Name: 16S rRNA의 타겟팅 디곡신 표지 DNA 프로브를 사용하여 파라핀 조직 내에서 박테리아의 제자리 검출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: 배우세요 파라핀 조직 내 박테리아를 16S rRNA 표적 DIG 표지 DNA 프로브로 제자리 검출하는 방법을. 이 기법은 치주질환, 암, 염증성 면역질환에서 세균 역할 연구에 활용됩니다.

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본 연구는 한국 연구 재단에서 보조금 (2013R1A1A3005669)와 한국 보건 기술의 R &amp; D 사업, 보건 복지부의 허가 (HI13C0016)에 의해 지원되었다.

1. 프로브 준비 <ol><li> 프로브의 PCR 증폭 <ol><li> 피하십시오 gingivalis에 특이적인 프로브는, P.의 343 bp의 DNA 단편을 증폭 P.의 게놈 DNA를 사용하여 PCR에 의해 16S rRNA를 진지 발리 진지 발리 다음 프라이머 : 5&#39;-TGC AAC TTG CCT TAC AGA GG-3 &#39;과 5&#39;-ACT GCC CGT CGT ATC TAT TC-3&#39;10. 다음 사이클 조건 증폭을 수행 35주기를 95 ℃에서 30 초, 30 초, 60 ° C, 72 °에서 5 분 연장 한 다음 1 분 20 초 72 ° C C (10, 11)에 대해. </li><li> 70 bp의 DNA 절편 (5&#39;-CAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAG를 사용하여 프로브를 증폭 eubacterial TCCCGCAACGAGCGCAACCC-3 &#39;올리고 뉴클레오티드 프라이머를 다음과 같이 합성) : 5&#39;-CAG CTG GTR GGY CMT-3&#39;11 5&#39;-AGG GCG GTT GTT CTC-3. 다음 사이클 조건을 증폭를 수행 : 40주기를30 초 30 초 9 4 ℃, 60 ℃, 1 분 72 ℃에서 11, 12에서 5 분 연장 한 다음 20 초 동안 72 ° C에서. </li><li> 2 시간 동안 -20 ° C에서 배양 한 3 M 아세트산 나트륨 (PH 5.2) 및 (: 1의 비율이 10에서) 100 % 에탄올을 첨가하여 PCR 제품 (≥500 μL)을 침전. </li><li> 원심 혼합물을 15 분 동안 14,000 XG에, TE 완충액 100 ㎕에 펠렛을 재현 탁하고 260 nm에서 흡광도에 의해 DNA 농도를 측정한다. </li></ol></li><li> DIG DNA 표지 및 검출 키트를 사용하여 DIG는-라벨 <ol><li> 15 μL의 최종 부피 물로 프로브 3㎍을 섞는다. </li><li> 10 분 동안 95 ° C에서 DNA 변성 빨리 얼음에 진정. </li><li> 10 배 hexanucleotide 믹스 2 μL,의 dNTP - 라벨 믹스 2 μL 및 변성 된 DNA의 15 μL에 클레 나우 효소 1 μl를 추가합니다. </li><li> 혼합하고 48 시간에 24 시간 동안 37 ℃에서 배양하고 65 ℃에서 가열하여 반응을 중지합니다. </li></ol></li><li> DIG DNA 라벨링 및 검출 키트를 사용하여 DIG 표지 된 프로브의 민감도를 확인 <ol><li> 수동 RT에서 5 분간 키트에 양성 대조군 프로브의 희석액 1 μL 및 나일론 막에 DIG 표지 된 프로브의 1 NG 건조로드. </li><li> 간단히 배 SSC 버퍼 (0.3 M의 NaCl, 30 mM의 시트르산 나트륨, pH를 7.0)에 담가 멤브레인 DNA 고정화, 1 시간 동안 80 ° C에서 배양 한 멤브레인. </li><li> 간단히 말레 산 버퍼 (MAB, 0.1 M 말레 산, 0.15 M의 NaCl, pH를 7.5)를 막 담가 및 안티 DIG 알칼리 포스 파타 아제 컨쥬 게이트 항체를 희석 (AP)와 함께 품어 : 제공된 차단 솔루션의 6 ml의 (1 5,000) 실온에서 30 분 동안 키트. </li><li> MABT (MAB 1 % 트윈 20을 포함)와 멤브레인을 씻고 상에 2 ml의 검출 버퍼 (0.1 M 트리스 - 염산, 0.1 M의 NaCl, 0.05 M의 MgCl 2, pH를 9.5)와 혼합 NBT / BCIP 용액 40 μl를 적용 1 분 동안 막. 표지 된 프로브의 감도이면만족하지, 1.1.3에서 1.3.4로 단계를 반복합니다. </li><li> 표지 프로브 (OD260)의 DNA 농도를 측정 ng를 100 μL의 농도를 조정 -1. </li></ol></li><li> DIG 표지 프로브의 특이성을 확인 <ol><li> 게놈 DNA 샘플을 변성 10 분 동안 95 ° C에서, 특정 프로브의 대상이 박테리아 등 다양한 박테리아 종에서 (25 세 μL -1 각 샘플 당을 ng를) 빠르게 얼음에 진정. </li><li> 수동으로 실온에서 20 분 동안 변성 나일론 막에 DNA와 건조를로드합니다. </li><li> 간단히 배 SSC 버퍼 막을 담가 DNA 고정화 2 시간 동안 80 ° C에서 배양 한 멤브레인. </li><li> 1 시간 동안 실온에서 차단 용액으로 차단 막. </li><li> 혼성화 완충액에 희석 된 프로브를 변성하고, 막에 적용 μL -1 1 NG에 프로브를 희석. </li><li> 1 시간 동안 45 ° C에서 막을 인큐베이션. </li><li> 멤브레인을 씻으 세배 SSC 버퍼와 시간. </li><li> 간단히 MAB에 담가 멤브레인. </li><li> 1 시간 동안 실온에서 차단 용액 6 ㎖에 (000 1) 희석 항 DIG AP 공역 항체와 인큐베이션. </li><li> MABT으로 막을 세척하고 2 ml의 검출 버퍼와 혼합 NBT / BCIP 용액 40 μl를 적용합니다. </li><li> 프로브는 특이성을 달성 할 것으로 예상되지 않을 때 특이성이 관찰 될 때까지, 혼성화 온도를 증가시킨다. </li></ol></li></ol> 현장 하이브리드 2. 참고 : 시료 및 시약의 건조를 방지 젖은 종이 타월로 줄 지어 가습 실에있는 모든 배양을 수행 할 수 있습니다. <ol><li> 탈 paraffinization와 조직 절편의 재수 <ol><li> 파라핀 블록에서 4 μm의 두께 조직 섹션을 준비합니다. 포르말린, 파라 포름 알데히드, 아연 기반의 정착이 프로토콜과 호환됩니다. </li><li> DEPC 처리 된 물을 사용하는 모든 시약을 준비합니다. </li><li> 30 분 동안 60 ° C에서 건조 오븐에서 열 슬라이드와 30 분 동안 RT에서 슬라이드를 배양. </li><li> 5 분 3 회 100 % 크실렌 슬라이드 담가; 신선한 크실렌 때마다 사용합니다. 참고 : 화학 물질 흄 후드이 드 왁싱 절차를 수행합니다. </li><li> 회 5 분 동안 100 % 에탄올에 담가 슬라이드마다 신선한 에탄올을 사용하고, 5 분마다 90 %에서 일련의 시편, 80 % 및 70 % 에탄올 용액을 재수. </li><li> 1 분 동안 DEPC 처리 된 물에 슬라이드를 담그고 6 분 동안 DEPC 처리 된 PBS (PH 7.4)에 슬라이드를 씻으십시오. </li></ol></li><li> 조직 절편의 전처리 <ol><li> 20 분 동안 0.1 N 염산에 슬라이드를 담그고 30 초 동안 DEPC 처리 된 물에 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 왁스 펜을 사용하여 표본을 둘러싼 소수성 장벽을 그립니다. 참고 : 소수성 장벽의 크기는 표본의 크기에 따라 달라집니다. 따라서, 다음 단계에 사용되는 시약의 양을 시료의 크기에 의존하지만 HY을 작성할 필요가 달라drophobic 장벽 (작은 시편 50 μL 큰 시편 400 μL). </li><li> 30 분 동안 37 ℃에서 건조 오븐에서 단백질 분해 효소 K (1 ~ 10 μg의 ml의 -1 DEPC 처리 된 PBS에)의 50-400 μL로 표본을 치료하고 1 분 동안 DEPC 처리 1X PBS에서 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 10 분 동안 DEPC 처리 된 PBS에 4 % 파라 포름 알데히드에 슬라이드를 만끽 한 후 1 분 동안 DEPC 처리 된 PBS에 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 0.1 M 트리에탄올 아민 염산 20 분 동안 0.5 % 무수 초산을 포함하는 (PH 8.0)에 슬라이드를 담가 30 초 동안 DEPC 처리 된 물에 슬라이드를 씻으십시오. </li></ol></li><li> 프로브 및 세척과 교잡 <ol><li> 20 분 동안 2 배 SSC 버퍼에 슬라이드를 담가. </li><li> 혼성화 완충액 μL -1 1 NG (4X SSC에서 프로브 희석 50 % [의 부피 / 부피] 포름 아미드, 1X 덴 하르트 용액, 10 % [중량 / 부피] 황산 덱스 트란, 0.1 % [중량 / 부피 나트륨 도데 실 설페이트, 0.4 mg을 ml의 -1 연어 정자 DNA). 음성 대조군의 경우와 표지 프로브를 혼합비 표지 프로브의 10 배 과량. </li><li> 희석 된 프로브를 변성 및 조직 섹션에 50-400 μl를 적용합니다. 슬라이드 커버 슬립을 놓고 매니큐어로 밀봉. </li><li> 45 ° C 또는 최적의 온도에서 가습 실 O / N에서 10 분 동안 90 ° C에서 PCR 기계에 열 슬라이드와 부화 슬라이드 단계 1.4.11에서 결정. </li><li> 30 분 동안 4 ℃에서 슬라이드 쿨 커버 슬립을 제거하고, 다음과 같은 일련 SSC 버퍼에 슬라이드 젖어 : 4X SSC를 10 분, 예열 된 (45 ℃) 2 × SSC를 위해 20 분 동안 2 배 SSC를 10 분 및 10 분 동안 0.2X SSC. </li></ol></li><li> 안티 DIG AP-복합 항체 검출 <ol><li> 5 분 동안 MABT에 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 20 분 동안 1 % 트윈 20 용액으로 블로킹 50~400 μL하는 블록. </li><li> 솔루션 (1 : 1,000) 차단에 희석 방지 DIG-AP 항체의 50-400 μl를 추가 anld 90 분 동안 37 ° C에서 품어. </li><li> 10 분 동안 MABT에 슬라이드를 씻으십시오. </li> &lt;리&gt; 5 분 동안 1 % 트윈 20을 함유하는 검출 버퍼에 슬라이드를 담근다. </li><li> μ 1 밀리미터의 levamisole의 내인성 알칼리 포스파타제를 실활 5 분간 (1 % 트윈 20을 함유하는 검출 버퍼) 50~400로 처리. </li><li> (1 검출 완충액에 희석 : 100) 예 혼합 NBT / BCIP 용액 50~400 μL 분배 각 시험편 상 및 개발 신호가 만족 될 때까지 2 내지 3 시간 동안 실온에서 습윤 챔버에서 슬라이드를 배양한다. </li><li> 시각화를 중지하고 10 분 동안 37 ° C에서 0.05 % 카운터 스테인 같이 중량 / 부피] 메틸 녹색의 50~400 μL를 적용하는 탈 이온수로 슬라이드를 씻어. </li><li> 100 % 에탄올 탈수, 탈 이온수와 슬라이드를 씻어, 자일 렌에 몰입. </li><li> 각각의 슬라이드에 장착 솔루션의 80 μl를 적용하고 커버 슬립 커버. </li></ol></li></ol>

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여기서 프로토콜 설명 하였다 DIG 표지 된 DNA 프로브를 사용하는 파라핀 포매 조직 내의 박테리아를 지역화. 프로브는 세균 16S rRNA 유전자의 DNA 또는 RNA 분자를 표적으로하고, 16S rRNA의 타겟팅 프로브는 어느 종 특이 또는 범용으로 설계 될 수있다. (P)의 구체적인 하이브리드 경찰에 진지 발리 - 특정 프로브 진지 발리 아니라 다른 구강 박테리아는 이전에 (10)를 보였다. 혼성화 효율이 12 변할지라도 대조적 eubacterial 프로브는, 테스트 한 모든 박테리아 게놈 DNA (17 종)로 혼성화. 프로브 내의 T 뉴클레오티드의 수는 DIG 라벨링의 효율을 결정한다. 고감도 DIG 표지 된 프로브의 제조는 기술 된 프로토콜의 성공적인 구현을위한 가장 중요한 단계이다. 염산으로 시편의 치료 단백질 및 부분적 hydrolysi 추출 통해 신호대 잡음비를 향상표적 서열의 S. 단백질 분해 효소 K의 농도의 증가는 프로...

박테리아는 치주염, 치수염, pericoronitis, 봉와직염, 골수염과 같은 다양한 구강 질환의 병인에 중요한 역할을한다. 질병의 발병 기전에서 세균의 역할을 이해하고 치료의 효과를 모니터링하기 위하여, 조직 내의 박테리아의 현지화 중요하다. 치주염 환자의 치은 조직 내의 박테리아의 존재는 fluorescence-를 사용하여 계내 혼성화 (FISH) 8 전자 현미경 1,2, 면역 조직 화학 및 면역 이용한 박테리아 특이 항체 3-7 및 형광체를 포함하여, 다양한 방법을 이용하여 도시 한 16S rRNA의 타겟팅 된 표지 된 올리고 뉴클레오티드 프로브. 그럼에도 불구하고, 이러한 방법은 널리 기술적 한계 나 어려움에 사용되지 않습니다. 항체와 비교하는 16s rRNA를 타겟팅 프로브 생산 종 특이성을 달성하기 쉽다. 물고기는 BACT의 시각화를위한 훌륭한 도구가 될 입증되었습니다이러한 플라크 바이오 필름 등의 자연 환경에서 eria. 그러나, 조직 샘플에 대한 FISH의 적용으로 인해 다양한 조직 성분의자가 형광에 한정된다. 그들은 9 출혈 것을 포함 할 때, 예를 들어, 적혈구의 강한 형광도는 종종 염증 조직으로 형광 기술의 적용을 방해. 염증 잇몸 조직 내의 박테리아를 지역화하기 위해, 따라서, 디곡 시게 닌을 사용하여 동일계에서 혼성화 방법 (DIG) 표지 된 DNA 프로브를 개발되었으며 10,11 성공적으로 적용 하였다. 피를 사용하여 파라핀 조직 내에서 박테리아의 현지화에 대한 다음은 상세한 프로토콜 진지 발리 - 특정 보편적 eubacterial 프로브는 설명 하였다. 이것은 특히 유사한 결과가 다른 실험실에서 재현 될 수 있도록하는 방법의 표준화에 집중된다. 이 프로토콜은 자신의 조직 학적 상황과 resu 내 박테리아의 현지화를 할 수 있습니다LTS는 높은 재현성 있습니다. 설명 프로토콜은 어느 다양한 조직에서 종 특이 또는 범용 방식 박테리아 지역화하는데 사용될 수있다. 범용 프로브는 polymicrobial 질환 박테리아를 검출하고 특정 박테리아의 역할을 알 수없는 경우 질병에 박테리아의 잠재적 인 역할을 연구하는 데 특히 유용합니다.

<table><tbody><tr><td>무수아세트산</td><td>Sigma</td><td>6404</td><td></td></tr><tr><td>50% 덱스트란 황산염 용액</td><td>Millipore</td><td>S4030</td><td></td></tr><tr><td>50X Denhardt' s 솔루션</td><td>Sigma</td><td>D2532</td><td></td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma</td><td>P159220</td><td></td></tr><tr><td>DIG DNA 라벨링 및 검출 키트</td><td>Roche</td><td>11 093 657 910</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge&trade; 펜</td><td>Dako</td><td>H-400</td><td></td></tr><tr><td>레바 미솔</td><td>벡터</td><td>SP-5000</td><td></td></tr><tr><td>염화 마그네슘</td><td>시그마</td><td>246964</td><td></td></tr><tr><td>말레 산</td><td>시그마</td><td>M0375</td><td></td></tr><tr><td>메틸 그린</td><td>시그마</td><td>M6776</td><td></td></tr><tr><td>파라 포름 알데히드</td><td>시그마</td><td>P1648</td><td></td></tr><tr><td>퍼 마운트</td><td>피셔</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>연어 정액 DNA 용액</td><td>Invitrogen</td><td>#15632-011</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>시그마</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>구연산나트륨</td><td>덕산</td><td>D1420</td><td></td></tr><tr><td>도데실황산나트륨</td><td>Amresco</td><td>227</td><td></td></tr><tr><td>트리에탄올아민-HCl</td><td>시그마</td><td>90279</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>연구 유기물</td><td>3098T</td><td></td></tr></tbody></table>

16s rrna의 타겟팅 디곡신 표지 dna 프로브를 사용하여 파라핀 조직 내에서 박테리아의 제자리 검출

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

치주염 환자의 치은 생검에서 주머니 상피와 기저 결합 조직 내에 박테리아가 존재한다는 것은 전자 현미경, 박테리아 특이적 항체를 사용한 면역조직화학 또는 면역형광, 형광 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한 FISH(Fluorescent in situ hybridization) 등 다양한 방법을 사용하여 보고되었습니다. 그럼에도 불구하고 이러한 방법은 기술적 한계나 어려움으로 인해 널리 사용되지 않습니다. 여기에서는 DIG 표지 DNA 프로브를 사용하여 파라핀 포매 조직 내에서 박테리아를 국소화하는 방법이 도입되었습니다. 파라핀이 포매된 조직은 병리학 은행에서 구할 수 있는 가장 일반적인 형태의 생검 조직입니다. 박테리아는 종 특이적 또는 보편적인 방식으로 검출할 수 있습니다. 박테리아 신호는 박테리아의 개별 형태(구균, 막대, 방추형 및 털이 많은 형태) 또는 분산된 형태로 감지됩니다. 이 기술을 사용하면 다른 조직학적 정보를 얻을 수 있습니다: 상피, 결합 조직, 염증성 침윤 및 혈관이 잘 구별됩니다. 이 방법은 치주염, 암, 염증성 면역 질환과 같은 다양한 질병에서 박테리아의 역할을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

도 1에 도시 한 민감도를 결정하는 키트에 양성 대조군 프로브에 비해 DIG 표지 된 프로브의 도트 블 롯팅. 343 bp의 P. 진지 발리 - 특정 프로브는 70 bp의 eubacterial 프로브보다 25 배 더 민감하다. (P)의 검출을위한 만성 치주염 환자에서 얻은 치은 조직의 현장 하이브리드의 2는 그림 진지 발리과 진정 세균. 바이올렛에 도시 세균 신호는, 외부에있는 조직 상피, 점막 고유 및 생물막 내에서 검출되었다. 그러나, 경찰의 분포 진지 발리와 치은 조직 내에서 진정 세균은 달랐다. 만 막대 모양의 세균이 피에 의해 감지 동안 박테리아의 높은 배율 (배, 1000 배), 다양한 모양 (구균,로드, 방추형, 털이 양식)에서, eubacterial 프로브를 사용하여 볼 수 있었다 진지 발리 - 특정 프로브. 박테리아 신호의 ...

여기에서는 DIG 표지된 16S rRNA 표적 DNA 프로브를 사용하여 파라핀 포매 조직 내에서 박테리아를 국소화하는 방법이 설명되었습니다. 이 프로토콜은 치주염, 암, 염증성 면역 질환과 같은 다양한 질병에서 박테리아의 역할을 연구하는 데 적용할 수 있습니다.

16S rRNA의 타겟팅 디곡신 표지 DNA 프로브를 사용하여 파라핀 조직 내에서 박테리아의 제자리 검출

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been ...

본 절차의 전반적인 목표는 DIG가 표지된 16s ribosomal RNA 표적 DNA 프로브를 사용하여 파라핀 임베딩 조직 내의 박테리아를 국소화하는 것입니다. 이는 먼저 PCR 증폭과 DIG 표지를 통해 프로브를 준비함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 표적 부위에 더 쉽게 접근하고 배경 결합을 줄일 수 있도록 조직 절편을 준비하는 것입니다.다음으로, 준비된 조직 절편을 dig 표지 프로브와 하이브리드화합니다. 마지막으로, 하이브리드화된 프로브를 알칼리성 포스파타아제가 표지된 anti-D dig 항체로 검출합니다. 결과적으로, 이 C two 하이브리드화 방법을 통해 파라핀 임베딩 조직 내 박테리아의 존재를 확인할 수 있습니다.ING와 같은 기존 방법과 비교하여 이 검출법이 갖는 영역적 장점은 일부 조직학적 구조 내에서 세균 SHS를 검출할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 치주염 및 R planet과 같은 다양한 염증 상태에서 병인에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 조직 절편이 쉽게 손상되어 조직 준비 및 하이브리드 소화 단계의 수행이 어렵기 때문에, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.U 박테리아 프로브를 제작하려면 70 base pair의 DNA 단편을 템플릿으로 사용하고, 두 개의 15 base pair 프라이머를 사용하여 PCR로 프로브를 증폭하십시오. 알려진 농도의 버퍼에 앰플리콘을 수집하십시오. 그런 다음 dig DNA 라벨링 및 검출 키트를 사용하여 프로브를 라벨링하십시오.먼저 3 µg의 프로브를 15 µL의 물에 섞습니다. 히팅 블록에서 95 °C로 10분 동안 프로브를 변성시킵니다. 그다음 변성된 프로브를 얼음 위에 둡니다.다음으로, 10 XH 뉴클레오타이드 2 µL, DN NTPs 2 µL, 그리고 canal enzyme 1 µL를 첨가합니다. 혼합 후, 프로브를 37 °C에서 24~48시간 동안 인큐베이션합니다. 혼합물을 65 °C로 가열하여 반응을 중단시킵니다.그 다음 260 nanometers에서 표지된 프로브의 DNA 농도를 측정하고 농도를 100 nanograms per microliter로 조정합니다. 키트를 사용하여 먼저 나일론 막에 단계 희석한 양성 대조군 1 microliter를 로딩하여 프로브의 민감도를 확인합니다. 프로브 및 dig 표지 프로브.멤브레인을 5분 동안 건조시킵니다. 건조 후, 멤브레인을 2X SSC에 짧게 담근 다음 80°C 인큐베이터에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후 DNA를 고정시키기 위해 멤브레인을 말레산 완충액(maleic acid buffer)에 짧게 담근 다음, 30분 후 1:5,000으로 희석된 AP 결합 항체가 포함된 블로킹 완충액으로 옮깁니다.멤브레인을 MABT로 세척합니다. 그런 다음 40 µL의 N-B-T-B-C-I-P를 2 mL의 검출 버퍼(detection buffer)에 혼합합니다. 세척 후, 이 혼합액을 멤브레인에 1분 동안 처리합니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 파라핀을 제거하고 조직 절편을 재수화한 후, in situ hybridization을 위한 준비 단계로 먼저 슬라이드를 0.1 normal 염산에 20분 동안 담급니다. 산 처리 후, DEPC 처리된 물로 슬라이드를 30초 동안 세척합니다. 그다음 왁스 펜을 사용하여 각 슬라이드 위의 표본 외곽선을 그립니다.다음으로, 검체의 크기에 따라 50에서 400 µL의 proteinase K 용액을 검체에 첨가하십시오. 37 °C에서 30분 동안 효소를 반응시킨 후, DEPC 처리된 1×PBS로 슬라이드를 1분간 세척하십시오. 이제 슬라이드를 DEPC 처리된 PBS 내의 4% paraform aldehyde에 10분 동안 옮겨 놓으십시오.이전과 같이 PBS로 고정액을 씻어냅니다. 그 후 pH 8의 0.1 molar triethanolamine hydrochloride와 0.5% acetic and hydride 용액에 슬라이드를 20분 동안 담가둡니다. 이후 이전과 같이 깨끗한 물로 슬라이드를 씻어냅니다. 이제 슬라이드를 2 XSSC에 20분 동안 먼저 침지하여 in C two 단계를 시작합니다.그동안, 음성 대조군을 위해 표지된 프로브를 하이브리드화 완충액에서 1 ng/µL로 희석합니다. 비표지 프로브의 경우 10배 농도로 사용하십시오. 그런 다음 프로브를 90 °C에서 10분 동안 가열하여 변성시킨 후, 즉시 얼음 위에서 급속 냉각합니다.다음으로, 이전에 처리한 proteinase K와 동일한 부피의 프로브 희석액을 각 슬라이드에 도포합니다. 그런 다음 커버 슬립을 조심스럽게 덮고 매니큐어를 사용하여 절편을 밀봉합니다. 이제 PCR 기기 블록에서 슬라이드를 90 °C로 10분 동안 가열한 후, 45 °C의 습윤 인큐베이터로 옮겨 다음 날까지 하룻밤 동안 배양합니다.슬라이드를 4°C에서 30분 동안 냉각시킨 후, 커버슬립을 조심스럽게 제거하십시오. 조직은 매우 취약합니다. 마지막으로, 실온에서 일련의 SSC 버퍼 용액에 슬라이드를 통과시키십시오.먼저, 하이브리드화된 NC 슬라이드 2개를 MABT에서 5분 동안 세척합니다. 그 다음, 1% tween 20이 포함된 블로킹 용액 50~400 µL를 처리하여 20분 동안 반응시킵니다. 블로킹 배양 후, 1:1000으로 희석한 anti-D dig alkaline phosphatase 항체와 블로킹 용액 혼합액 50~400 µL를 처리합니다.1차 항체를 처리한 후 37 °C에서 90분 동안 결합시킵니다. 슬라이드를 MABT로 10분 동안 세척합니다. 그 다음, 1% tween 20이 포함된 검출 버퍼에 슬라이드를 5분 동안 담급니다.이제 각 슬라이드에 1 mM ole 검출 버퍼 용액 50~400 µL를 도포하고, 5분 동안 배양하여 내인성 알칼리성 인산분해효소를 불활성화합니다. 다음으로, 검출 버퍼에 1:100으로 희석한 N-B-T-B-C-I-P 50~400 µL를 각 슬라이드에 첨가하고, 경험적 판단에 따라 가습 챔버에서 2~3시간 동안 슬라이드를 배양합니다.슬라이드를 DI water로 헹군 다음, 0.05% w/v methyl green을 도포하고 37°C에서 10분 동안 조직에 대조 염색이 되도록 둡니다. 슬라이드를 다시 DI water로 세척한 후, 100% ethanol로 탈수하고 이어서 xylene에 담급니다.마지막으로, 마운팅 용액 80 µL를 도포하고 커버슬립을 덮습니다. 프로브를 처리한 슬라이드는 DIG 라벨링을 거쳤습니다. 이들의 민감도는 양성 대조군 프로브의 희석 배수와 비교되었습니다.43 base pair의 p. gingivalis 특이적 프로브는 설계된 70 base pair 박테리아 프로브보다 25배 더 민감했습니다. 이후 두 프로브를 만성 치주염 환자의 치은 조직에 적용하여 고배율로 관찰했습니다. 박테리아 프로브를 사용하여 다양한 형태의 박테리아를 식별할 수 있었습니다.p gingivalis 특이적 프로브는 간균 형태의 박테리아만 검출한 반면, 밀착 연접을 파괴하는 화학 물질인 DSS를 마우스의 잇몸 점막에 처리하였습니다. 이 마우스들로부터 얻은 조직 샘플을 사용하여 서로 다른 환경에서 프로브들을 비교하였습니다. 여기서 U 박테리아 프로브는 다른 프로브가 검출하지 못한 박테리아를 검출할 수 있었습니다.다음으로 U 세균 프로브를 사용하여 종양을 포함하는 폐 조직 절편 내의 다른 세균 검출 능력을 테스트했습니다. 세균은 종양 내부뿐만 아니라 외부에서도 검출되었습니다. 원인 불명의 질환인 구강 편평태선 환자의 조직을 조사한 결과, 세균 프로브는 염증성 침윤이 관찰된 상피 및 점막 고유층 세포 내에서 세균 신호를 검출했습니다.이 기술이 개발된 이후, 연구자들은 본 절차를 통해 인간과 동물 모두에서 조직 내로 침투하는 박테리아를 탐구함으로써 감염병 분야의 연구에 도움을 받았습니다. 조직 내에서 어떤 종류의 세포가 박테리아를 보유하고 있는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해, 세포 마커에 대한 면역화학적 검출 성장과 같은 다른 방법들이 사용될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Google은 최근은 간단 세균 검출을위한 형광 분석 "을 믹스 앤 읽기"를 설정하는 데 적용할 수있는 형광 DNAzyme 프로브를 생성하기위한 새로운 접근 방식을보고했습니다. 이러한 특별한 유전자 프로브는이를 형광 신호 생성에 세균 검출을 번역 특정 세균에 의해 생산되는 원유 세포외 혼합물 (CEM)의 앞에서 발색단 - 수정의 DNA-RNA 키메라 기판의 절단을 catalyze. 이 보고서에서 우리는 "RFD-EC1"표시된 특정 DNAzyme 프로브는 모델 박테리아의 탐지를 위해 고용되는 핵심 실험 절차를...

형광 DNAzymes을 사용하여 박테리아의 탐지

출처: 최, Y. S. 외 16S rRNA를 표적으로 하는 디곡신 표지 DNA 프로브를 이용한 파라핀 내의 박테리아 현장 검출. J. Vis. 경험 (2015).이 영상은 박테리아 DNA를 표적으로 하는 디곡신 표지 DNA 프로브를 이용해 쥐 치은골 조직 절편에서 박테리아를 현장에서 검출하는 과정을 시연합니다. 이 절편은 탐침과 함께 인큐베이션됩니다. 디곡신에 특이적인 알칼리성 인산효소 결합 항체가 첨가됩니다. 내인성 인산효소는 비활성화되고, 기질 첨가를 통해 색이 있는 침전물이 얻어집니다. 절편은 카운터 스테인, 탈수, 자일렌 제거 후 세균을 현미경으로 시각화하기 전에 부착합니다.

마우스 치은조직 절편에서 박테리아의 현장 검출

이 비디오는 요로 감염 환자의 탈파라핀 처리된 방광 조직에 있는 박테리아의 시각화를 보여줍니다. 박테리아 16s 리보솜 RNA와 교배된 형광 표지 프로브는 조직 관련 박테리아와 그 분포를 밝혀 샘플 내 밀도에 대한 귀중한 공간적 통찰력을 제공합니다.

Visualization of Bacteria in Bladder Biopsy Sections via Fluorescence In Situ Hybridization(형광 현장 혼성화를 통한 방광 생검 절편에서의 박테리아 시각화)

여기 우리는 전체 마운트 형광을...

전체 마운트 RNA 형광<em&gt; 현장에서</em의&gt; 하이브리드<em&gt; Drosophila</em&gt; 태아

이 비디오의 목적은 임상에서 드문 돌연변이를 검출하는 포르말린 고정 파라핀 (FFPE) 참조 표준 셀 라인과 디지털 방울 PCR (ddPCR) 분석 자동화 된 DNA 추출을 수행하는 방법을 설명하는 것입니다. FFPE 샘플에서 돌연변이를 검출하는 것은 FFPE 샘플에서 ddPCR의 임상 적 유용성을 보여줍니다.

디지털 물방울 PCR은 포르말린 고정 파라핀 포함 된 참조 표준 세포주에서 BRAF의 V600E 돌연변이를 검출하기 위해 채용

여기, 우리는 공간 및 일시적으로 틱 용기 수정된 전체 마운트 제자리 교 잡 방법을 사용 하 여 가능한 microbiota의 존재를 평가 하기 위해 프로토콜을 제시.

제자리에 전체 산 교 잡에 의해 틱 용기에 Microbiota의 시각화

이 프로토콜의 목표 성인 산호 샘플 파라핀에 포함 되 고 유리 슬라이드에 구분에 교 잡 현장에서 수행 하는 것입니다. 이것은 파라핀 끼워 넣어진 조직에서 RNA 방지 감지 프로브의 공간 표현을 시각화 하는 데 사용 하는 질적 방법입니다.

제자리에서 파라핀 포함 성인 산호 샘플에 대 한 교 잡 기술

이 프로토콜은 16S rRNA에 의한 환자 생검에서 조직 관련 박테리아의 편견 없는 검출을 위한 것으로, 공초점 현미경 검사법에서.

시투 혼성화에서 16S rRNA 형광에 의한 방광 생검의 조직 상주 박테리아 검출

이 간소화된 프로토콜은 조직을 고정하는 것에서부터 시투 혼성화에서 형광을 함유한 미생물을 염색하는 것까지 복잡한 조직 샘플에서 박테리아를 감지하고 이미지화하는 워크플로우를 자세히 설명합니다.

시투 혼성화, 렉틴 염색 및 이미징에서 형광을 통한 장내 미생물군유립 상호 작용의 시각화

세포 외 박테리아와 오르세 바이러스 및 미세 포자충 (곰팡이)과 같은 세포 내 병원체를 포함한 장내 미생물은 종종 야생 Caenorhabditis 선충류와 관련이 있습니다. 이 기사에서는 C. elegans 선충류에 서식하는 미생물을 검출 및 정량화하고 실험실에서 통제 된 감염 후 병원체 부하를 측정하기위한 프로토콜을 제시합니다.

RNA 형광 제자리 혼성화(FISH)를 통해 Caenorhabditis elegans 장에서 미생물 집락화 및 감염을 시각화합니다.

이 프로토콜은 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 조직 표본에서 유전자 증폭을 시각화하는 재현 가능한 방법을 제공합니다.

Fluorescence In Situ hybridization에 의한 포르말린 고정 파라핀 포매 시료에서 유전자 증폭의 강력한 검출

배우세요 파라핀 조직 내 박테리아를 16S rRNA 표적 DIG 표지 DNA 프로브로 제자리 검출하는 방법을. 이 기법은 치주질환, 암, 염증성 면역질환에서 세균 역할 연구에 활용됩니다.

16S rRNA의 타겟팅 디곡신 표지 DNA 프로브를 사용하여 파라핀 조직 내에서 박테리아의 제자리 검출

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