉합사 사이의 거리를 측정합니다.

접안렌즈의 수직 십자선이 봉합사 내부 1과 0의 가장 안쪽 경계에 정렬되도록 챔버를 배치합니다. 마이크로미터 드라이브의 디지털 판독값은 접안렌즈의 수직 십자선이 가장 안쪽의 봉합사와 정렬될 때까지 현미경을 기준으로 x축을 따라 스테이지를 변환합니다. 디지털 디스플레이는 광섬유의 길이를 표시하고, 측정된 길이로 광섬유를 유지하고, 현미경 장착 카메라를 사용하여 상단 및 측면 모두에서 광섬유의 중앙 부분의 고배율 이미지를 캡처합니다.

이 이미지를 사용하여 섬유의 단면적을 계산하십시오. 챔버 제어 소프트웨어를 사용하여 광섬유를 사전 재활성화 용액이 포함된 챔버로 이동하고 3분 동안 배양합니다. 섬유가 비활성화 용액을 사용하는 동안 수동 장력을 측정 한 다음 섬유를 활성화 용액이 들어있는 챔버로 이동하고 급격한 상승이 선행되는 힘의 고원에 의해 입증 된 것처럼 최대 등척 력이 발생하도록합니다.

다음으로, 길이 컨트롤러를 사용하여 광섬유 부착 지점 사이의 거리를 빠르고 짧게 크게 줄인 다음 원래 길이로 빠르게 되돌아가 0에 해당하는 힘 변환기 출력을 식별합니다. 여기에 표시된 힘은 이러한 보기에서 타원형 모양의 파이버의 상단 및 측면 보기입니다. 단면적은 섬유의 길이를 따라 5개 지점에서 직경을 측정한 다음 5개의 결과 영역의 평균을 계산하여 결정되었습니다.

인간, 느리고 빠른 근육 섬유의 힘 추적은 이 비디오에 표시된 기술을 사용하여 빠른 섬유가 느린 섬유보다 더 높은 속도로 힘을 생성한다는 것을 보여줍니다. 인간 마우스 및 쥐 근육 섬유의 전형적인 특성을 측정하여 여기에 제시합니다. 표시된 범위는 25사분위수에서 75사분위수를 나타내고 N은 테스트된 섬유의 수입니다.

서로 다른 종들 사이에서 비력의 큰 차이를 주목하십시오. 여기에 설명된 절차는 길이, 힘, 힘 속도 및 힘을 포함한 골격근 생리학의 중요한 측면인 추가 중재를 추가하여 단일 골격근 섬유의 최대 고유 힘 생성 능력을 평가하는 결과를 낳습니다. 칼슘과의 관계를 밝힐 수 있습니다.