막 효소 용매 역학에 의해 유도 탈피 엔트 속도 가속

효소에있는 물 분자의 수송 채널은 활성 부위 매화 및 촉매 작용에 영향을 미친다. 여기에서 우리는 실리 컴퓨터 모델링 및 실험에 기초하여 다음과 같은 추가 촉매 주제의 엔지니어링을위한 프로토콜을 제시한다. 이 효소의 촉매 작용에 용매 역학의 영향에 대한 우리의 이해를 향상시킬 것입니다.

이 학제간 프로토콜의 전반적인 목표는 효소 촉매에 대한 용매 역학의 영향에 대한 근본적인 이해를 향상시키는 것입니다. 이 방법은 바이오 촉매 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 용매 재편성이 효소 역학 및 촉매를 구동하는 방법과 같습니다.

이 기술의 주요 장점은 특이성, 활성 및 열역학에 영향을 미치는 터널 또는 물 수송의 동기를 엔지니어링할 수 있다는 것입니다. 이 방법의 시각적 시연은 매우 중요한데, 학제간 단계는 과학의 여러 하위 분야를 연결하기 때문에 배우기 어렵기 때문입니다. 시작하려면 단백질 데이터뱅크(Protein Databank)에서 관심 단백질의 PDB 구조를 다운로드합니다.

YASARA의 세포 중화 및 pkA 예측 실험을 사용하여 과도한 subunit을 제거한 다음 명시적 용매인 누락된 수소 원자를 추가하여 구조를 준비합니다. 멤브레인 결합 트리테르펜 시클라제의 경우 워터박스의 적절한 치수는 91 x 67 x 77 옹스트롬입니다. 촉매 활성 아미노산의 양성자화 상태를 수동으로 조정합니다.

AMBER 역장 제품군을 사용하여 energy minimization 명령으로 구조를 최소화합니다. 입자 메시 ewald 접근 방식을 사용하여 장거리 정전기 상호 작용을 고려합니다. 표준 설정에 따라 van der Waals의 상호 작용에 대한 컷오프를 설정합니다.

시뮬레이션된 어닐링 및 분자 역학에 따라 edit, delete, residue 명령을 사용하여 모든 물 분자와 최종 리간드 기질을 삭제하여 시뮬레이션 스냅샷을 복구합니다. 중첩 개체 명령을 사용하여 원래 PDB 구조에 각 스냅샷을 개별적으로 중첩하여 모든 구조체가 동일한 공간 위치를 공유하도록 합니다. 파일, 다른 이름으로 저장, PDB 명령을 사용하여 이러한 방식으로 준비된 각 스냅샷을 새 PDB 파일로 저장합니다.

준비된 스냅샷을 소프트웨어 CAVER 3.0에 대한 입력으로 사용합니다. 텍스트 프로토콜에 표시된 매크로를 사용하여 CAVER 3.0에 의해 생성된 터널을 분자 그래픽 소프트웨어 프로그램에서 시각화합니다. CAVER 3.0 소프트웨어에서 생성된 출력 요약 텍스트 파일에 나열된 헤더 ID"에 따라 가장 높은 순위의 터널을 식별합니다.

얻은 모델을 사용하여 육안 검사를 통해 수로 내부를 가리키는 작은 측쇄를 표시하는 가장 높은 등급의 터널을 감싸고 있는 아미노산을 식별합니다. 스왑 잔류물 명령을 사용하여 증가된 입체 방해로 터널을 차단하는 단일 아미노산 치환을 식별합니다. 터널이 육안 검사로 막혔는지 확인한 다음 지금까지 프로토콜을 반복

여기서, 도입된 트립토판은 자홍색으로 표시되고, 교환된 세린은 비교를 위해 표시됩니다. 텍스트 프로토콜에 나열된 대로 인산칼륨-인산칼륨, 재부유 완충액, 세제 완충액 및 반응 완충액을 준비합니다. 스쿠알렌-호픈 시클라제(squalene-hopene cyclase) 또는 pH 최적치가 더 낮은 기타 막 결합 효소의 경우, 시트레이트 함유 재현탁액(resuspension buffer)을 사용하십시오.

유리 비커에 담긴 냉동 세포 펠릿의 무게를 잰다. 균질화기를 사용하여 최종 농도 0.3 gram-cells/milliliter까지 resuspension buffer에 세포를 재현탁합니다. 그런 다음, 80 %의 진폭과 1 초의 펄스를 켜고 1 초를 끄는 초음파로 재현 유 된 세포를 용해시킵니다.

각각 50초씩 세 번의 반복 주기를 사용합니다. 세제 완충액을 최종 농도 0.2%%에 추가합니다. 평형을 이루고, 끝에서 끝으로 혼합하여 섭씨 4도에서 1시간 동안 평형을 이룹니다.

39, 000 GS에 단 하나 원심분리 단계 후에 상등액을 저장해서 4 섭씨 온도에 50 분 동안, 막단백질 조각을, 재기하십시오. 반응 완충액에 기질의 신선한 5 밀리몰 스톡 용액을 만듭니다. 2-5 분 동안 30 % 진폭에서 초음파로 균일 한 에멀젼을 얻습니다.

다음으로, 원하는 반응 온도에서 ThermoMixer를 평형화합니다. 외부 온도계로 물이 들어있는 유리병 내부의 온도를 확인합니다. 단일 기판 동역학의 경우, 유화된 기판을 최소 5개의 유리 바이알로 희석하여 동일한 최종 기판 농도로 만듭니다.

ThermoMixer에서 유리 바이알을 10분 동안 사전 배양합니다. 효소를 첨가하여 반응을 시작합니다. 1 밀리리터의 총 반응 부피가 적합합니다.

최소 1200RPM의 흔들림 속도를 사용하십시오. 100마이크로몰 데칸올을 적분 표준물질로 스파이크한 500마이크로리터의 에틸 아세테이트를 첨가하여 다른 시점에서 반응을 중지합니다. 와류를 치고 1분 동안 유리 바이알을 수동으로 격렬하게 흔들어 반응 혼합물을 추출합니다.

그런 다음 9, 600g의 유리 바이알을 탁상용 원심분리기에서 실온에서 10분 동안 원심분리합니다. 최상층을 빈 튜브로 옮깁니다. 반응 튜브에 500마이크로리터의 추출 용매를 추가로 추가하고 추출 절차를 반복합니다.

추출된 반응 혼합물을 황산나트륨으로 건조시킵니다. 5초 동안 소용돌이치고 튜브를 10분 동안 그대로 둡니다. 테이블탑 원심분리기를 사용하여 실온에서 1분 동안 9, 600gs에서 최종 원심분리 단계를 수행합니다.

그런 다음 추출된 샘플을 가스 크로마토그래피 또는 GC 바이알로 옮깁니다. 단일 기질 역학에 대해 기질의 최소 4가지 다른 초기 농도를 사용하고 단일 기질 및 경쟁 역학에 대해 4가지 다른 온도를 사용하여 관심 있는 각 효소 변형에 대해 절차를 반복합니다. GC 분석을 수행한 후, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 적분 표준물질의 영역을 활용하여 제품의 피크 영역을 적분하고 생성물 피크 영역을 해당 제품 농도로 변환합니다.

반응 시간 대비 각 생성물의 농도를 표시합니다. 10% 미만의 변환에 해당하는 데이터 포인트의 선형 회귀를 수행합니다. 초기 반응 속도는 적합선의 기울기에 의해 제공됩니다.

여러 기질이 있는 one-pot relative kinetics의 경우, 시간 경과에 따른 순환 반응에 따라 텍스트 프로토콜에 나열된 방정식을 사용하여 Km 값에 대한 상대적 겉보기 K-cat을 얻습니다. Km 값에 대한 겉보기 K-cat의 온도 의존성에 대한 용매 재구성의 영향이 표시됩니다. 다음은 전이 상태 이론을 사용한 열역학 분석의 대표적인 결과와 단일 기판 동역학에 대한 전이 상태 이론 방정식에 대한 실험 데이터의 선형 적합입니다.

실험적 열역학 분석에서 얻은 활성화의 열역학적 매개변수에 대한 용매 역학의 영향은 상당합니다. 손상된 물 채널을 가진 효소 변이체는 여기에서 볼 수 있듯이 상대적 활성화 엔트로피와 엔탈피의 복잡한 변화로 인해 발생하는 근본적으로 다른 기질 특이성을 나타냅니다. 개발 후, 이 기술은 바이오 촉매 분야의 연구자들이 현재 잘 이해되지 않고 있는 효소 역학 및 촉매 작용을 촉진하는 물의 역할을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.