Colocalizational 분석에 의한 수용체 후 국제화 인신 매매에 약물 유발의 이동을 추적

다음 실험의 전반적인 목표는 표적 쌍의 공간적 공동 국소화를 정량적으로 평가하는 것이며, 이 경우 약물 유도 수용체 이동을 조사합니다. 이는 살아있는 배양된 세포를 약물로 처리하여 변형된 수용체 이동을 유도함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 표적 수용체와 세포 내 트래픽 구획의 이중 면역 라벨링을 통해 다채널 컨포칼 현미경 검사를 통해 표적 쌍의 공간적 국소화를 수행할 수 있습니다.

정량적 공동 국소화 분석은 표적 수용체와 구획이 같은 장소에서 발견되는 경향을 측정하는 데 사용됩니다. 그 결과, 수용체와 세포 내 수송 구획의 공동 국소화에 기초한 약물 치료 후 수용체 이동의 변화를 보여줍니다. 오버레이 공동 국소화(overlay colocalization)와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 공동 국소화에 대한 정량화된 측정을 제공하여 훨씬 더 강력한 분석과 복잡한 실험 설계를 가능하게 한다는 것입니다.

이 방법은 수용체 이동에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 배양된 세포에서 거의 두 단백질의 공간 공동 국소화(spatial colocalization)의 변화에도 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 원래 성장 배지를 제거하고 선택한 농도에서 관심 약물을 함유한 배지로 교체하십시오. 다음으로, 선택한 처리 기간 동안 원래 성장 조건으로 세포를 배양합니다.

배양 후 1ml의 세척 버퍼로 세포를 3회 세척합니다. 섭씨 37도에서 10분 동안 0.1몰 PBS에 4%파라 포름알데히드 300마이크로리터로 세포를 고정합니다. 그런 다음 1ml의 세척 버퍼로 세포를 다시 씻으십시오.

그 후, 실온에서 2시간 동안 300마이크로리터의 차단 버퍼에 세포를 배양합니다. 그 후, 1차 항체가 있는 세포를 300마이크로리터의 항체 희석제에 넣고 섭씨 4도에서 48시간 동안 배양합니다. 그런 다음 매번 3회 1ml의 세척 버퍼로 세포를 부드럽게 씻습니다.

다음으로, Fluor에 접합된 2차 항체가 있는 세포를 300마이크로리터의 항체 희석액에 1시간 실온에서 배양하고 빛으로부터 세포를 보호합니다. 1시간 후, 1ml의 세척 버퍼로 세포를 3회 부드럽게 세척합니다. 24웰 플레이트에서 커버 슬립을 제거하려면 플레이트를 45도로 잡습니다.

한 쌍의 미세한 집게의 끝을 덮개 슬립의 상단 가장자리에 놓고 우물 바닥과 만나는 곳에 놓습니다. 그런 다음 세탁 버퍼의 덮개 슬립을 우물 바닥에서 멀리 부드럽게 기울입니다. 커버 슬립은 집게로 쉽게 제거할 수 있는 우물 벽에 닿게 됩니다.

그런 다음 100배 고배율 대물렌즈를 사용하여 페이딩 방지 장착 매체가 있는 현미경 슬라이드에 세포가 아래를 향하도록 커버 슬립을 장착합니다. 먼저, epi fluorescence를 사용하여 이미징할 대표 세포를 찾습니다. 다음으로, 이미지 캡처 설정을 구성합니다: 레이블이 지정된 각 채널의 8비트 비압축 tiff 이미지를 기록하여 각 채널을 순차적으로 이미지화하고 최종 이미지에 대해 평균 4-6개의 스캔을 수행합니다.

그런 다음 컨포칼 이미징 경로로 전환하고 세포 중심을 통과하는 Z 평면에 초점을 맞춥니다. 각 채널에 대한 핀홀 레이저 출력과 광 증배, 튜브 전압 및 오프셋을 최적화합니다. 이러한 설정을 기록하고 지정된 타겟 쌍에 대해 레이블이 지정된 모든 셀을 이미징하는 데 동일한 설정을 사용합니다.

동일한 Replicate next locator 세포에서 고배율 대물렌즈로 이미징합니다. epi fluorescence를 사용하여 컨포칼 이미징 경로로 전환하고 가능한 경우 세포 중심을 통과하는 Z 평면에 초점을 맞춥니다. 소프트웨어 확대/축소 자르기 기능을 사용하여 스캔 영역을 관심 셀로 제한합니다. 나중.

이전에 설정된 설정을 사용하여 라벨링된 각 채널에 대한 이미지를 캡처하고 절차를 반복하여 복제당 조건당 15개 이상의 세포를 이미지화합니다. 충분한 샘플 채취를 보장합니다. 이 절차에서는 이미지 J에서 셀의 이미지 쌍을 엽니다.이미지 색상 병합 채널 명령을 사용하여 RGB 이미지를 생성합니다.

그런 다음 관심 있는 셀 주위를 그립니다. SC colocalization인 image j 플러그인을 사용하여 선택한 세포에서 표적의 colocalization을 정량화합니다. 원하는 colocalization 측정을 기록하고 각 이미지 셀에 대해 절차를 반복합니다.

다음으로, 각 라벨링 조건의 각 반복실험에 대한 공통 제어 조건의 기록된 공동 국소화 값의 평균을 계산합니다. 평균에 마이너스 1을 곱하여 각 라벨링 조건에서 각 반복실험에 대한 오프셋을 산출합니다. 그런 다음 각 라벨링 조건의 각 반복실험에 대한 오프셋을 해당 반복의 각 공동 국소화 값에 추가합니다.

이렇게 하면 공통 제어 조건에 대한 평균 공동 국소화 측정값이 각 라벨링 조건의 각 반복에서 0이 되도록 데이터를 정규화합니다. 그 후, 각 라벨링 조건의 모든 반복에서 얻은 모든 데이터를 통해 복제물 전반에 걸친 공동 국소화의 변화를 분석할 수 있습니다.여기에 표시된 것은 장기간의 급성 약물 치료에 노출된 배근 신경절 감각 뉴런의 1차 배양입니다. 그런 다음 세포를 델타 오피오이드 수용체와 뚜렷한 1차 2차 항체 쌍을 가진 재활용 엔도솜 마커에 대한 면역 표지하고 2채널 순차 컨포칼 현미경으로 이미지화했습니다.

후속 정량적 공동 국소화 및 분석 외에도 이러한 대표 이미지는 여기에 표시된 잘못된 색상 공동 국소화 맵을 생성하기 위해 처리되었습니다. 델타 오피오이드 수용체에 대한 평균 공동 국소화 점수와 초기 엔도솜 재활용 엔도솜 및 리소솜 수용체의 마커, 각 구획과 함께 수용체 공동 국소화를 서로 다른 급성 약물 치료를 받는 그룹 간에 비교하고 수용체 이동에서 약물 유도 변화가 관찰됩니다. 이 절차를 시도하는 동안 유효한 정량 분석을 허용하기 위해 고품질의 일관된 현미경 사진을 획득하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 동영상을 시청한 후에는 정량적 공동국소화 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.