Name: 절연 골격근의 묘 - 기계 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-22T18:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: 학습하세요 생쥐 절연 골격근의 힘 생성 및 피로도 측정 방법을 통해 유전자 변형이나 치료 효과를 정량적으로 평가하는 기술입니다. 이 방법은 근육 질환 치료제 개발에 필수적인 근육 생물학 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 NHLBI에서 PEO에 대한 보건 서비스 그랜트 (HL086513) 및 재생 의료 (RC1 - 00104), NHLBI에서 보건 서비스 그랜트 (HL085377)의 캘리포니아 연구소에서 종합적인 연구 그랜트에 의해 지원하고 있던 선물 Pollin 재단 HSB로 SC는 샌프란 시스코 주립 대학에 세포 연구 수상 (TB1 - 01194) 줄기로 재생 의학의 교량에 대해 캘리포니아 공과 대학에 의해 지원되었다.

프로토콜은 UCSF 기관 애니멀 케어 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 수행합니다. 1. 마우스 신근 Digitorum의 Longus (편집 판단리스트) 근육의 해부 <ol><li> 기관 지침에 따라 모든 동물 절차를 수행합니다. </li><li> 근육 수확 10 ~ 직전 200 MG / kg intraperitoneal 자궁 / pentobarbital 전위와 동물을 안락사. 절개가 잘 근육이 안락사 15 분 이내에 수확하고 긴장 변환기에 장착할 수 있도록 연습해야합니다. </li><li> 절개 트레이와 트레이에 핀 다리에서 지육 부정사를 마련. </li><li> 발목의 해부 현미경, 오픈 피부 조심스럽게 열고 근막 (Fig.1A), 그리고 껍질 정강뼈에서 편집 판단리스트 (Fig.1B)를 노출하는 이상. 근육은 습한 및 수확 기간 동안 버퍼링 유지 lactated 링어의 솔루션의 방울을 사용합니다. </li><li> 각 끝에 가능한 한 많은 힘줄로 보존, 편집 판단리스트를 제거하고, lactated 링어의 솔루션을 포함하고있는 페트리 접시에 넣어. 근육 힘줄 (Fig.1C)의 각 치료를 묶어. 이것은 근육 섬유가 다친다거나 절개하는 동안 방해하지 않는 것이 중요합니다. </li></ol> 2. 근육 스트립​​ Myograph에서 마우스 편집 판단리스트의 마운팅 <ol><li> 이러한 연구는 조직 목욕은 그것이 지속적으로 산소와 일정한 온도에서 생리적 용액에 입욕 수있는 동안 그 근육을 보호해 필요합니다. 목욕은 근육의 긴장의 측정을위한 강제 변환기와 결합합니다. 우리는이 목적을 위해 덴마크어 묘 기술 (DMT 모델 820MS)에서 통합 근육 스트립​​ myograph 목욕을 사용합니다. 또한, 사각형 펄스 전기 자극기 (그라스 모델 S48) 및 데이터 수집 플랫폼 (ADInstruments PowerLab 데이터 수집 시스템 및 LabChart 소프트웨어) 각각 묘 - 기계적 반응을 기록 및 분석, 이끌어내는 필요합니다. DMT의 820MS는 근육 스트립​​의 중간 부분에 근육의 양쪽에 위치하고있는 챔버 커버 통합된 백금 전극을하고 있습니다. 기타 myographs는 전극 배치에 특정 관심을 요구할 수 있습니다. </li><li> 5 ML 크렙스 Henseleit 솔루션 11 myograph 욕조를 채우십시오. 25 ° C.에 따뜻한 사용하기 전에 15 분 동안 목욕을 통해 버블 O 2 / CO 2 (95 % / 5 %). </li><li> myograph의 클램프 사이의 편집 판단리스트를 확장하고 클램프 사이의 편집 판단리스트 근육의 힘줄 (Fig.1D, E)를 확보하기 봉합을 사용합니다. 근육 자체를 클램프하지 않도록주의하십시오. </li><li> 25 myograph 목욕을 유지 ° C. </li></ol> 3. 묘 - 기계 분석 A.의 트위치 장력 <ol><li> 어떤 근육 해이함 없다는 것을 그래서 목욕탕에 초기 길이를 설정합니다. </li><li> , 최대한 트위치 장력을 얻기 위해서는 전압을 조정하여 최대한의 자극 (기간 0.5 MS)를 결정 후 최대한 위에 20% (supramaximal 자극을 달성하기 위해)에서 자극을 설정합니다. 우리의 연구에서는 supramaximal 자극은 일반적으로 40 볼트의 출력에서​​ 얻을 수 있습니다. </li><li> 오실로 스코프를 사용하여 자극기의 출력을 확인합니다. </li><li> 트위치 장력에 더 이상의 증가가 없을 때까지 점차 근육을 스트레칭하여 최적의 길이를 결정합니다. </li><li> 근육 3 분 평형 수 있습니다. </li><li> supramaximal 광장 그라스 S44 전자 자극기를 사용하여 최적의 길이에서 자극 (0.5 MS) 및 레코드 출력을 제공합니다. </li><li> 기록 : 트위치 장력 곡선 (P T VS 시간, Fig.2A). </li></ol> B. 파상풍 긴장 <ol><li> 근육 3 분 동안 휴식을 허용합니다. </li><li> 그라스 S44 전자 자극기를 사용하여 최적의 길이는 150 Hz에서에서 300msec에 대한 supramaximal 자극의 기차, 레코드 출력을 적용합니다. </li><li> 기록 : 파상풍 장력 곡선 (P O VS 시간, Fig.2B). </li></ol> C. 강제 주파수 <ol><li> 근육 3 분 동안 휴식을 허용합니다. </li><li> 강제로 주파수 : 각 자극 (Fig.3) 사이 나머지 삼분 30, 60, 100, 140, 160 Hz에서에서 supramaximal 자극의 기차를 적용합니다. 또는, 기차는 15, 25, 35, 45, 55, 65, 75, 100, 140과 낮은 주파수에서 더 나은 해결을위한 160 Hz에서, 힘 변화가 실질적으로이 적용될 수 있습니다. </li><li> 플롯 : 강제로 주파수의 관계 (% 최대한의 힘 대 자극 주파수). </li></ol> D. 피로 <ol><li> 10 분 300 MS (또는 최대 무력의 50 %를 생산 조정 주파수), 매 3 초 동안 60 Hz에서 : 짧은 tetani의 기차를 적용합니다. 10 분, 파상풍의 힘은 초기 값 (Fig.4)의 ~ 15 %의 고원 수준으로 감소한다. </li><li> 플롯 : 저주파 피로 (% 최대한의 힘 대 시간). </li></ol> 프로토콜의 끝에 E. 추가 데이터 수집 <ol><li> myograph에서 근육을 마운트 해제하기 전에 musc 설정레 최적의 길이 III.A.4 단계에서 결정하고 현미경이나 캘리퍼스와 중 안구를 사용하여 직경을 측정 등. 단면적 (μm의 2)을 계산. </li><li> 봉합을 제거하고 근육 무게의 근육 질량 (MG) 측정. </li><li> 신체 질량 (GM)를 평가하기 위해 마우스의 무게를. </li></ol> 4. 계산 <ol><li> 근육 : 신체 질량 비율 = 근육 질량 / 몸 질량 </li><li> 트위치 장력, P T (MN) = 트위치 동안 생성된 최대 장력 </li><li> 특정 트위치 장력 (N / cm 2) = 트위치 장력 (MN) / 단면적 (μm의 2) X 10 5 N / MN • μm의 2 / cm 2 </li><li> 최대 장력 시간 (MS) = 최대 긴장으로 수축의 발병에서 시간 </li><li> 하프 휴식 시간 (MS) = 최대 장력에서 최대 장력의 50 % 시간 </li><li> 파상풍의 장력, P O (MN) = 파상풍 동안 생성된 최대 장력 </li><li> 특정 파상풍의 장력 (N / cm 2) = 파상풍의 장력 (MN) / 단면적 (μm의 2) X 10 5 N / MN • μm의 2 / cm 2 </li><li> 파상풍의 상승을 최대한 속도 (N / S) = 파상풍, 즉, 파상풍 텐션 곡선 (또는, DP O / DT)의 최대 경사의 장력 상승하는 동안 긴장 증가의 최대 속도 </li><li> 하프 휴식 파상풍의 장력 (MS) = 자극을 정지에서 자극의 종료에있는 긴장의 50 % 시간 </li><li> 트위치 긴장 - 투 - 파상풍의 장력 비율, P t / P O = 최대 트위치 장력 / 최대 파상풍 장력 </li><li> 피로 지수 = 최대한의 사시도 긴장하는 저주파 피로 두 분 동안 긴장의 비율 </li></ol> 5. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2582/2582fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 편집 판단리스트 근육의 해부. hindlimb muscles.TA, 정강뼈 앞쪽에. B, 편집 판단리스트 (신근 digitorum의 longus) 근육의 노출, 노출. C, 편집 판단리스트 힘줄을 봉합의 첨부 파일. D, 장력 변환기 욕조 (측면에서 볼.) E는 편집 판단리스트는 욕조에 마운트 (위보기에서). 의 근육은 불완전하게 설명의 목적을 위해 버퍼에 포장되어, 연습, 근육이 완전히 건조 방지하기 위해 열중한다. <img src="/files/ftp_upload/2582/2582fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 장력 곡선의 예. 최대한 트위치 장력 (P t), 수축 시간 (CT)과 반 휴식 시간 (HRT)을 설명하는 트위치 장력 곡선의, 예. 바, 1S. B, 최대한 파상풍의 긴장을 보여주는 파상풍의 장력 곡선 (P O)의 예과 하프 휴식 파상풍의 장력 (HRTT). 바, 1S. <img src="/files/ftp_upload/2582/2582fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 강제로 주파수 관계 분석의 예. 증분 자극 주파수에 의해 생성, 긴장. B, 30MHz에서 펄스 트레인의 예. 바, 80ms. C, 140MHz에서 펄스 트레인의 예. 바, 80ms. D, A에 표시된 데이터에서 파생된 강제로 주파수 곡선의 예. 강제로 주파수 곡선의 형태는 근육 강도의 특징이며, 다른 동물의 근육 사이에 비교할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2582/2582fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 저주파 피로 분석의 예. 지정된 시간 지점 (B, C, D)에서 펄스 트레인의 낮은 주파수 stimulation.Examples 기간 동안 생성, Decremental 긴장은. 아래와 같이 E, A에 표시된 데이터에서 파생된 저주파 피로 곡선의 예입니다. 저주파 피로 곡선의 형태는 근육 강도의 특징이며, 다른 동물의 근육 사이에 비교할 수 있습니다.

<ol><li>Harcourt, L. J., Schertzer, J. D., Ryall, J. G., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+dose+formoterol+administration+improves+muscle+function+in+dystrophic+mdx+mice+without+increasing+fatigue%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul+Disord%22%5BJournal%5D)">Low dose formoterol administration improves muscle function in dystrophic mdx mice without increasing fatigue.</a> Neuromuscul Disord. 17, 47-55 (2007).</li>
<li>Messina, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+overexpression+via+adeno-associated+virus+gene+transfer+promotes+skeletal+muscle+regeneration+and+enhances+muscle+function+in+mdx+mice%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">VEGF overexpression via adeno-associated virus gene transfer promotes skeletal muscle regeneration and enhances muscle function in mdx mice.</a> FASEB J. 21, 3737-3746 (2007).</li>
<li>Danieli-Betto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine+1-phosphate+protects+mouse+extensor+digitorum+longus+skeletal+muscle+during+fatigue%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Sphingosine 1-phosphate protects mouse extensor digitorum longus skeletal muscle during fatigue.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 288, C1367-C1373 (2005).</li>
<li>MacIntosh, B. R., Willis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force-frequency+relationship+and+potentiation+in+mammalian+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Force-frequency relationship and potentiation in mammalian skeletal muscle.</a> J Appl Physiol. 88, 2088-2096 (2000).</li>
<li>Hayes, A., Williams, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+properties+of+clenbuterol-treated+mdx+muscle+are+enhanced+by+low-intensity+swimming%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Contractile properties of clenbuterol-treated mdx muscle are enhanced by low-intensity swimming.</a> J Appl Physiol. 82, 435-439 (1997).</li>
<li>Coulton, G. R., Curtin, N. A., Morgan, J. E., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mdx+mouse+skeletal+muscle+myopathy%3A+II.+Contractile+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathol+Appl+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The mdx mouse skeletal muscle myopathy: II. Contractile properties.</a> Neuropathol Appl Neurobiol. 14, 299-314 (1988).</li>
<li>Danieli-Betto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+of+alpha-sarcoglycan+differently+affects+fast-+and+slow-twitch+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Deficiency of alpha-sarcoglycan differently affects fast- and slow-twitch skeletal muscles.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 289, R1328-R1337 (2005).</li>
<li>Chan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+for+speed%3A+contractile+properties+of+isolated+whole+EDL+muscle+from+an+alpha-actinin-3+knockout+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">A gene for speed: contractile properties of isolated whole EDL muscle from an alpha-actinin-3 knockout mouse.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 295, C897-C904 (2008).</li>
<li>Personius, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grip+force%2C+EDL+contractile+properties%2C+and+voluntary+wheel+running+after+postdevelopmental+myostatin+depletion+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl%22%5BJournal%5D)">Grip force, EDL contractile properties, and voluntary wheel running after postdevelopmental myostatin depletion in mice.</a> J Appl. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Donovan, J., Brown, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Euthanasia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Euthanasia.</a> Curr Protoc Immunol. Chap 1, (2006).</li>
<li>Beekley, M. D., Wetzel, P., Kubis, P., Gros, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+properties+of+skeletal+muscle+fibre+bundles+from+mice+deficient+in+carbonic+anhydrase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Contractile properties of skeletal muscle fibre bundles from mice deficient in carbonic anhydrase II.</a> Pflugers Arch. 452, 453-463 (2006).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 마우스 explanted hindlimb 근육의 묘 - 기계적 성질을 평가하기위한 상세한 방법을 설명합니다. 편집 판단리스트는 때문에 정강뼈 앞쪽에 근육 뒤쪽의 사후 위치의 해부하다 더 어려운 반면, 그 유명한 건의 첨부 파일 때문에 발목과 무릎 관절에 정강뼈 앞쪽이보다 평가하기가 쉽습니다. 이 인대는 근육 스트립​​ myograph에 장착 용이. 대조적으로,보다 쉽게 액세스할 정강뼈 앞쪽에은 예외적으로 어려운이 모두 근육을 손상시키지 않고 절개하다, 그리고 myograph에서 안전하게 탑재하고, 무릎 관절에서 광범위한 거의 atendinous 첨부 파일을했다. 우리는 또한 빠른 속도로 생리 버퍼와 온도의 산소 욕조에있는 근육을 장착하면 근육의 기계적 성질을 유지하기 위해 필수적이라는 지적. 우리는 이러한 조건 하에서 근육 응답에 상당한 변화없이 30 분이 분석을 반복할 수 것으로 나타났습니다. 마지막으로, 이것이 근육 기능에 악영향을 가지고 있고, 묘 - 기계의 힘을 싼 견적이 발생할 수있는 근육 섬유의 해부 및 장착 절차 동안 접촉하지 않는 것이 중요합니다. 다음 절차에 따라,이 분석은 근육 기능 6,7,8,9에 유전자 조작의 효과뿐만 아니라 근육 질환 1,2,3,5의 마우스 모델에서 치료 중재 사이의 비교 평가하기 위해 강력한 양적 접근 방식을 제공합니다 .

솔루션 및 미디어 Lactated 링어의 솔루션 <ul><li> 100 MM NaCl </li><li> 30 MM CH3CH (OH) 쿠나 (락트 산 나트륨) </li><li> 4 MM KCl </li><li> 1 ㎜ CaCl 2 2 시간이 O (염화칼슘 이수화물) <ul><li> 6.75로 산도를 조절 </li></ul></li></ul> 크렙스 Henseleit 솔루션 <ul><li> 118 MM NaCl </li><li> 4.7 MM KCl </li><li> 1.25 MM CaCl 2 </li><li> 1.2 MM MgCl 2 </li><li> 1.2 MM KH 2 PO 4 </li><li> 25 MM NaHCO 3 </li><li> 11 MM 포도당 <ul><li> O 2 / CO 2 (95 % / 5 %) 가스 equilibrating하여 7.2-7.4로 산도를 조절 </li></ul></li></ul> Pentobarbital <ul><li> 멸균 물 5 MG / ML 작업 솔루션 </li></ul>

절연 골격근의 묘 - 기계 분석

Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle

근육 질환 1,2,3의 치료를위한 치료 개입의 생체내 효과에 평가하기 위해 양적 방법이 필요합니다 그 치료 근육의 힘 생성 및 fatigability 측정. 우리는 마우스에서 신선한 explanted hindlimb 근육의 묘 - 기계적 성질을 평가하기위한 상세한 방법을 설명합니다. 를 사용하고, 최대한의 트위치와 파상풍의 긴장, 수축 시간 및 반 휴식 시간의 측정, 우리는 근육 스트립 myograph (덴마크어 묘 기술 모델 820MS)의 근육을 장착, 마우스 신근 digitorum의 longus 근육의 atraumatic 수확을 설명 사각형 펄스 자극기 (모델 S48, 그라스 기술). 이러한 측정을 사용하여, 우리는 근육 단면적, 트위치 - - 파상풍에 장력 비율 힘을 주파수 관계 곡선과 낮은 주파수 피로 곡선 4 정규화 특정 트위치 및 파상풍 긴장의 계산을 보여줍니다. 이 분석은 치료 근육 질환 1,2,3,5의 마우스 모델에서 중재뿐만 아니라, 근육의 기능 6,7,8,9에 유전자 조작의 효과 비교 사이의 양적 비교하는 방법을 제공합니다.

을 평가하기 위해<em&gt; 생체내에</em근육 질환에 대한 치료 개입의&gt; 효과, 치료 방법은 근육의 힘 생성 및 fatigability을 quantitate 필요합니다. 우리는 세부 explanted 마우스 hindlimb 근육의 묘 - 기계적 성질을 평가하는 방법을. 이 분석은 유전자 근육 기능에 수정뿐만 아니라 근육 질환의 마우스 모델 요법의 비교의 효과를 quantitating하는 강력한 방법을 제공합니다.

근육 질환 치료를 위한 치료적 개입의 체내(in vivo) 효과를 평가하기 위해서는, 힘을 측정하는 정량적 방법이 필요합니다...

본 절차의 목적은 유전적 변형 또는 치료의 효과를 정량화하는 방법으로서, 분리된 골격근의 생성 힘과 피로도를 측정하는 것입니다. 먼저, 생쥐의 뒷다리에서 지신근(extensor digitorum longus)을 절제합니다. 그 후, 해당 근육을 근육 스트립 측정 장치(muscle strip myo)에 장착합니다.다음 단계는 최대 수축 장력이 달성되는 근육의 자극 전압과 예비 긴장도를 확인하는 것입니다. 마지막 단계는 근육의 힘-주파수 관계와 더불어 저주파에서 강직성 자극에 따른 피로의 시작 및 정도를 결정하는 것입니다. 결과적으로, 근전도 검사를 통해 근육의 기계적 특성에서 측정 가능한 변화를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.운동 부하 검사와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 근전도 검사를 통해 근력과 근 기능을 정량적으로 평가할 수 있다는 점입니다. 저희는 근육 질환에 대한 새로운 세포 및 바이오공학 기반 치료법을 전임상 동물 모델에서 테스트할 때 근 기능을 평가하기 위한 정량적 측정 지표가 필요하다는 점을 깨닫고 이 방법을 처음으로 도입했습니다. 이 방법은 특정 치료법이나 유전자 변형이 근 기능을 변화시키는지 여부와 같이 근육 생물학 및 근이영양증 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.근육을 적절하게 다루는 데 필요한 단계들을 숙달하기 어렵기 때문에 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 개인들은 빠르게 손상을 입히지 않고 뒷다리 근육을 해부하는 과정이 연습과 숙련된 기술을 요하므로 어려움을 겪을 것입니다. 본 절차의 시연은 우리 실험실의 연구원과 대학원생이 진행할 것입니다.마우스를 안락사시킨 후, 사체의 복측이 위로 향하게 해부 트레이에 배치하고 해부 현미경 하에서 다리를 트레이에 핀으로 고정합니다. 피부를 절개하고 근막을 조심스럽게 엽니다. 다음으로, 전경골근을 발목부터 위쪽으로 벗겨내어 장지신근(extensor digitorum longus) 또는 EDL 근육을 노출시킵니다.채취 과정 동안 근육이 건조해지지 않도록 젖산 링거액을 소량씩 떨어뜨려 줍니다. 그런 다음 양 끝의 힘줄을 최대한 보존하면서 EDL을 분리해 내되, EDL 근섬유 자체를 건드리지 않도록 주의하십시오. 분리한 EDL 근육을 젖산 링거액이 담긴 페트리 접시에 넣습니다.이제 각 근육 힘줄에 봉합사를 묶습니다. 본 연구에서는 조직 배스(tissue bath)를 사용하여 근육을 고정하고, 힘 변환기(force transducer)를 사용하여 근육의 장력을 측정합니다. 또한, 정방형 펄스 전기 자극기와 데이터 수집 플랫폼을 사용하여 기계적 반응을 유도, 기록 및 분석합니다.다음 단계는 근이식 배양액 조에 6.5 milliliters의 Krebs-Henseleit 용액을 채우는 것입니다. 배양액 조를 25 °C로 가온하고, 95% oxygen과 5% carbon dioxide 혼합 가스를 사용하여 Krebs 용액을 15분 동안 버블링합니다. 건에 봉합사를 사용하여 EDL 근육을 배양액 조로 옮깁니다.마이오 그라프트(myo graft) 클램프 사이에 힘줄을 고정합니다. 이때 근육 자체가 클램프에 물리지 않도록 주의하십시오. 마이오 그라프트 배스(bath)의 온도를 25°C로 유지합니다.장력 분석을 시작하려면 초기 근육 길이를 inci 근육 길이와 동일하게 조정하십시오. 자극 지속 시간은 0.5 milliseconds로 설정합니다. 전압을 점진적으로 높여 최대 수축 장력을 얻는 데 필요한 자극량을 결정하십시오.그런 다음 자극 세기를 20% 더 높여 일반적으로 약 40 volts 정도인 초최대 자극(supra maximal stimulus)을 가합니다. 다음 단계는 수축 장력이 더 이상 증가하지 않을 때까지 근육을 점진적으로 신장시키는 것입니다. 이 길이를 최적 근육 길이로 간주합니다.근육을 3분 동안 평형 상태로 둔 다음, 근육을 최적 길이로 유지하십시오. 초최대 제곱 자극을 가하고 출력값인 수축 장력 곡선을 기록하십시오. 이 그림에서.최대 수축 장력은 pt로 표시합니다. 수축 시간은 ct로 표시합니다. 반이완 시간은 HRT로 표시합니다.바는 3분간의 휴식기 이후의 1초를 나타냅니다. 최적 길이에서 150 hertz로 300 milliseconds 동안 초최대 자극의 변형을 가하여 강직 장력을 측정하십시오. 이 절차를 통해 강직 장력 곡선이 생성됩니다.최대 타이타닉 장력은 po로 표시합니다. 반-이완 타이타닉 장력은 HRTT로 표시합니다. 막대는 3분간의 휴식 기간 후 1초를 나타냅니다.30, 60, 100, 140 및 160 Hz에서 300밀리초 동안 초최대 자극 열을 가하여 힘-주파수 분석을 시작하십시오. 3분간의 휴식 기간을 가진 후, 각 자극 열 사이에 3분간의 휴식 시간을 둡니다. 10분 동안 3초마다 60 Hz의 짧은 자극 열을 300밀리초 동안 가하여 피로 분석을 시작하십시오.Tetanic force는 초기 값의 약 15% 수준의 plateau 단계까지 감소해야 합니다. 근육을 최적 길이(optimal length)로 둔 상태에서 force 기록을 마친 후, 현미경의 ocular를 사용하여 근육 직경을 측정하십시오. 그 다음, 봉합사를 제거하고 근육의 무게를 측정하여 근육 질량을 결정합니다.마지막 단계는 체질량을 평가하기 위해 마우스의 무게를 측정하는 것입니다. 이 측정값은 동반된 논문에 기재된 계산식에 사용됩니다. 이 그림은 제시된 자극 빈도가 증가함에 따라 생성되는 장력의 증가를 보여줍니다.30Hz의 펄스 트레인에 대한 근육의 반응입니다. 이 그림은 140Hz의 펄스 트레인에서 더 큰 힘이 유도됨을 보여줍니다. 이 그래프는 최대 힘의 백분율 대 자극 빈도로 도식화한 힘-빈도 관계를 나타냅니다.힘-주파수 곡선의 형태는 근력의 특징을 나타내며, 서로 다른 동물의 근육 간 비교를 위해 사용될 수 있습니다. 이 그림은 10분 동안의 저주파 자극 과정에서 나타나는 근육 피로도를 보여줍니다. 이 그림들은 표시된 시점에서의 자극 열에 대한 근육의 반응을 보여줍니다.이 그래프는 저주파 근피로도를 최대 힘의 백분율(%)과 시간의 관계로 나타냅니다. 저주파 피로 곡선의 형태는 근력의 특성을 보여주며, 서로 다른 동물의 근육 간 비교에 활용될 수 있습니다. 본 절차를 숙달하면 이 기술을 30분 이내에 수행할 수 있습니다.이 절차를 수행하는 동안 처리된 근육에서 특정 근성 단백질과 줄기세포 마커가 발현되고 있는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 면역조직화학, 웨스턴 블롯, 정량적 PCR과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 근육 채취와 분석 사이의 시간을 최소화하기 위해 모든 장비를 미리 준비해 두는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청한 후에는 근육 뒷다리를 해부하고, Danish Myo Technology에서 제공하는 것과 같은 근육 스트립 마이오(muscle strip myo)에 근육을 장착하며, 기계적 특성의 변화를 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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야생형 마우스와 돌연변이 마우스의 개별 심근세포는 수축성과 칼슘 과도 상태를 연구하기 위해 심장에서 분리할 수 있습니다. 이를 통해 모든 원인에서 심장 기능 장애에 대한 세포 기능 장애의 기여도를 특성화할 수 있습니다.

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여기에 제시 나노 뉴턴 해상도와 스트라이드 근육 myofibrils의 수축 특성을 평가하는 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 간섭 계기반 광학 힘 프로브를 사용하여 설정을 사용합니다. 이 설정은 높은 신호 대 잡음 비율로 데이터를 생성하고 myofibrils의 수축 운동의 평가를 가능하게합니다.

골격 근육 생검에서 Myofibrils를 분리하고 나노 뉴턴 해상도 포스 트랜스듀서로 수축 기능을 결정합니다.

이 기술 보고서는 섬유 손상을 제한하는 근육 티비알리스 전방의 생검을 위한 수정된 Bergström 기술의 변형을 설명합니다.

기계적 평가를 위한 인간 근육 티비아리스 전방의 우수한 구획에서 골격 근육 생검 의 컬렉션

골격근 기능은 전통적으로 힘들고 처리량이 적은 접근법을 사용하여 분리된 근육 섬유의 수축성을 정량화하여 평가할 수 있습니다. 여기에서는 하이드로겔에 내장된 근육 섬유의 수축성을 정량화하기 위한 광학 기반의 고처리량 방법을 설명합니다. 이 접근법은 약물 스크리닝 및 치료제 개발에 적용됩니다.

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우리는 성인 마우스의 6개 근육에서 다양한 길이와 유형의 효소로 해리된 섬유를 얻기 위한 프로토콜을 설명합니다: 그 중 3개는 이미 설명되었고(flexor digitorum brevis, extensor digitorum longus, soleus) 그 중 3개는 처음으로 성공적으로 해리되었습니다(extensor hallucis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).

생쥐의 6개 뒷다리 근육의 효소 해리로 얻은 온전한 짧은, 중간 및 긴 골격근 섬유: Beyond Flexor Digitorum Brevis

이 프로토콜은 산화성 가자형상근에서 온전한 단일 근섬유를 분리하고, 이 섬유에서 유래한 고정제된 근모아 배양을 구축하는 과정을 설명합니다. 최적화된 절차는 마우스당 약 300–500개의 온전한 근섬유를 신뢰성 있게 얻어 하위 분자 및 세포 분석을 가능하게 합니다.

산화성 근섬유 거동 평가를 위한 단일 섬유 분리 분석

학습하세요 생쥐 절연 골격근의 힘 생성 및 피로도 측정 방법을 통해 유전자 변형이나 치료 효과를 정량적으로 평가하는 기술입니다. 이 방법은 근육 질환 치료제 개발에 필수적인 근육 생물학 연구에 활용됩니다.

절연 골격근의 묘 - 기계 분석

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