Name: 막 효소 용매 역학에 의해 유도 탈피 엔트 속도 가속 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: 학습하세요 효소 촉매에서 용매 역학의 영향을 이해하기 위해 분자 동역학 시뮬레이션과 CAVER 3.0을 활용한 계산 생물학적 접근법을 사용하는 방법을. 이 기법은 생물촉매 연구에서 물 수송 채널 설계를 통해 효소 활성과 특이성을 최적화하는 데 필수적인 통찰을 제공합니다.

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스웨덴 연구 위원회(VR)는 젊은 연구자 보조금 #621-2013-5138을 통해 이 작업에 대한 재정적 지원을 크게 인정받았습니다. KTH Royal Institute of Technology의 PDC Center for High Performance Computing은 컴퓨팅 지원을 제공하는 것으로 인정받고 있습니다.

(1)에 실리 컴퓨터 모델링 <ol><li> 단백질 데이터 은행 (PDB)에서 관심의 단백질의 PDB 구조를 다운로드합니다. 과량의 서브 유닛을 분리 한 후 &quot;셀 중화 및 P K 예측&quot;YASARA 16의 실험을 사용하여 누락 된 수소 원자는 명시하고 용매를 첨가함으로써 구조체를 준비한다. 막 결합 된 트리 테르펜 cyclases 들어, 워터 박스의 적합한 사이즈 91x67x77 Å이다. 수동으로 촉매 활성 아미노산의 양성자 상태를 조정합니다. 참고 : PDB 파일의 기판 아날로그 &quot;편집 | 교환 | 아톰&quot;을 사용하여 실제 기판에 수정 될 수 있습니다 필요한 경우 명령을. </li><li> 황색 포스 필드 스위트 (17)를 사용하여 &quot;에너지 최소화&quot;명령에 의해 구조를 최소화합니다. 장거리 정전 기적 ​​상호 작용을 고려하여 입자 메시에 발트 방식 (PME) (18)를 사용합니다. 따라서 반 데르 발스 상호 작용에 대한 차단을 설정표준 설정. 주 : 수렴에 도달 할 때까지 &quot;에너지 최소화&quot;명령 다음 짧은 최대 경사 최소화, 시뮬레이트 어닐링에 의해 구조적 응력 제거 (시간 단계 2 FSEC 0.9 매 10 번째 단계에서 축소 원자 속도)이 수행된다 (즉, 에너지의 향상 ) (200) 단계에서 원자 미만 0.012 킬로 칼로리 / 몰. </li></ol> 활성 부위 매화와 물 접근 2. 모델 <ol><li> 모의 어닐링 후, 20 NSEC 분자 역학 (MD) 궤도를 실행하고 &quot;파일 | 저장 | 시뮬레이션 스냅 샷&quot;적어도 10 스냅 샷을 생성 &quot;시뮬레이션&quot;다음 명령을 실행합니다. 정규 앙상블에서주기적인 경계 조건으로 표준 컴퓨터 시뮬레이션을 실행합니다. Berendsen의 온도 조절기를 사용하여 298 K의 온도를 유지한다. </li><li> 모든 물 분자와 최종 리간드 / 기판을 사용하여 삭제하여 2.1에서 얻은 스냅 샷을 준비4; 수정 | 삭제 | 중첩 잔류 &quot;에 의해 원래의 PDB 구조에 개별적으로 명령 중첩 각각의 스냅 샷.&quot;| 개체 &quot;명령은 모든 구조가 동일한 공간 위치를 공유 할 수 있도록 새로운 PDB로이 방법으로 제조 된 각각의 스냅 샷을 저장합니다. - 파일 (사용 &quot;파일 | 다른 이름으로 저장 | PDB&quot;명령). 경험 모델러의 경우 : 참고 : 보조 코드 파일 1에 주어진 템플릿에 따라이 프로세스를 자동화하는 스크립트를 작성합니다. </li><li> 소프트웨어 동굴 탐험가 3.0 (19)에 입력으로 3D 공간에 정렬 된 2.2에서 준비된 스냅 샷 (PDB)를 사용합니다. 스냅 샷의 제한된 수의 분석을 위해, 표준 컴퓨터를 실행 동굴 탐험가. 물 분자의 수송에 특이 터널의 검출을 보장하기 위해 0.7 Å (19)의 반경 프로브를 사용한다. </li><li> 분자 그래픽 소프트웨어에 의해 생성 된 동굴 탐험가 3.0 터널을 시각화. 터널의 쉬운 시각화를위한, 보충 코드 필에 표시된 매크로를 사용전자 2. </li></ol> 실리 효소 공학 3. 물 패턴 및 물 역학을 수정하는 방법 <ol><li> 동굴 탐험가 3.0 소프트웨어에서 생성 된 출력 파일 &quot;있는 Summary.txt&quot;에 나열된 헤더 &quot;ID&quot;에 따라 가장 높은 순위 터널을 식별합니다. </li><li> 가장 높은 순위 터널 (3.1)과 그 디스플레이 (2.4에서 얻은 모델을 사용) 육안 검사로 채널 내부를 가리키는 작은 사이드 체인을 감 아미노산을 확인합니다. &quot;스왑 잔류&quot;명령을 사용하여 증가 입체 장애에 의한 터널을 차단 하나의 아미노산 치환을 확인합니다. 터널이 단계 프로토콜의 1.2-3.1를 반복하여 다음 육안 검사에 의해 차단되고 있는지 확인합니다. </li></ol> 변이 유전자의 4 식 <ol><li> 겹치지 20 프라이머를 사용하여 PCR 돌연변이 유발 야생형 유전자에 돌연변이를 도입. </li><li> 튜브 관심 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA를 추가적합한 클로닝 균주의 적격 세포와의 30 분 동안 얼음 위에서 배양한다. 42 ° C로 설정 온도와 수조에서 45 초 동안 열 쇼크 형질 전환을 수행한다. 신선한 풍부한 매체의 500 μl를 추가 (2YT는, 16g / L의 트립 톤, 10g / L 효모 추출물, 5g / L의 NaCl)과는 37 ° C에서 부화, 45 분 동안 200 rpm으로. 적절한 항생제로 보충 한천 접시에 형질 전환 된 세포를 도금을 선택합니다. </li><li> 돌연변이 유전자의 DNA 서열을 확인한 후, 전술 한 바와 같이 열 쇼크를 사용하는 발현 균주에 플라스미드 DNA를 변형. 막 결합 트리 테르펜 cyclases의 발현을 위해, BL21 (DE3)를 사용합니다. </li><li> 적절한 항생제로 보충 2YT 미디어에서 발현 균주의 37 ℃에서 5 ML의 O / N 문화를 시작합니다. </li><li> 0.05-0.09의 최종 OD에, 적절한 항생제로 보충 300 ml의 2YT 미디어를 포함, 2 L 당황 쉐이크 플라스크에 접종 (600 nm에서 측정). 0.6-0의 외경에서 유도 한 후.도 8 및 단백질 발현, -80 ° C에서 세포 펠렛을 동결 및 저장. <ol><li> pD861 벡터에 막 결합 트리 테르펜 cyclases 들면, 단백질 (21)의 높은 수율을 달성하기 위해, 37 ℃에서 0.5 mM의 발현 시간이 람 노스 2 및 4로 유도한다. </li></ol></li></ol> 일반 원심 분리기 및 단백질 정제를 사용하여 5 막 추출 <ol><li> 다음의 버퍼를 준비한다 재현 탁 완충액 (100 mM의 인산 칼륨을, 프로테아제 억제제 정제로 보충 된 pH를 7.5), 세제 완충액 (1 % (v / v) 트리톤 X-100, 50 mM의 인산 칼륨, pH를 7.5) 및 반응 완충액 (0.2 % 트리톤 X-100, 50 mM의 인산 칼륨, pH를 7.5). <ol><li> 스쿠알렌 hopene의 cyclases 또는 낮은 pH 최적 다른 막 결합 효소, 시트르산 완충액에 재현 탁 인산 칼륨을 대체. 세제 완충액 (1 % 트리톤 X-100 : 효소에 대해 다음 버퍼를 사용60 mM의 시트 레이트, 산도 6.0)과 반응 버퍼 (0.2 % 트리톤-X 100, 60 mM의 시트 레이트, pH를 6.0). 주의 : 그 태그는 정제를 위해 사용되는 경우, 20 mM의 이미 다졸 (최종 농도)로 재현 탁 버퍼를 보충. </li></ol></li><li> 유리 비커에서 냉동 된 세포 펠렛의 무게. / ㎖ 0.3 g 세포의 최종 농도로 재현 탁하여 균질화 완충액에 세포를 재현 탁. 80 %의 진폭에 1 초 1 초 오프 펄스 초음파로를 Lyse은 재현 탁 세포. 50 초 각의 세 가지 반복주기를 사용합니다. </li><li> 0.2 % (v / v)의 세제의 최종 농도 세제 버퍼를 추가한다. 1 시간 동안 4 ℃에서 혼합 엔드 오버 엔드에 의해 평형. 4 ° C에서 50 분 동안 39,000 XG에 하나의 원심 분리 단계 후에 뜨는을 저장하여 막 단백질 부분을 복구 할 수 있습니다. 참고 : 그의 태그 정제를 사용하는 경우, 아가로 오스 / g 세포를 1.5 ml의 니켈 NTA를 추가로 1 시간 동안 배양한다. </li><li> 첫 번째 정화를 수행이온 교환 또는 그의 태그 정화 (21) 중 하나에 의해 단계. 0.2 % 트리톤 X-100 평형 및 용출 버퍼를 보충합니다. 정제 된 단백질 10 kDa의의 차단과 원심 필터 유닛을 사용하여 다섯 번 집중. 주 : 세제 농도 트리톤 X-100 미셀 결과의 크기를 약 1 %의 최종 농도. </li><li> . (2) 106 × 10 × 4 -8의 구상 단백질 분획 범위와 호환 농축 단백질 및 매트릭스를 사용하는 겔 여과에 의해 정제 연마 공정을 마무리 버퍼를 실행하는 것과 반응 완충액을 사용한다. 제조사의 프로토콜에 따라 브래드 울트라 키트를 사용하여 정제 된 단백질의 양을 측정한다. </li></ol> 6. 속도론 <ol><li> 반응 버퍼에 기판의 신선한 5 밀리미터 주식 솔루션을 확인하십시오. 2-5 분 동안 30 %의 진폭에 초음파에 의한 균일 한 에멀젼을 얻습니다. </li><li> 써모 평형원하는 반응 온도. 외부 온도계로 유리 바이알 함유 물 내부의 온도를 확인한다. </li><li> 단일 기판 속도론을 위해, 동일한 최종 기질 농도에 적어도 다섯 유리 바이알에 유화 기판 희석. <ol><li> 여러 기판 한 냄비 상대적으로 반응 속도, 각 유리 병에있는 모든 기판을 혼합하여 적어도 5 개의 동일한 유리 병을 준비합니다. 소수성 트리 테르펜를 들어, 10 내지 200 μM의 범위의 최종 기질 농도를 사용한다. </li></ol></li><li> 10 분 동안 써모 유리 바이알을 Preinc​​ubate. 효소를 첨가하여 반응을 개시. 1 ml의 총 반응 부피가 적합하다. 적어도 1,200 rpm의 진동 속도를 사용합니다. </li><li> 500 ㎕의 에틸 아세테이트를 첨가하여 서로 다른 시점에서 반응을 정지 통합 표준 100 μM의 데칸으로 스파이크. </li></ol> 7. 추출 및 열역학적 분석 <ol><li> 에 의해 반응 혼합물을 추출텍싱 수동으로 1 분 동안 격렬하게 유리 병을 흔들어. 실온에서 10 분 동안 테이블 상단 원심 분리기에서 9,600 XG에 유리 튜브를 원심 분리기. 빈 튜브 상단 층 (유기상)를 전송합니다. 반응 튜브에 추출 용매의 추가의 500 μl를 첨가하고 추출 과정을 반복한다. </li><li> 나 2 SO 4와 추출 된 반응 혼합물을 건조. 5 초 동안 소용돌이 및 튜브 10 분 동안 휴식을 할 수 있습니다. 테이블 탑 원심 분리기를 사용하여 실온에서 1 분 동안 9,600 XG에서 최종 원심 분리 단계를 수행합니다. 가스 크로마토 그래피 (GC) 바이알로 추출한 샘플을 전송. </li><li> (단일 기판 역학에 대한) 기판의 적어도 네 가지 초기 농도 (단일 기판과 경쟁력 역학 모두) 네 개의 서로 다른 온도를 사용하여, 관심있는 각각의 효소 변형에 대한 6.1-7.2 아래의 단계를 반복합니다. </li><li> 이전에 3 설명한 바와 같이 GC 분석을 수행합니다. hydrophob의 분석 비극성 열을 사용IC 펜타 제품. 제품 및 열에 따라, 120 ℃로 오븐 초기 온도를 5 ℃ / 분의 온도 구배를 사용한다. </li><li> 생성물 (들)의 피크 면적을 통합하여 (100 μM에 상당)의 통합 표준의 영역을 이용하여 해당 제품 농도 제품에 피크 면적을 변화. 반응 시간 (t) 대 각 제품 ([P])의 농도를 플롯. 10 % 미만의 전환에 대응하는 데이터 포인트의 선형 회귀 분석을 수행한다. 초기 반응 속도 (0 V)에 따라 장착 직선의 기울기에 의해 주어진다 : <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/53168/53168equation1.jpg" /> 참고 : 여러 개의 기판을 하나의 냄비 상대적으로 반응 속도를 들어, V 0는 다른 기판의 영향으로 특정 기판의 초기 속도입니다. </li><li> 단일 기판 속도론, 플롯 V 0 </su해당 기질 농도에 대한 B&gt; / [E]. 겉보기 K 고양이 / K M 값에 따라 그래프의 직선 부분의 기울기에 의해 주어진다 : <img alt="식 (2)" src="/files/ftp_upload/53168/53168equation2.jpg" /> [S]는 기질과의 농도는 [E] 변태. K 고양이에 사용되는 효소의 농도 / K M은 미카엘 상수 위에 촉매 상수 동일시. 각각의 온도와 각 효소 변형에 대한 분석을 반복합니다. </li><li> 단일 기판 속도론 들어, 전이 상태 (22)의 이론에 따라 열역학적 분석을 수행 <img alt="식 (3)" src="/files/ftp_upload/53168/53168equation3.jpg" /> K B는 볼츠만 상수, H 플랑크 상수, T 켈빈 온도이며, 기체 상수를 R. K ((LN의 플롯의 선형 회귀 분석을 수행 <sUB&gt; 고양이 / K M) / ((K B 형 *의 T) / H))) 1 / T 대. 활성화 엔탈피 (Δ H ‡) (-slope가) * R 및 활성화 엔트로피 (Δ S ‡)을 (차단) * R에 의해 주어진다에 의해 주어진다. 주 : 마찬가지로, 포화 기질 농도 하에서 분석 수학 식 3에서 일정한 속도로 K 고양이를 사용하여 수행 될 수있다. </li><li> 복수의 기판을 하나의 냄비 상대 동력학 들어 상대적인 겉보기을 구하는 K 고양이 / 23에서 K M 값 : (K 고양이 / K M) / (K 고양이 / K M) B = V 0, A / V 0, B * [B] / [A] (4) 이는 V 0,는 기판과 경쟁 B. 기판에 대한 초기 레이트를 의미 </li><li> 한 냄비 상대 기의 경우다수의 기판과 동력학은 비선형 회귀 분석에 의해, 같은 기준에 비해, B의 활성화의 상대적 열역학적 파라미터를 구하십시오 <img alt="식 (5)" src="/files/ftp_upload/53168/53168equation5.jpg" /></li><li> 활성화 엔탈피 및 참조 화합물의 엔트로피로부터 기판 B에 대한 절대 기동 파라미터를 계산 : <img alt="식 (6)" src="/files/ftp_upload/53168/53168equation6.jpg" /></li></ol>

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야생형 막 효소 및 터널 변형 고품질의 실험 열역학 데이터를 달성하는 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 컴퓨터 모델의 1) 발생; 2) 균일하게 정제 된 단백질; 3) 유화 기판 주식; 4) 반응 속도 동안 온도 제어; 내부 표준 물질을 사용하여 반응 혼합물의 5) 추출. 컴퓨터 모델의 생성은 매우 다양한 플랫폼을 지원하는 사용자 친화적 인 인터페이스와 소프트웨어의 사용에 의해 용이하게된다. 따라서,이 프로토콜은 심지어 비 전문가를 모델링에 대한 우리의 전략에 액세스 할 수 있도록하기 위해 YASARA 모델링 스위트 (16)과 같다. 물 터널 식별을위한 컴퓨터 모델은 이상적으로 관심 (24)의 효소의 결정 구조에 기초한다. 이 목적을 위해, 단백질 데이터 뱅크에서 사용할 결정 구조의 부 매우 유익하다. 우리의 경험, TEM의 성공적인 준비의 핵심 측면에서터널 식별 판은 결정 물을 유지하는 것입니다. 그것은 보통 컴퓨터에서 실행될 수있는 분자 동력학 시뮬레이션을 수행 할 때 용해 효소 상자를 사용하여 동일한 중요하다. Alicyclobacillus의 acidocaldarius에서 트리 테르펜 시클 라제는 MD 시뮬레이션 3 중 물에 안정적이다. 그러나, 결정 세제를 유지 및 / 또는 세포막을 이용하여 모방 아마도 확장 MD 시뮬레이션을 허용 할 가능성이 불안정 효소 요구 될 것이다. 이것이 터널 조직의 역학적 특징을 포착하지 않을지라도 매우 어려운 대상 최소화 결정 구조, 프로토콜을 사용하는 중요한 기계적 통찰력을 제공 할 수있는 것이 구상된다. 단일 또는 입력으로 스냅 제한된 수의 기본 모드의 동굴 탐험가 (19)는, 표준 노트북, 비전문가에 의해 사용될 수있다. 경험 3 병목 반경 터널 (즉, 반경에 기초가장 좁은 지점에서)보다 작은 1은 결정 물 분자가 왼쪽 가운데), 예측 터널 (그림 1 내에 상주 특히, 물에 매우 관련이있을 수 있습니다. 한편, 큰 병목 반경과 활성 부위 (10)의 밖으로 상기 기판의 반송을위한 터널을 의미 할 수있다. 보충 공전 스크립트 2 예측 터널 시각화 비전문가에 의해 사용될 수있는 파일. 미래의 실험은 동성 모델은 물 네트워크 및 역학의 원자 론적 연구 할 수 있도록 충분히 높은 해상도 수 있는지 여부를 발표 할 예정. 와 활성 부위에 존재하는 리간드없이, 분자 동력학 시뮬레이션을 수행하는 방법에 빛을 발산, 터널 식별 과정도 중요한 영향을 미치는 것이다. 막 단백질의 속도론은 만만치 않은 도전 (25)를 구성 할 수 있습니다. 프로토콜은 본원 단순한 멤브레인 추출 프로토콜에 기반초 원심 분리기 등으로 고가 장비를 사용하지 않고 막 효소를 얻었다. 마감 연마 스텝과 같은 겔 여과의 사용은 잠재적 잔류 막의 입자를 제거하고, 적합한 세제 환경 (25)을 형성 가능하다. 운동 프로토콜에서 재현 결과를 달성하는 중요한 양태는 초음파에 의해 기판 ​​스톡 용액을 유화이다. 반응 버퍼에 희석 소수성 기판의 간단한 볼텍스 불균일 한 기판 세제 혼합물을 제공합니다. 비 유화 기판 솔루션의 피펫 팅 초기 속도의 정확한 결정을 방지 (정량 GC에 의해 확인) 재생 불가능한 농도에 이르게. 대조적으로, 적절하게 유화 스톡 용액은 피펫 0.98에서 0.99 사이의 범위에있는 R 2 초기 속도의 선형 회귀 분석을 초래한다. 소수성 기판의 또 다른 중요한 측면은 명백하다 기판 용해도및 기판 세제 혼합물 가능. 실제로, 기준 기판과 스쿠알렌 사이 클라 트리 테르펜을 포화시킬 수 없었다. 이러한 이유로 명백한 K 고양이를 들어 / K M 값이 모두 결합 화학의 기여를 포함 할 수있는 여기에 표시됩니다. 그러나, 화학 K 고양이에 대한 속도 제한이 있음을 보여왔다 / 트리 테르펜 cyclases 3 실시한 polycyclization 캐스케이드에 대한 K M. 이것은 외부 온도계 반응 유리관 내부 실제 온도를 확인하기 위해 높은 중요하다. 그럼에도 불구하고, 선형 맞는 서로 다른 온도에서 필수적인 상수 명백한 K 고양이 / K M 값이 변형에 대한 가난한 될 수 있습니다. 이 제로 (그림 2B 및 2C)에 가까운 활성화 엔탈피와 S168F 변종 여기에 (그림 2A)에 대해 강조한다. 매우에 작은명백한 K 고양이의 L 온도에 의존 변경 / K M은 관찰 활성화 엔트로피의 불확실성을 유도 할 수 Δ S ‡ (즉,도 2b에서 선형 그래프의 절편). 원칙적으로, 관측 활성화 엔트로피는 단백질 농도를 측정하여 검출되지 않을 다른 변종 활성 효소의 다른 풍부에 의해 영향을받을 수있다. 이는 한 포트에 여러 기질을 혼합 할 때의 실험 오차가 감소되는 것으로 기대된다. 모든 다른 기판들이 이러한 상황에서 효소의 동일한 양 (수학 식 4)와 상호 작용하기 때문이다. 추출 용매의 사용은 내부 표준 추출 및 / 또는 주입 동안에 GC의 차이를 고려하는 것이 중요하다 타서. 전이 상태 이론 성공적 효소 학 (26)에 사용되어왔다. 이 중요한 이론적 프레임 워크는 원래 해제되었습니다기상에 단 분자 반응에 이미 개발. 그러나, 효소가 주로 고전적 활성화 에너지 장벽 (26)을 낮춤으로써 작업 것으로 밝혀졌다. 하나 본원로 가정 투과 계수는 측정 된 활성화 엔탈피 및 / 또는 엔트로피 영향을 미칠 수있다. 터널링의 기여, 및 전이 상태의 다시 교차와 같은 다른 비 전통적인 효과는 대략 에너지의 약 4 킬로 칼로리 / 몰에 해당하는 촉매 (26)에 1,000 배에 기여할 수있다. 그것은 (328 K,도 2c에서 16 킬로 칼로리 / 몰) 야생형 효소에 의해 표시 활성화 엔트로피 불균일 투과 계수에 의한 이러한 비 - 고전적인 효과보다 훨씬 큰 것을 알 수있다. 프로토콜을 이용하여 야생형 및 변이체 터널 용 활성화 열역학적 파라미터를 비교할 때 전달 계수의 영향은 감소한다. 활성화의 깁스 자유 에너지 (Δ G ‡)는 COMPO입니다enthalpic (Δ H ‡) 및 엔트로피 모두의 SED (- T의 * Δ의 S의 ‡) 용어. 촉매 동안 효소 용매 재구성은 두 매개 변수에 영향을 미칠 수있다. 본 프로토콜은 필요한 생물 물리학 실험 프레임 워크와 관련과 실리에서 사용자 친화적 인 계산 도구의 도구 상자를 조립하여 이러한 현상의 연구를 촉진 할 것으로 예상된다. 방법은 막 결합 효소에 의해 촉매를 포함한 효소 공정의 과다를 연구하는데 유용 할 것으로 예상된다.

물은 생명 1의 화학에 대한 초석을 구성한다. 물 패턴 및 효소 활성 부위의 매화는 엔탈피 및 소수성 효과 2,3- 넘어 연장되는 매우 복잡한 형태로 촉매 1, 2 및 3을 리간드 결합 엔트로피 모두에 영향을 미친다. NMR (4)는도 2 및 열량 용해 단백질의 분자 모델링은 리간드 연관 5-8, 특이 활성 2,9,10위한 구동력을 제공하는 명시적인 물 분자의 역할을 밝혀하는데 사용되어왔다. 여기서 우리는 효소 촉매 반응에 용매 변위 열역학적 영향 (도 1)의 실험적인 평가에 고유 방법론을 제시한다. 우리의 결합 된 전략은 효소 공학, 열역학 분석 (그림 1)과 협력하여 컴퓨터 시뮬레이션을 사용하여 기반으로합니다. 이 CATA에 용매 역학의 영향에 대한 추가 빛을 발산 수 있습니다현재 제대로 이해되고 용해,. 용해 효소 활성 부위에 물 매개 수소 결합에 의해 제공 enthalpic 상호 작용을 안정화 엔트로피 처벌 1만큼 오프셋 될 수있다. 5 부피의 물에 비하여 비용이 엔트로피 단백질 캐비티 내에 갇힌 물 분자에 의해 표시 자유도의 감소와 연관된다. 정렬 된 물 분자의 분리 따라서 리간드 연관 (1)과 (3) 촉매에 대한 엔트로피 구동력을 제공 할 수있다. 용매 역학의 핵심은 단백질의 내부와 외부 사이의 용제 4 물 분자의 변위이다. 활성화 에너지, 엔탈피, 엔트로피 (11)에 첨부 변화는 완전히 분자 수준에서 이해되지 않습니다. 활성 효소에 물 수송, 용매 역학의 중요성과 기여도에 대한 책임 개별 터널을 방해함으로써에너지는 (그림 1) 평가 될 수있다. 또한, 상이한 온도에서 한 냄비 동역학 실험을 수행하여, 몇 개의 기판들의 상대적인 열역학적 활성 파라미터 실험 감소 된 수 (도 1, 오른쪽)에서 추출 될 수있다. 우리의 학제 방법은 생활 (12)에 대해 높은 중요도의 다환 테르펜을 생성 복잡한 막 결합 트리 테르펜 시클 라제 효소에 대한 검증됩니다. 프로토콜은 표준 원심 분리기를 이용하여 세포막 단백질의 높은 양 (10 내지 20 ㎎ / ℓ)의 회복을 허용한다. 효소를 물에 전개되지만, 촉매 작용을 촉진하는 용매의 역할은 일반적으로 무시한다. 형상은 전이 상태 (15)와 정전기 상보성 활성 부위를 미리 편성 역학 13,14 단백질 외에도, 물 역학 효율적인 효소 촉매 높은 중요 할 수있다. 여러 학제 기술을 단조하여, 우리의목표는 물 역학과 열역학의 매우 복잡한 연구를 촉진하는 것입니다. 과학계에이 도구는 더 접근 할 수 있도록하는 것은 변경된 활동과 특이성에 대한 효소 공학 및 단백질 설계에 새로운 전략의 발전으로 이어질 것입니다.

<table><tbody><tr><td>YASARA</td><td>YASARA Biosciences</td><td>http://www.yasara.org/</td> <td>분자 모델링 및 시뮬레이션 프로그램&nbsp;</td></tr><tr><td>동굴 탐험가&nbsp;</td><td>CaverSoft</td><td>http://caver.cz/</td> <td>단백질의 터널 분석을 위한 도구, 학술용 무료 라이선스</td></tr><tr><td>Bradford Ultra</td><td>Expedeon</td><td>BFU1L, BFU05L</td><td>최대 1% 세제를 포함하는 용액의 단백질 정량</td></tr><tr><td>Potter-Elvehjem 균질화</td><td>VWR</td><td>432-0205, 432-0217</td><td>냉동 세포 펠릿</td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일 정제</td>의 균질화 <td>Roche</td><td>4693159001</td><td>프로테아제 억제제</td></tr><tr><td>원심 필터 유닛</td><td>Millipore</td><td>UFC901008</td><td>단백질 농도를 위한 원심 필터 유닛, MWCO 10 kDa</td></tr><tr><td>Thermomixer&nbsp;</td><td>시료 배양을 위한</td> <td>Eppendorf</td><td>5382000015</td> Thermomixer</tr></tbody></table>

막 효소 용매 역학에 의해 유도 탈피 엔트 속도 가속

Unraveling Entropic Rate Acceleration Induced by Solvent Dynamics in Membrane Enzymes

효소 촉매는 수성 환경에서 진화했습니다. 그러나 촉매 작용에 대한 용매 역학의 영향은 현재 잘 이해되지 않고 일반적으로 무시되고 있습니다. 효소의 물 역학 및 관련 열역학적 결과에 대한 연구는 매우 복잡하며 컴퓨터 시뮬레이션, 핵 자기 공명(NMR) 실험 및 열량계가 포함되었습니다. 활성 현장을 주변 용매와 연결하는 수중 터널은 용매 변위 및 역학의 핵심입니다. 본 명세서의 프로토콜은 물 수송을 위한 이러한 모티프의 엔지니어링을 허용하며, 이는 특이성, 활성 및 열역학에 영향을 미칩니다. 이론과 실험에 기초한 생물물리학적 틀을 제공함으로써, 본 명세서에 제시된 방법은 컴퓨터 모델링 또는 생물물리학 화학에 대한 사전 전문 지식이 없는 연구자도 사용할 수 있습니다. 이 방법은 막힌 물 터널이 있는 효소 변이체에 의한 촉매 작용과 관련된 엔탈픽 및 엔트로피 변화를 측정하여 분자 수준에서 효소 촉매에 대한 이해를 발전시킬 것입니다. 이 프로토콜은 막 결합 효소 및 기타 복잡한 시스템의 연구에 사용할 수 있습니다. 이를 통해 촉매 작용에서 용매 재구성의 중요성에 대한 이해를 높일 수 있을 뿐만 아니라 단백질 설계 및 엔지니어링에서 새로운 촉매 전략을 제공할 수 있습니다.

효소 촉매 polycyclization 물 역학의 중요성은 실리코 분석 및 검출 터널 후속 시각화 (2 파일에 부가 코드 스크립트를 사용)하여 내포된다. 프로토콜 부 (3) 다음, S168은 Alicyclobacillus acidocaldarius에서의 트리 테르펜 시클 라제 효소의 하나의 터널 라이닝 &quot;핫 스폿&quot;아미노산 잔기 (도 1, 좌측 중간)로 발견된다. 육안 검사 (그림 1, 왼쪽 아래)에서와 같이 실리에 돌연변이 S168F를 도입함으로써, 터널이 막혔습니다. 트리 테르펜 시클 라제 효소에 의해 표시되는 환식 제품의 형성을위한 반응 속도는 온도 (도 2A)에 매우 민감하다. 프로토콜 (섹션 4-7)에 이어, 그것은 발견되는 명백한 K 고양이 / K 그 <su온도가 25 ° C (도 2A)에서 발생할 때, B&gt; 펜타 제품의 형성 야생형 효소에 의해 표시된 M은 fiftyfold을 증가시킨다. 단일 점 돌연변이를 도입하여 개별 터널 블로킹 실험적으로 결정된 절대 겉보기 K 고양이 / K M 값에 큰 영향을 가지며,뿐만 아니라 온도 의존성 (도 2A)에. 실험적으로 결정 운동 매개 변수에서, 선형 열역학 플롯은 식 (3)에 의해 단일 기판 반응 속도 (그림 2B)을위한 프로토콜의 섹션 6-7에 따라 생성됩니다. 차단 된 터널을 품고 변형 관찰 활성화 엔트로피와 엔탈피에 매우 큰 변화는 (그림 2B를 기반으로 그림 2C, 계산) 키 polycyclization 캐스케이드를 촉진 물 역학에 대한 역할을 의미한다. 그 위에변경된 물 터널 활성화의 변경 깁스 자유 에너지를 표시와 함께, 변형 (Δ G ‡ = Δ H ‡ - T * Δ S ‡, 그림 2B-C). 예를 들어, 303 K에서 S168F 터널 변형 야생 형 효소 16 킬로 칼로리 / 몰에 비해 14 킬로 칼로리 / 몰의 활성화 깁스 자유 에너지를 표시합니다. 제 7의 프로토콜에 따라, 식 (4)는 하나의 냄비 운동 실험에서 추가 기판 (그림 3A)에 대한 명백한 K 고양이 / K M 값의 계산이 가능합니다. 또한, 열역학적 선형 플롯 (도 3b)는 다른 온도 (식 5)에서 경쟁 에세이를 실행하여 구성 될 수있다. 단일 기판 속도론과 유사하게, 기준 화합물에 비해 추가의 기판에 대한 상대적인 활성화 엔탈피 및 엔트로피 readil 아르직선의 절편과 기울기에서 액세스 할 수 y는 실험 데이터에 적합합니다. 활성화의 열역학적 파라미터의 절대 값은 기준 화합물 (식 6)과 관련된 열역학 데이터를 이용하여 산술 가산에서 평가 될 수있다. 본원 프로토콜을 사용하여, 결과를 명확하게 차단 물 터널 크기가 다른 (도 3c)의 기판들에 대한 활성화를 근본적으로 다른 열역학적 파라미터를 디스플레이 막 효소 변종 생성 된 것을 보여준다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53168/53168fig1.jpg" /> 그림 1. 프로토콜 개요 :. 실험 단백질 설계 및 열역학적 분석 콘서트에 실리 컴퓨터 모델링에서 효소 촉매 반응에 용매 역학의 영향의 향상된 이해를 할 수 있습니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53168/53168fig1large.jpg" target="_blank">를 클릭하십시오</a>여기에이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53168/53168fig2.jpg" /> 단일 기판 동역학에서 야생형과 터널 변이체의 활성화도 2 열역학적 파라미터. (A) 겉보기 K 고양이 / 실험 데이터로부터 전이 상태 이론을 이용하여 수학 식 1 및 2 (B) 열역학적 분석을 이용하여 얻어진 K M 값 및 실험 데이터의 선형 피팅의 (b)에서의 플롯으로부터 계산 활성화 3. (C) 열역학적 파라미터 방정식. prefolded 스쿠알렌 기판은 채권으로 표시됩니다 형성 / 점선으로 깨진. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53168/53168fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 다른 기판에 대한 야생형 및 터널 변이체의 활성화도 3 열역학적 파라미터. (A) 상대 K 고양이 / 식 4 (B)를 이용하여 원 - 포트 (one-pot) 반응 속도로부터 수득 K M 값이 다른에서 속도 데이타 열역학적 플롯 5. 수식 (C) 및 식 (6)에 의해 기준으로서도 2에 기재 스쿠알렌을 이용하여 산출 활성화의 절대 열역학적 파라미터를 이용하여 온도. 형성 / 기판 깨진 채권이 점선으로 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53168/53168fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

효소에있는 물 분자의 수송 채널은 활성 부위 매화 및 촉매 작용에 영향을 미친다. 여기에서 우리는 실리 컴퓨터 모델링 및 실험에 기초하여 다음과 같은 추가 촉매 주제의 엔지니어링을위한 프로토콜을 제시한다. 이 효소의 촉매 작용에 용매 역학의 영향에 대한 우리의 이해를 향상시킬 것입니다.

Enzyme catalysis evolved in an aqueous environment. The influence of solvent dynamics on catalysis is, however, currently poorly understood and usually ...

이 학제 간 프로토콜의 전반적인 목표는 용매 역학이 효소 촉매 작용에 미치는 영향에 대한 기초적인 이해를 높이는 것입니다. 이 방법은 용매 재배열이 효소 역학과 촉매 작용을 어떻게 유도하는지와 같은 생촉매 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 특이성, 활성 및 열역학에 영향을 미치는 터널 또는 수송 모티프(motives of water transport)를 설계할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 여러 과학 세부 분야를 아우르는 학제 간 단계들로 구성되어 있어 습득하기 어렵기 때문에, 시각적인 시연이 매우 중요합니다. 먼저, Protein Databank에서 관심 단백질의 PDB 구조를 다운로드하십시오.YASARA의 세포 중성화 및 pkA 예측 실험을 사용하여 과잉 서브유닛을 제거하고 누락된 수소 원자와 명시적 용매를 추가하여 구조를 준비하십시오. 막 결합 트리테르펜 사이클라제(triterpene cyclases)의 경우, 적절한 워터박스(waterbox) 크기는 91 x 67 x 77 Angstroms입니다. 촉매 활성 아미노산의 양성자화 상태를 수동으로 조정하십시오.AMBER 포스 필드 세트를 사용하여 에너지 최소화 명령어로 구조를 최소화합니다. 장거리 정전기 상호작용을 고려하기 위해 particle mesh ewald 방식을 사용합니다. 반데르발스 상호작용의 컷오프 값을 표준 설정에 따라 설정합니다.시뮬레이션 어닐링(simulated annealing)과 분자 역학(molecular dynamics) 이후, edit, delete, residue 명령어를 사용하여 모든 물 분자와 남아 있는 리간드 기질을 삭제함으로써 시뮬레이션 스냅샷을 수정합니다. 모든 구조가 동일한 공간적 위치를 공유하도록 superpose object 명령어를 사용하여 각 스냅샷을 원래의 PDB 구조에 개별적으로 중첩시킵니다. 이렇게 준비된 각 스냅샷을 file, save as, PDB 명령어를 사용하여 새로운 PDB 파일로 저장합니다.준비된 스냅샷을 CAVER 3.0 소프트웨어의 입력값으로 사용하십시오. 텍스트 프로토콜에 제시된 매크로를 사용하여, CAVER 3.0에서 생성된 터널을 분자 그래픽 소프트웨어 프로그램으로 시각화하십시오. CAVER 3.0 소프트웨어에서 생성된 출력 요약 텍스트 파일에 기재된 헤더 ID를 기준으로 순위가 가장 높은 터널을 식별하십시오.획득한 모델을 사용하여, 시각적 검사를 통해 채널 내부를 향하는 작은 측쇄를 가진, 가장 순위가 높은 터널의 내벽에 위치한 아미노산을 식별하십시오. swap residue 명령어를 사용하여, 입체 장애의 증가로 인해 터널을 차단하게 될 단일 아미노산 치환을 식별하십시오. 시각적 검사를 통해 터널이 폐쇄되었음을 확인하고, 지금까지의 프로토콜을 반복하여 이를 검증하십시오.여기에서 도입된 tryptophan은 자홍색으로 표시되었으며, 비교를 위해 교체된 serine이 함께 표시되었습니다. 텍스트 프로토콜에 나열된 대로 인산칼륨, 재현탁 완충액, 세제 완충액 및 반응 완충액을 준비하십시오. squalene-hopene cyclases 또는 최적 pH가 더 낮은 다른 막 결합 효소의 경우, 시트르산이 포함된 재현탁 완충액을 사용하십시오.유리 비커에 담긴 동결 세포 펠릿의 무게를 잽니다. 균질기를 사용하여 세포를 재부유 버퍼에 재부유시켜 최종 농도를 0.3 gram-cells/milliliter로 맞춥니다. 그 다음, 진폭 80%, 1초 작동 및 1초 정지 펄스 조건의 초음파 처리를 통해 재부유된 세포를 용해합니다.각 50초씩 3회 반복 사이클을 사용하십시오. 세제 버퍼를 최종 농도가 0.2%detergent가 되도록 첨가하십시오. 4°C에서 1시간 동안 end-over-end 혼합 방식으로 평형화하십시오.4°C에서 39,000 ×g로 50분 동안 1회 원심분리한 후, 상층액을 회수하여 막 단백질 분획을 얻습니다. 반응 완충액으로 기질의 5mM 신선한 스톡 용액을 조제합니다. 30% 진폭으로 2~5분 동안 초음파 처리하여 균질한 에멀젼을 얻습니다.다음으로, ThermoMixer를 원하는 반응 온도에서 평형 상태로 만듭니다. 외부 온도계를 사용하여 물이 담긴 유리 바이알 내부의 온도를 확인합니다. 단일 기질 반응 속도론 분석의 경우, 유화된 기질을 동일한 최종 기질 농도가 되도록 최소 5개의 유리 바이알에 희석하여 나눕니다.유리 바이알을 ThermoMixer에서 10분 동안 예비 배양합니다. 효소를 첨가하여 반응을 시작합니다. 총 반응 부피는 1 mL가 적당합니다.최소 1200 RPM의 진탕 속도를 사용하십시오. 내부 표준 물질로 100 µM decanol이 첨가된 ethyl acetate 500 µL를 가하여 서로 다른 시간 지점에서 반응을 중지시킵니다. 볼텍싱과 더불어 유리 바이알을 1분 동안 수동으로 강하게 흔들어 반응 혼합물을 추출하십시오.그 다음, 탁상형 원심분리기를 사용하여 유리 바이알을 상온에서 10분 동안 9,600 gs로 원심분리합니다. 상층액을 빈 튜브로 옮깁니다. 반응 튜브에 추출 용매 500 µL를 추가로 넣고 추출 과정을 반복합니다.추출된 반응 혼합물을 황산나트륨으로 건조합니다. 5초 동안 볼텍싱한 후 튜브를 10분 동안 그대로 둡니다. 탁상형 원심분리기를 사용하여 상온에서 9,600 gs로 1분 동안 최종 원심분리를 수행합니다.그런 다음, 추출된 샘플을 가스크로마토그래피(gas chromatography, GC) 바이알로 옮깁니다. 단일 기질 반응 속도론의 경우 최소 4가지의 서로 다른 초기 기질 농도를 사용하고, 단일 기질 및 경쟁 반응 속도론의 경우 4가지의 서로 다른 온도를 사용하여 관심 있는 각 효소 변이체에 대해 이 과정을 반복합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 GC 분석을 수행한 후, 생성물의 피크 면적을 적분하고 적분 표준물의 면적을 이용하여 생성물 피크 면적을 해당 생성물 농도로 변환합니다.각 생성물의 농도를 반응 시간에 따라 도식화합니다. 전환율이 10% 미만인 데이터 지점들에 대해 선형 회귀 분석을 수행합니다. 초기 반응 속도는 적합된 직선의 기울기로 구할 수 있습니다.다중 기질을 이용한 원팟(one-pot) 상대 속도론의 경우, 시간에 따른 고리화 반응을 추적하여 텍스트 프로토콜에 기재된 식을 사용하여 상대적인 겉보기 K-cat/Km 값을 구합니다. 겉보기 K-cat/Km 값의 온도 의존성에 미치는 용매 재배열의 영향이 나타나 있습니다. 다음은 단일 기질 속도론에 대해 전이 상태 이론을 이용한 열역학적 분석과 실험 데이터를 전이 상태 이론 식에 선형 적합한 대표적인 결과입니다.실험적 열역학 분석을 통해 얻은 활성화 열역학 파라미터에 미치는 용매 역학의 영향은 상당합니다. 여기서 보여주는 바와 같이, 수분 통로가 손상된 효소 변이체들은 상대적 활성화 엔트로피와 엔탈피의 복잡한 변화로 인해 근본적으로 다른 기질 특이성을 나타냅니다. 이 기술은 개발 이후, 현재까지 충분히 이해되지 않은 효소 역학과 촉매 작용을 유도하는 물의 역할을 탐구하고자 하는 생촉매 분야 연구자들에게 길을 열어주었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

트립토판 형광으로 막 단백질 폴딩의 깁스 자유 에너지를 얻기 위해이 동영상 기사 세부 실험 절차.

막 단백질 폴딩의 열역학은 형광 분광학에 의해 측정

Sedimentation equilibrium (SE)은 생리학적 환경에서 단백질-단백질 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 원고는 인간 세포융합 호흡기 바이러스(hRSV)에 의해 암호화된 작은 소수성(SH) 단백질에 의해 형성된 호모펜타머의 안정성에 대한 pH의 영향을 결정하기 위해 이 기술의 사용을 설명합니다.

작은 올리고머 형성 막 단백질의 침전 평형 : 펜타 머 안정성에 히스티딘 양성자의 효과

여기 postfusion bilayer에이 막 단백질의 세제 무료 배달 대상 지질 bilayers와 fusogenic proteoliposomes에 막 단백질의 재구성 및 같은 proteoliposomes의 융합에 대 한 두 개의 초고속 프로토콜 선물이. 이러한 방법의 복잡 한 다중 구성 요소 막 시스템의 신속 하 고 쉽게 제어 조립이 있습니다.

세제 없는 보완 청구 Proteoliposomes Fusogenic를 사용 하 여 지질 Bilayers에 막 단백질의 초고속 재구성.

여기, 우리는 예를 들어 시 토 크롬 보3  를 사용 하 여 단일 리의 지질 막에 걸쳐 양성자 전 좌의 분자 메커니즘을 연구 하는 프로토콜 제시. 전기 화학 및 형광 현미경 검사 법, 단일 소포, 포함 하는 단일 또는 여러 효소의 루멘에서 pH 변화를 결합 수 있습니다 감지 되며 개별적으로 분석.

전기 화학 및 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 양성자 펌프 막 효소의 연구에 대 한 단일 Liposome 측정

미토콘드리아 융합은 미토콘드리아 역학의 근본적인 중요한 정동성 반응입니다. 여기에 설명된 시험관 내 재통합 시스템은 막 테더링, 도킹, 혈전 및 모공 개방을 해결할 수 있는 미토콘드리아 내막 융합을 연구한다. 세포막 시스템을 탐구하는 이 접근의 다양성은 토론됩니다.

미토콘드리아 멤브레인 역학 을 재구성하기위한 모델 멤브레인 플랫폼

본 프로토콜은 인간 건강에 중요한 역할을 하는 두 모델 단백질의 구조 및 역학을 조사하는 방법을 기술한다. 이 기술은 벤치 탑 생물 물리학 적 특성화와 중성자 스핀 에코 분광법을 결합하여 단백질 간 운동과 관련된 시간 및 길이 스케일의 역학에 액세스합니다.

중성자 스핀 에코 분광법을 통한 단백질 역학 연구

이 논문은 지질 막의 중성자 스핀 에코 (NSE) 연구에서 샘플 준비, 데이터 감소 및 데이터 분석을위한 프로토콜을 설명합니다. 지질의 현명한 중테리움 라벨링은 중요한 생물학적 과정이 발생하는 중전 길이와 시간 척도에 대한 다양한 막 역학에 접근할 수 있게 합니다.

지질 막 역학 및 막 단백질 상호 작용을 위한 독특한 프로브로 중성자 스핀 에코 분광법

중성자 후방 산란 분광법은 단백질과 단백질의 수화수의 ps-ns 역학에 대한 비파괴적이고 표지 없는 접근을 제공합니다. 워크플로우는 아밀로이드 단백질에 대한 두 가지 연구, 즉 응집 중 리소자임의 시간 분해 역학과 섬유 형성 시 타우의 수화 물 역학에 대한 연구로 제공됩니다.

단백질과 수화수의 피코초-나노초 역학을 연구하기 위한 고분해능 중성자 분광법

이 프로토콜은 TIRF 현미경을 사용하여 개별 이온 채널을 추적하고 지지된 지질막에서 그 활성을 결정하여 측면 막 이동과 채널 기능 간의 상호 작용을 정의하는 방법을 설명합니다. 멤브레인을 준비하고, 데이터를 기록하고, 결과를 분석하는 방법을 설명합니다.

TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경을 사용한 지질 이중층의 측면 이동성 및 이온 채널 활성에 대한 단일 분자 이미징

구조와 구성의 막 지질 다양성은 세포 과정에 중요한 기여를 하며 질병의 표지자가 될 수 있습니다. 분자 역학 시뮬레이션을 통해 원자 분해능에서 멤브레인과 생체 분자와의 상호 작용을 연구할 수 있습니다. 여기에서는 복잡한 멤브레인 시스템을 구축, 실행 및 분석하기 위한 프로토콜을 제공합니다.

시뮬레이션 연구에서 복잡한 지질 혼합물을 사용한 사실적인 막 모델링

학습하세요 효소 촉매에서 용매 역학의 영향을 이해하기 위해 분자 동역학 시뮬레이션과 CAVER 3.0을 활용한 계산 생물학적 접근법을 사용하는 방법을. 이 기법은 생물촉매 연구에서 물 수송 채널 설계를 통해 효소 활성과 특이성을 최적화하는 데 필수적인 통찰을 제공합니다.

막 효소 용매 역학에 의해 유도 탈피 엔트 속도 가속

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