16S rRNA의 타겟팅 디곡신 표지 DNA 프로브를 사용하여 파라핀 조직 내에서 박테리아의 제자리 검출

이 절차의 전반적인 목표는 DNA 프로브를 표적으로 하는 DIG 표지 16 s 리보솜, RNA를 사용하여 파라핀 내장 조직 내 박테리아를 국소화하는 것입니다. 이는 먼저 PCR 증폭 및 DIG 라벨링으로 프로브를 준비함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 조직 절편이 표적 부위에 더 쉽게 접근할 수 있고 배경 결합이 적도록 준비하는 것입니다.

다음으로, 준비된 조직 절편을 발굴 표지된 프로브와 혼성화합니다. 마지막으로, 혼성화된 프로브는 anti-D dig 항체로 표시된 알칼리성 인산가수분해효소로 검출됩니다. 궁극적으로, C 2 혼성화 방법에서 이것은 파라핀 내장 조직을 가진 박테리아의 존재를 보여줄 수 있습니다.

ING와 같은 기존 방법에 비해 이 검출의 도메인 이점은 이 방법이 일부 조직학적 구조의 맥락에서 박테리아 SHS를 검출할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 발병 기전에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 치주염 및 R 행성과 같은 다양한 염증을 유발할 수 있습니다. 이 방법의 시각적 시연은 조직 절편이 쉽게 손상되기 때문에 조직 준비 및 하이브리드 소화 단계를 실행하기가 어렵기 때문에 매우 중요합니다.

U 박테리아 조사에 70의 기본적인 쌍, 템플렛 및 PCR에 의하여 조사를 증폭하기 위하여 2개의 15의 기본적인 쌍 뇌관으로 DNA 파편을 이용하. 알려진 농도의 완충액에 앰플리콘을 수집합니다. 그런 다음 dig DNA 라벨링 및 검출 키트로 프로브에 라벨을 붙입니다.

먼저 3마이크로그램의 프로브를 15마이크로리터의 물에 섞습니다. 섭씨 10도에서 95분 동안 열 블록의 프로브를 변성시킵니다. 그런 다음 변성된 프로브를 얼음 위에 놓습니다.

다음으로, 10 XH 뉴클레오티드 2 마이크로 리터, DN NTP 2 마이크로 리터 및 이관 효소 1 마이크로 리터를 추가합니다. 혼합이 완료되면 프로브를 섭씨 37도에서 24-48시간 동안 배양합니다. 혼합물을 섭씨 65도로 가열하여 반응을 중지하십시오.

그런 다음 260나노미터에서 라벨링된 프로브의 DNA 농도를 측정하고 농도를 마이크로리터당 100나노그램으로 조정합니다. 키트를 사용하여 먼저 1마이크로리터의 직렬 희석된 포지티브 대조군을 로드하는 나일론 멤브레인에 대한 프로브 감도를 확인합니다. 프로브 및 파기 라벨링 프로브.

멤브레인을 5분 동안 건조시킵니다. 건조되면 멤브레인을 두 개의 XSSC에 잠시 담근 다음 섭씨 80도의 인큐베이터로 한 시간 동안 옮깁니다. 외피 후에 DNA를 고정시키기 위하여는, maleic 산성 완충액에 있는 막을 짧게 적시고십시오, 그 후에 1개에서 5개에 AP에 의하여 활용된 항체로 집중된 막는 완충액에 그것을 옮기십시오, 30분 후에 000 희석

MABT에서 멤브레인을 세척합니다. 그런 다음 40마이크로리터의 N-B-T-B-C-I-P를 2ml의 검출 버퍼에 혼합합니다. 목욕 후,이 혼합물을 1 분 동안 멤브레인에 첨가하십시오.

파라핀을 제거하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 조직 단면을 재수화한 후, C 2 혼성화를 위해 먼저 슬라이드를 0.1 일반 염산에 20분 동안 담그십시오. 산성 목욕 후 DEPC 처리된 물로 슬라이드를 30초 동안 씻어냅니다. 그런 다음 왁스 펜을 사용하여 각 슬라이드의 표본을 간략하게 설명합니다.

다음으로, 크기에 따라 50-400 마이크로리터의 proteinase K 용액을 검체에 추가합니다. 효소가 섭씨 37도에서 30분 동안 작동하도록 한 다음 DEPC 처리된 XPBS 1개에서 슬라이드를 1분 동안 세척합니다. 이제 슬라이드를 DEPC 처리된 PBS의 4% 파라폼 알데히드로 10분 동안 옮깁니다.

이전과 같이 PBS로 고정액을 씻어냅니다. 그런 다음 20 분 후에 0.5 % 아세트산 및 수소화물로 pH 8에서 0.1 몰 트리에탄올 아민 염산염으로 슬라이드를 목욕시키고 이전과 같이 깨끗한 물로 슬라이드를 씻어냅니다. 이제 먼저 20 분 동안 두 개의 XSSC에 슬라이드를 담그는 것으로 C two에서 시작하십시오.

한편, negative control을 위해 labeled probe를 hybridization buffer에서 microliter 당 1nanogram으로 희석합니다. 레이블이 지정되지 않은 프로브 프로브 농도의 10배를 사용합니다. 그런 다음 프로브를 섭씨 90도에서 10분 동안 가열한 다음 얼음에서 빠르게 냉각하여 프로브를 변성시킵니다.

다음으로, 이전에 적용된 proteinase K와 동일한 부피의 프로브 희석액을 각 슬라이드에 적용합니다. 그런 다음 매니큐어를 사용하여 미끄러짐 및 밀봉 부분을 조심스럽게 덮습니다. 이제 PCR 기계 블록의 슬라이드를 섭씨 90도에서 10분 동안 가열하고 다음날 밤새 섭씨 45도의 가습 인큐베이터로 옮깁니다.

슬라이드를 섭씨 4도에서 30분 동안 식힌 다음 커버 슬립을 조심스럽게 제거합니다. 조직은 연약합니다. 마지막으로, 실온에서 일련의 SSC 버퍼를 통해 슬라이드를 통과시킵니다.

먼저 NC 2개의 하이브리드 슬라이드를 MABT에서 5분 동안 세척합니다. 그런 다음 50-400 마이크로 리터의 차단 용액을 1 % 트윈 20 분 동안 20 분에 도포합니다. 블록 배양 후 50-400 마이크로 리터의 1-1000 anti-D dig 알칼리 인산가수분해효소 항체 및 차단 용액을 도포합니다.

1차 도포를 적용한 후 섭씨 37도에서 90분 동안 바인딩합니다. MABT에서 10분 동안 슬라이드를 세척합니다. 그런 다음 5분 동안 슬라이드를 1%tween 20으로 감지 버퍼에 넣습니다.

이제 50-400 마이크로 리터의 검출 버퍼 용액 1 밀리 몰 올레를 각 슬라이드에 적용하고 5 분 동안 배양하여 내인성 알칼리성 인산 분해 효소를 비활성화합니다. 다음으로, 검출 시 희석된 N-B-T-B-C-I-P 50-400마이크로리터를 추가합니다. 각 슬라이드에 1-100개씩 버퍼링하고 경험에 따라 가습된 챔버에서 슬라이드를 2-3시간 동안 배양합니다.

DI 물로 슬라이드를 헹구고 메틸 그린을 부피 기준 0.05%weight로 바르고 10분 동안 조직에 반대 얼룩이 작용하게 합니다. 섭씨 37도에서. 슬라이드를 DI 물로 다시 씻은 다음 100% 에탄올로 탈수한 다음 크실렌에 담그십시오.

마지막으로 80마이크로리터의 장착 매체와 커버 슬립을 적용합니다. 프로브 후의 슬라이드에는 발굴 라벨이 붙었습니다. 이들의 민감도는 positive control probe의 희석과 비교되었습니다.

3 43 염기쌍 p gingivalis 특이적 프로브는 엔지니어링된 70 염기쌍 박테리아 프로브보다 25배 더 민감했습니다. 그런 다음 두 개의 프로브를 고배율로 만성 치주염 환자의 치은 조직에 적용했습니다. 박테리아 프로브를 사용하여 다양한 형태의 박테리아를 식별할 수 있었습니다.

p gingivalis 특이적 프로브는 막대 모양의 박테리아만 검출한 반면, 밀접 연접 교란 화학 물질 DSS를 마우스의 치은 점막에 적용했습니다. 이 마우스의 조직 샘플을 사용하여 다른 맥락에서 프로브를 비교했습니다. 여기에서 U 박테리아 프로브는 다른 박테리아가 검출할 수 없는 박테리아를 감지할 수 있었습니다.

다음으로 U 박테리아 프로브는 종양을 포함하는 폐 조직 섹션에서 다른 박테리아를 검출하는 능력에 대해 테스트되었습니다. 박테리아는 종양 내부뿐만 아니라 종양 외부에서도 검출되었습니다. 원인을 알 수 없는 질병인 구강 편평 태선(oral licchen planus)을 앓고 있는 환자의 조직을 검사하는 과정에서 박테리아 프로브는 염증 침투가 관찰된 상피와 얇은 판 프로프리아의 세포 내에서 박테리아 신호를 감지했습니다.

개발 이후 이 기술은 감염병 분야의 연구자가 이 절차에 따라 인간과 동물 모두의 조직으로의 박테리아 침입을 탐구하는 데 도움이 되었습니다. 세포 마커에 대한 면역화학적 검출 성장과 같은 다른 방법은 조직 내에 어떤 종류의 세포가 박테리아를 보유하고 있는지와 같은 추가 질문에 답하기 위해 ED가 될 수 있습니다.