Colocalizational 분석에 의한 수용체 후 국제화 인신 매매에 약물 유발의 이동을 추적

다음 실험의 전반적인 목표는 표적 쌍의 공간적 공국소화(colocalization)를 정량적으로 평가하는 것이며, 본 실험에서는 약물로 유도된 수용체 트래픽킹을 조사합니다. 이는 배양된 살아있는 세포에 약물을 처리하여 수용체 트래픽킹의 변화를 유도함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계로, 표적 수용체와 세포 내 트래픽킹 구획에 대한 이중 면역 라벨링을 수행한 후, 다채널 공초점 현미경을 통해 표적 쌍의 공간적 위치를 확인합니다.

정량적 공국소화 분석은 표적 수용체와 구획이 동일한 위치에서 발견되는 경향을 측정하는 데 사용됩니다. 분석 결과는 수용체와 세포 내 수송 구획의 공국소화를 바탕으로, 약물 처리 후 수용체 수송의 변화를 보여줍니다. 오버레이 공국소화와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 공국소화의 정량적 측정값을 제공한다는 것이며, 이를 통해 훨씬 더 강력한 분석과 복잡한 실험 설계가 가능해집니다.

이 방법은 수용체 트래피킹(trafficking)에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 배양 세포 내 거의 모든 두 단백질의 공간적 공국소화(colocalization) 변화 연구에도 적용될 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면, 기존의 배양액을 제거하고 선택한 농도의 해당 약물이 포함된 배양액으로 교체하십시오. 다음으로, 선택한 처리 시간 동안 기존 배양 조건에서 세포를 배양하십시오.

배양 후, 세척 버퍼 1 mL를 사용하여 세포를 3회 부드럽게 세척합니다. 37 °C에서 0.1 M PBS에 희석된 4% paraformaldehyde 300 µL로 세포를 10분 동안 고정합니다. 그 다음, 세척 버퍼 1 mL를 사용하여 세포를 다시 3회 세척합니다.

이어서, 세포를 300 µL의 블로킹 버퍼(blocking buffer)에 넣고 상온에서 2시간 동안 배양합니다. 그 후, 300 µL의 항체 희석액에 희석한 1차 항체를 처리하여 4 °C에서 48시간 동안 배양합니다. 그다음 세척 버퍼(washing buffer) 1 mL를 사용하여 세포를 3회 부드럽게 세척합니다.

다음으로, 형광 물질이 결합된 2차 항체를 300 µL의 항체 희석액에 넣어 세포와 함께 실온에서 1시간 동안 배양하며, 이때 세포가 빛에 노출되지 않도록 차단합니다. 1시간 후, 1 mL의 세척 버퍼를 사용하여 세포를 3회 부드럽게 세척합니다. 24웰 플레이트에서 커버슬립을 제거하려면 플레이트를 45도 각도로 기울여 잡습니다.

미세 핀셋의 끝을 커버슬립이 웰 바닥과 맞닿는 상단 가장자리에 놓습니다. 그런 다음 세척 버퍼 내에서 커버슬립을 웰 바닥 반대 방향으로 조심스럽게 기울입니다. 커버슬립이 웰 벽면에 기대어 멈추면 핀셋으로 쉽게 제거할 수 있습니다.

그 다음, 100배 고배율 대물렌즈를 사용하여 세포가 아래를 향하도록 항퇴색 마운팅 용액을 이용해 커버슬립을 현미경 슬라이드에 마운팅합니다. 먼저, 에피 형광(epi fluorescence)을 사용하여 이미징할 대표 세포를 찾습니다. 다음으로, 이미지 캡처 설정을 구성합니다. 각 채널을 순차적으로 이미징하고 최종 이미지에 대해 4~6회의 스캔을 평균화하기 위해, 각 표지 채널의 8비트 비압축 tiff 이미지를 기록합니다.

그 다음 공초점 이미징 경로로 전환하고 세포 중심을 통과하는 Z 평면에 초점을 맞춥니다. 각 채널에 대해 핀홀, 레이저 출력, 광전증배관(photo multiplier tube) 전압 및 오프셋을 최적화합니다. 이 설정값들을 기록하고, 주어진 표적 쌍으로 라벨링된 모든 세포를 이미징할 때 동일한 설정을 사용하십시오.

동일한 반복 실험군에서 고배율 대물렌즈로 촬영할 로케이터 세포를 찾습니다. 에피 형광(epi fluorescence)을 사용하여 공초점 이미징 경로로 전환하고, 가능하다면 세포 중심을 지나는 Z 평면에 초점을 맞춥니다. 소프트웨어의 줌 크롭(zoom crop) 기능을 사용하여 스캔 영역을 관심 세포로 제한합니다. 그 후.

이전에 설정한 세팅을 사용하여 각 라벨링된 채널의 이미지를 캡처하고, 충분한 샘플 수집을 위해 조건당 반복당 15개 이상의 세포를 이미지화하는 절차를 반복하십시오. 이 과정에서 Image J를 사용하여 세포의 이미지 한 쌍을 엽니다. image color merge channels 명령을 사용하여 RGB 이미지를 생성하십시오.

그런 다음 관심 있는 세포의 외곽선을 그립니다. ImageJ 플러그인인 SC colocalization을 사용하여 선택한 세포 내 표적들의 공국소화(colocalization) 정도를 정량화합니다. 원하는 공국소화 측정값을 기록하고, 각 이미지의 세포에 대해 이 절차를 반복합니다.

다음으로, 각 표지 조건의 각 반복 실험 내 공통 대조군 조건에서 기록된 공국소화 값의 평균을 계산합니다. 이 평균값에 -1을 곱하여 각 표지 조건의 각 반복 실험에 대한 오프셋을 산출합니다. 그런 다음, 각 표지 조건의 각 반복 실험에 있는 모든 공국소화 값에 해당 오프셋을 더합니다.

이렇게 하면 각 표지 조건의 각 반복 실험에서 공통 대조군 조건의 평균 공국소화 측정값이 0이 되도록 데이터가 정규화됩니다. 그 후, 각 표지 조건의 모든 반복 실험에서 얻은 모든 데이터를 통해 반복 실험 간의 공국소화 변화를 분석할 수 있습니다. 여기에는 장기 및 급성 약물 처리에 노출된 후근 신경절 감각 뉴런의 일차 배양 세포가 나타나 있습니다. 이후 델타 오피오이드 수용체와 재순환 엔도좀 마커에 대해 서로 다른 1차 및 2차 항체 쌍을 사용하여 면역 표지를 수행하였으며, 2채널 순차 공초점 현미경으로 이미지를 촬영하였습니다.

후속적인 정량적 공국소화(colocalization) 및 분석 외에도, 여기에서는 이러한 대표 이미지들을 처리하여 가색 공국소화 맵을 생성하였습니다. delta-opioid 수용체와 초기 엔도좀, 재활용 엔도좀 및 리소좀 마커의 수용체 공국소화 평균 점수를 서로 다른 급성 약물 처리를 받은 그룹 간에 비교하여, 약물로 인해 유도된 수용체 트래픽킹의 변화를 관찰합니다. 이 절차를 수행할 때는 유효한 정량 분석이 가능하도록 고품질의 일관된 현미경 사진을 획득하는 것이 중요합니다.

이 영상을 시청한 후에는 정량적 공국소화 분석을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.