디지털 물방울 PCR은 포르말린 고정 파라핀 포함 된 참조 표준 세포주에서 BRAF의 V600E 돌연변이를 검출하기 위해 채용

이 실험의 전반적인 목표는 조직 준비 시스템을 사용하여 형식 및 고정 파라핀 내장 참조 표준 세포주에서 인간 유전체, DNA를 분리한 다음 디지털 액적을 사용하여 게놈 DNA의 bra V 600 E 돌연변이를 분석하는 것입니다. P-C-R-D-D-P-C-R RA 염기서열 돌연변이의 존재 및 풍부함, 낮은 템플릿 복제 수에서 핵산의 정량화와 같은 분자 종양학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 표준 세포주 이후 AEP에서 입증되고 있지만, 관심 있는 DNA를 분리하기 위한 조건을 최적화하기 위해 다른 바이오 샘플에도 사용할 수 있습니다.

이 조직 전처리 시스템은 다른 수동 절차와 비교할 때 4시간 이내에 최대 48개의 무오염 인간 게놈 DNA 샘플을 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 이 시스템은 마그네틱 비드를 사용하기 때문에 준비 비용이 다소 비쌉니다. 그러나, 그것은 더 안전하고 생산되며 고품질의 cleage는 압력을 입증하는 ssu A와 우리 실험실의 기술자가 될 것입니다.

DNA 추출은 조직 준비 시스템 또는 TPS 프로토콜을 사용하여 완전 자동화된 DNA 분리 기기에서 수행됩니다. 기기와 컴퓨터를 켜서 시작하십시오. 실행 제어 소프트웨어를 열고 자동 적재 트레이를 TPS 데크 적재 영역에 삽입합니다.

다음으로, 이 그림과 같이 시약을 해당 트로프에 분배하여 4개의 샘플을 샘플 캐리어 랙에 놓습니다. 용해 완충액과 세척 완충액을 3-5회 반전하여 적절하게 혼합한 다음 4열의 각 홈통에 로드합니다. 몇 번 반전하거나 가벼운 와류 후 elucian buffer magnetic beads와 FFPE buffer를 column 5의 작은 홈에 로드하고 표시된 곳에 두 개의 슬롯을 비워 둡니다.

2ml 깊이의 웰 플레이트를 플레이트 캐리어에 로드합니다. 실행을 시작하기 전에 UNC는 모든 튜브와 시약 트로프를 캡으로 씌웁니다. 액체 폐기물 용기에 충분한 용량이 있는지, 고형 폐기물 용기가 비어 있고 생물학적 위험 백이 늘어서 있는지 확인하십시오.

팁 배출판이 폐기물 어셈블리의 중앙에 있는지 확인합니다. 앞 덮개를 닫고 소프트웨어를 시작한 다음 NA 준비 기본 ML 스타렛을 엽니다. med 파일을 수행합니다.

시작을 클릭합니다. 기기 상태가 유휴 상태에서 실행 중으로 전환됩니다. 이 실행에 대한 샘플 수를 입력합니다.

이 실행에 대해 원하는 방법을 선택합니다. 첫 번째 높은 볼륨 팁의 위치를 입력하고 하나를 선택합니다. 모든 트레이가 가득 차면 하나를 선택하여 첫 번째 표준 볼륨 팁의 위치를 입력합니다.

모든 트레이가 가득 차면 기기는 사용자 개입 없이 자동화된 단계를 실행합니다. 오염을 방지하기 위한 자세한 작업 흐름이 여기에 표시되어 있습니다. 장갑을 착용하고 깨끗한 PCR 후드를 사용하는 것과 같은 표준 예방 조치를 따르십시오.

피펫과 저단백질 결합 튜브를 청소합니다. PCR 튜브 스트립에 반응 혼합물을 조립하고 반응 성분을 실온으로 해동 및 평형화합니다. 디지털 액적, PCR 또는 D-D-P-C-R 분석을 위한 인간 게놈 DNA 샘플은 마이크로리터당 최소 3.3나노그램의 농도를 가져야 합니다.

PCR 반응을 준비합니다. 두 개의 X-D-D-P-C-R 슈퍼 믹스 20 x 정방향 및 역방향 프라이머를 결합하고 각 정제된 DNA 샘플로 프로브를 만들고 증류수로 최대 20마이크로리터를 만듭니다. 균질성을 보장하기 위해 혼합물을 철저히 소용돌이치고 분배하기 전에 튜브 바닥의 내용물을 수집하기 위해 간단히 원심분리합니다.

제조업체에서 권장하는 프로토콜에 따라 액적 발생기를 작동하십시오. 홀더의 왼쪽 상단에 있는 카트리지에 홈이 있는 상태로 카트리지를 홀더에 삽입합니다. 샘플이 포함된 20마이크로리터의 반응 혼합물을 중간 웰에 추가하고 70마이크로리터의 발전기 오일을 하단 웰에 추가합니다.

카트리지 상단에 개스킷을 부착합니다. 개스킷이 홀더의 양쪽 끝에 단단히 걸렸는지 확인하십시오. 그렇지 않으면 액적 생성을 위한 충분한 압력이 달성되지 않습니다.

기기 상단에 있는 녹색 버튼을 눌러 액적 생성기를 엽니다. 홀더가 올바른 위치에 있을 때 카트리지를 삽입하십시오. 전원 및 홀더 표시등이 모두 녹색입니다.

기기의 상단 버튼을 다시 눌러 도어를 닫고 액적 생성을 시작합니다. 방울 표시등이 10초 후에 녹색으로 깜박이면 방울 생성이 진행 중임을 나타냅니다. 액적 생성이 완료되면 세 개의 표시등이 모두 녹색으로 바뀝니다.

버튼을 눌러 도어를 열고 기기에서 홀더를 제거합니다. 홀더에서 일회용 개스킷을 제거하고 폐기하십시오. 카트리지의 상단 웰에는 액적이 포함되어 있고 중간 및 하단 웰은 액적 생성 후 소량의 잔류 오일로 거의 비어 있습니다.

기존 PCR 증폭을 준비합니다. 각 샘플 파이프에 대해 카트리지의 상단 웰에서 40 마이크로 리터의 액적 내용물이 제조업체의 기기 프로토콜에 표시된대로 권장 96 웰 PCR 플레이트의 단일 웰로 들어가고, 이송 중 액적 전단을 최소화하기 위해 액적을 천천히 부드럽게 흡입합니다. 액적을 옮긴 직후 PCR 플레이트는 증발을 방지하기 위해 밀봉해야 합니다.

플레이트 씰러 온도를 섭씨 180도로 설정하고 시간을 5초로 설정합니다. 화살표를 터치하여 트레이 도어를 엽니다. 96 웰 면이 위를 향하도록 트레이에 지지 블록을 배치합니다.

96웰 플레이트를 지지 블록에 놓고 모든 플레이트 웰이 지지 블록 덮개와 정렬되었는지 확인합니다. 호일 씰 한 장이 있는 96웰 플레이트: PCR 플레이트 씰러 및 액적 판독기의 바늘과 호환되는 비유 호일 플레이트 씰을 사용합니다. 일단 96 웰 플레이트가 지지 블록에 고정되고 경화 가능한 호일 씰로 덮입니다.

밀봉 버튼을 터치합니다. 트레이가 닫히고 가열 천장이 시작됩니다. 히트 씰링이 완료되면 도어가 자동으로 열립니다.

히트 블록에서 플레이트를 제거한 다음 히트 블록을 제거합니다. 함몰부를 확인하여 플레이트의 모든 우물이 밀봉되어 있는지 확인하십시오. 호일은 각 우물에서 쉽게 볼 수 있습니다.

밀봉이 완료되면 플레이트는 열 순환을 위한 준비가 된 것입니다. 프로토콜 텍스트에 자세히 설명된 파라미터에 따라 기존 PCR 증폭을 수행합니다. 일단 액적에서 핵산 표적의 PCR 증폭이 완료됩니다.

다음 단계는 두 가지 색상 감지 시스템을 사용하여 각 액적을 개별적으로 분석하는 것입니다. 일반적으로 액적 리더 기기는 FAM 및 VIC 리포터 플루오로 4개를 검출하도록 설정되어 있습니다. 클릭 플러시 시스템을 사용하여 액적 리더를 프라이밍하고 D-D-P-C-R 분석을 준비합니다.

플레이트를 액적 판독기에 넣고 시작을 클릭합니다. 물방울 판독이 완료되면 도어를 열고 장치에서 플레이트 홀더를 제거하십시오. 제거하다. 홀더에서 96 벽판을 제거하고 폐기합니다.

그런 다음 프로토콜 텍스트에 설명된 대로 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 DNA 돌연변이 프로파일링을 수행합니다. 이 D-D-P-C-R 분석에서 RAF V 600 E 돌연변이가 연구되었습니다. 형광을 검출하여 2차원 산점도 표시로 처리했습니다.

적절한 게이트를 그리기 위해 맞춤형 소프트웨어를 사용했으며 각 게이트 내의 액적 수를 계산했습니다. 모든 샘플에 대해 분홍색 컷오프 라인 위에 파란색 점으로 표시되는 방울은 양성입니다. 돌연변이된 RAF V 600 E 야생형 브래지어 방울의 경우 두 플롯 모두에서 녹색 점으로 표시됩니다.

하단의 회색 점은 형광 배경으로 간주됩니다. 그런 다음 전체 돌연변이 대립유전자 빈도는 한 학기에 검출된 야생형 브래지어 및 브라브 V 600 E 템플릿 농도의 상대적 백분율을 기반으로 계산되었습니다. 개별 분석을 통한 HR은 이 자세에 따라 4시간 이내에 수행할 수 있습니다.

A PPT 액체 생검과 같은 다른 샘플은 암 진행 모니터링과 같은 추가 질문에 답하기 위해 수행 할 수 있습니다. 이 기술은 동반진단(companion diagnostics) 분야의 연구자들이 분자 종양학 분야에서 다양한 돌연변이 검출을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 특정 지점, 즉 DNA 돌연변이 검출을 위해 조직 준비 시스템과 디지털 액적 P-C-R-S-A를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.