Name: 마우스 비장에서 불변 자연 살해 T 세포를 분리하고 확장을위한 최적화 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: 배우세요 마우스 비장에서 불변 자연 살해 T 세포를 분리하고 확장하는 최적화된 방법을. 자기 세포 분리와 형광 활성화 세포 분류를 활용하여 iNKT 세포 수율을 극대화하고 면역학 연구에 활용할 수 있습니다.

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D.E.와 M.B.D.는 겐트 대학교의 다학제 연구 플랫폼(MRP)과 겐트 염증성 질환의 풀린 단백질에 대한 연구자(GROUP-ID) 컨소시엄의 회원입니다.

본 연구에서는 성인 (6-8 주) 여성 C57BL / 6 마​​우스를 사용 하였다. 마우스는 겐트 대학 동식물 사육장의 지침에 따라 보관 및 사육되었다. 모든 동물의 절차는 기관 동물 관리 및 윤리위원회에 의해 승인되었다. 마우스 비장에서 단핵 세포 (다국적 기업) 1. 준비 <ol><li> 자궁 전위에 의해 마우스를 희생. </li><li> 다시 아래로 해부 보드에 마우스를 놓고 핀 뒷다리와 앞다리를 해결. </li><li> 70 %로 피부 표면을 소독 (부피 / 부피) 에탄올 / H 2 O. </li><li> 흉부에 복부​​ 정중선을 따라 피부를 잘라 무균 수술 도구를 사용하여 비장을 노출. </li><li> 주변의 지방 조직을 트리밍 한 후, 실온에서 1 ㎖의 1X 인산염 완충 식염수 (PBS)를 포함하는 24 웰 플레이트에 비장을 배치합니다. </li><li> 멸균 메스를 사용하여 비장을 해부하고 50 ㎖ 욕조 내에 배치 70 μm의 나일론 필터로 조각을 전송전자. </li><li> 2 ML의 주사기 플런저를 사용하여 부드럽게 셀 스트레이너를 통해 비장 조각 매쉬와 PBS 1X 5 ㎖로 세척한다. </li><li> 15 ㎖의 튜브에 피콜 - 페이크 3 ㎖를 첨가하고 5 ml의 세포 현탁액과 밀도 구배 매체를 오버레이. </li><li> 브레이크없이 실온에서 20 분 동안 400 XG에 원심 분리기. </li><li> 신선한 15 ML 튜브에 계면 이동 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에 10 ml의 차가운 1X PBS와 원심 분리기를 추가합니다. </li><li> 0.5 % 소 혈청 알부민 (BSA) 및 1mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) (FACS 완충액)을 함유하는 PBS 1X 2 ml의 세포를 재현 탁. 전사 작은 튜브에 세포 현탁액 10 ㎕를 0.4 %의 10 μL와 혼합 </li></ol> 2. 농축 검색, 마우스 인 iNKT 세포의 정화 <ol><li> 마우스 비장 CD5positive (CD5 +) 림프구의 농축. <ol><li> (선택 사항) 얼룩 10 5 세포 FITC - 복합 안티 CD5 (4 μL 1시 반 희석 / 10 6 세포)어둠 속에서 4 ° C에서 30 분, 200 μL FACS 버퍼 (500)에 재현 탁 외과 버퍼 μL 씻어. 1X PBS로 4 &#39;, 6-diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI)의 20 μM 용액을 제조 작업, FACS 완충액 μL 이들에 105 세포를 1을 추가 5 분 동안 RT에서 배양한다. 흐름 cytometer에 104 미리 농축 세포를 취득. <ol><li> FCS-H와 FCS-W, 세포는 이중 집계 (그림 1A)를 제외 FSC-W 싸다 세포에 전자 게이트를 사용하여. 그런 다음 전자 게이트 밖으로 DAPI + (죽은) FSC-W LO 인구 (그림 1B) 내에서 세포 및 전자적 크기 (그림 1C)에 의해 림프구 인구를 선택 SSC-A와 FCS-A를 사용합니다. </li><li> 림프구 게이트 내의 세포를 사용하여, 대 CD5-SSC 플롯도 1D에 도시 된 바와 같이 전자적으로 게이트 CD5 + 림프구. 사이토 흐름 예비 농축 샘플의 나머지를 획득. </lI&gt; </ol></li><li> FACS 버퍼 90 μL 당 10 7 세포에 세포 수를 조정하고 10 μL 안티 CD5 마이크로 비드를 추가합니다. </li><li> 4 ML의 외과 차가운 외과 버퍼를 버퍼에 resuspend 500 μL로 한 번 씻어 15 분 동안 4 ºC에서 품어. 자기 세포 분리 (MACS)를 사용하여 CD5 + 림프구 제조업체의 권장 사항에 따라 열에 대한 풍부. </li><li> FITC - 복합 안티 CD5와 선택 사항) 얼룩은 10 5 세포 (2.1.1에서와 같이 1시 반 희석 / 10 6 세포) 및 DAPI의 4 μL. 흐름 (10) 4 농축 림프구 세포 계수기 획득하고 전자 게이트 2.1.1에서 만든 확인합니다. 풍부한 세포 부분에서 CD5 + 림프구를 선택합니다. 사이토 흐름에 105 세포를 획득하고도 1E에 도시 한 바와 같이 농축 된 분획에 본 CD5 + 림프구 백분율을 분석 - H를. </li></ol></li><li> 탐지 및 마우스 인 iNKT CE의 분리FACS로 재편. <ol><li> 항 CD16 / CD32을 함유하는 FACS 완충액 약 106 개 셀 (20) 당 μL 및 PE 공역 αGalCer (1시 50분 희석 / 106 세포의 4 μL)의 농도로 농축 CD5 + 림프구를 재현 탁 / CD1d 테트라 머 (1 μg의 / 10 6 세포). </li><li> 어둠 속에서 실온에서 30 분 동안 품어. </li><li> 의 마우스 항체 (단클론 항체) 항 CD3ε V500 (1시 20분 희석의 4 μL / 10 6 세포), 항 CD19의 E450 (1시 50분 희석의 4 μL / 10 6 세포) 및 안티 CD8α의 E450 (4 μl를 희석 FACS 완충액 1:50 희석 / 106 개 세포), CD5 + 림프구에 추가하고 어두운 곳에서 39 ° C에서 30 분 동안 배양한다. </li><li> 107 세포 / ml의 최종 농도 4 ㎖의 FACS 완충액을 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 재현 탁하고 원심 분리하여 1 ML의 FACS 완충액으로 세포를 세척 하였다. </li><li> 30 μm의 셀 스트레이너를 통해 세포를 필터링 및 얼음에 세포를 배치합니다. </li><li> 제조업체의 권장 사항 14, 15에 따라 정렬 셀 흐름 cytometer를 보정합니다. 주 : 셀 정렬하기위한 플로우 사이토 교정 훈련을 필요로하고 숙련 된 오퍼레이터, 또는 숙련 된 기술자에 의해 수행 될 수있다. </li><li> 10 6 세포 당 DAPI의 20 μm의 작업 용액 10 μl를 추가하고 5 분 동안 실온에서 품어. 흐름 cytometer에 약 10 4 농축 CD5 + 림프구를 취득. FSC-W 싸다 세포에 대한 전자적 게이트 세포는 이중 집계 (그림 2A)를 제외합니다. 그런 다음 전자 게이트 밖으로 DAPI + CD8 + FSC-W LO 인구 (그림 2B) 내에서 CD19 + 세포 (덤프 채널) 및 2.1.1.1에 기술 된 바와 같이 전자 림프구 (그림 2C)를 선택 SSC-A와 FCS-A를 사용 . <ol><li> CD3ε 및 전자 게이트 αGalCer / CD1d에 의해 플롯 αGalCer / CD1d 테트라도 2D에 도시 된 바와 같이 테트라 + + CD3ε하여 iNKT 세포. 풍부한 세포 부분에 존재하는 비율 αGalCer를 결정하기 위해 더 이상 5 10 × 2보다 CD5 + 풍부한 림프구를 취득 / CD1d 테트라 + CD3ε +하여 iNKT 세포. </li></ol></li><li> 2.2.7에서 작성한 전자 게이트를 사용. &#39;1.5&#39;의 유량으로 70 ㎛의 노즐을 이용하여 70 psi에서 사이토 흐름, FACS 분류 αGalCer / CD1d 테트라 머 + + CD3ε하여 iNKT 세포. 1 ml의 100 % FCS를 함유하는 FACS 튜브 정렬하여 iNKT 세포를 수집한다. 이어서 10 ㎖ RMPI 1640 배지 원심 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 세포를 이용한 FACS 튜브의 측면에서 분류하여 iNKT 세포를 헹군다. </li><li> 재현 탁은 RPMI 1640 배지 1 ㎖에 인 iNKT 세포를 분류하고 정렬하여 iNKT 세포의 순도를 평가하기 위해 유세포에 이의 40 μL를 획득. 림프구 - FSC-W LO DAPI를 선택S 2.2.7에 기술 된 바와 같이. 전자 및 게이트 αGalCer / 그림 하반기 같이 CD1d 사량 + CD3ε +하여 iNKT 세포 - (G 그림 2E). </li></ol></li></ol> 3. 문화와 마우스 인 iNKT 세포의 확장 날 0 <ol><li> 코트 실온에서 1 시간 동안 잘 당 정제 방지 CD3ε (3 μg의 / ㎖)와 평평한 바닥 96 웰 플레이트. 200 μL PBS 1X 한 번 200 μL 전체 RPMI 1640 배지 (10 % 부피 /의 부피 FCS, 100 U / ml의 페니실린 - 스트렙토 마이신, 5.5 μm의 β - 머 캅토 에탄올)와 함께 두 번 씻으십시오. </li><li> 1.11에서 0.4 % 혈구를 이용 가능한 정렬하여 iNKT 세포 (단계 2.2.8)의 개수를 카운트. 완전 RPMI 1640 배지에서 5 × 105 세포 / ml로 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에서 원심 분리하고 재현 탁 재조합 쥣과 IL-2 (10 NG / ㎖), 뮤린 재조합 IL-12 (1 NG / ㎖) 및 항 - 마우스 가용성 CD28 (5 μg의 / ㎖)을 함유. 플레이트의안티 CD3ε 코팅 된 플레이트 웰에서 105 세포 /로하여 iNKT 세포 orted 2 일 동안 CO2 인큐베이터에서 37 ℃에서 배양한다. </li></ol> 2 일 <ol start="3"><li> 2 일 동안 CO2 인큐베이터에서 37 ℃에서 완전 RPMI 1640 배지에서 신선한 무지 평저 96 웰 배양 접시에 휴식 조건 하에서 세포를 세포를 옮긴다. </li></ol> 4 일 <ol start="4"><li> 부드러운 피펫 팅에 의해 판에서 셀을 제거하고 새로운 15 ML 튜브에 세포를 전송합니다. 플랫 -에 105 세포 / 웰로 4 ℃, 재조합 쥣과 IL-7 (5 NG / ㎖)을 함유하는 완전 RPMI 1640 배지에서 5 × 105 세포 / ml로 재현 탁하고, 플레이트에서 10 분 동안 300 XG에 원심 CO2 인큐베이터에서 37 ℃에서 4 일 동안 96 웰 플레이트를 바닥. </li></ol> 8 일 <ol start="5"><li> 300 X에서 새로운 튜브에 세포를 수집, 원심 분리기수용성 항 CD28 (5 μg의 / ㎖)을 함유하는 완전 RPMI 1640 배지에서 5 × 105 세포 / ml에서 10 ℃에서 4 분, 재현 탁 대 g. </li><li> 코트는 물론 당 정제 방지 CD3ε (3 μg의 / ㎖)와 평평한 바닥 96 웰 플레이트와는 3.1로 씻는다. (10) 5 세포 / 웰의 안티 CD3ε 코팅 플레이트와 하루 11까지 CO 2 배양기에서 37 ° C에서 품어. </li></ol> 일 11-18 <ol start="7"><li> 반복 3.4-3.6 단계를 반복합니다. </li></ol> 하루 19 ~ 20 <ol start="8"><li> 완전한 RPMI 1640 배지에서 5 × 105 세포 / ml로 재현 탁하고 300 XG에서 신선한 15ml의 튜브, 원심 분리기에 세포를 옮긴다. </li><li> 플레이트 105 세포에서 세포 / 웰 평저 96 웰 플레이트 허용 세포 실험에 사용하기 전에 CO2 인큐베이터에서 37 ℃에서 2 일 동안 휴식한다. </li></ol> 4. 사이토 카인 생산 CD1d 플랫을 사용하여 마우스 인 iNKT 세포에 의해전자 결합 분석 <ol><li> 코트 평평한 바닥 96 웰 아니라 당 재조합 쥐 CD1d 100 ㎕ (1X PBS에서 10 ㎍ / ㎖)와 플레이트는 37 ℃에서 1 시간 동안 배양한다. </li><li> , PBS 1X 200 μL로 4 회 씻어 잘 당 1X PBS (차단 솔루션)에 2 % FCS 200 μl를 추가하고 37 ℃에서 2 시간 동안 품어. </li><li> 블로킹 용액을 제거 αGalCer 웰 당 200 μL의 (5 NG / μL)을 추가하고, 16 시간 동안 37 ℃에서 플레이트 배양. [αGalCer 용액의 조제를 들어, 차량이 96 ㎎ / ㎖ 자당, 10 ㎎ / ㎖ 나트륨 데 옥시 콜레이트, 5 ㎎ / ㎖ 트윈 20을 포함에 용해 αGalCer 55 μg의에 1,085 μ 1X PBS를 추가]. </li><li> 배양 후, αGalCer 솔루션을 무시하고 200 μL 전체 RPMI 1640 배지 다음 PBS 1X 200 μL로 잘 두 번 씻는다. </li><li> 전체 R에 원심 분리기 세포 300 XG에 10 분 동안 4 ℃에서 재현 탁하고, 21 일에 체외 확장하여 iNKT 세포를 수집0.5 × 106 세포 / ml의 농도로 PMI 1640 배지. </li><li> 물론 당하여 iNKT 세포의 재 부유 200 μl를 추가하고 CO 2 배양기에서 37 ℃에서 72 시간 동안 배양한다. </li><li> 제조 업체의 프로토콜에 따라 효소 연결 immunosorbant 분석 (ELISA)에 의해 관심의 상층 액과 측정 사이토 카인을 수집합니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 공개할 경쟁 이해관계가 없습니다.

현재 프로토콜의 중요한 단계는 분리 및 CD5 + 림프구 (제 1 &amp; 2)의 후속 농축, FACS 정렬 (섹션 3)하여 iNKT 세포의 초기 도금 (4 절)를 포함한다. 섹션 1에서 수행 된 단계 신중 별개 셀룰러 상간 원심 다음 생성되도록 밀도 구배 매질을 통해 비장 세포 현탁액을 층에 기억한다. 자기 세포 분리 (제 2 항)에 의해 CD5 + 림프구의 후속 농축은 얼룩에 필요한 시약 및 시간을 최소화 및 증가하여 iNKT 세포 수율을 후 정렬하는 데 도움이 FACS 정렬하여 iNKT 세포 (3 절). 마지막으로, 세포의 사멸을 초래할 수 인 iNKT 세포의 높은 숫자 웰으로 시딩 배양 (제 4)의 제 2 일 동안 웰 당 10 개 이상 5 인 iNKT 세포를 시드없는 것이 중요하다. 및 / 또는 troubleshoo을 수정할 때 고려의 숫자는 중요하다팅이 프로토콜은 첫째, 사용되는 동물의 연령이 중요하다. 하...

쥐 불변 자연 살해 T (인 iNKT) 세포는 CD1d 발현 대뇌 피질의 흉선 세포 1, 2에 의해 흉선에서 선택한 타고난 T 림프구의 뚜렷한 인구입니다. 하여 iNKT 세포 Vβ8, Vβ7 또는 CD1d의 컨텍스트에서 내인성뿐만 아니라 외국인 지질 항원을 인식 할 수있다 Vβ2 TCR도 3 중 하나와 짝을 불변 Vα14-Jα18 TCR 사슬로 구성된 T 세포 수용체 (TCR)를 표현한다. 예를 들어, 뮤린하여 iNKT 세포를 인식하고 내인성 지질 항원이라는 isoglobotrihexosylceramide (iGb3) 4뿐만 아니라, α - 갈 락토 실 (αGalCer) 5,6- 해양 해면에서 분리 된 당지질에 의해 활성화된다. TCR은 종속 &lt;하여 iNKT 세포의 활성화는 적응성 면역 반응의 프라이밍을 조장하고, 결과적으로하여 iNKT 세포는 류마티스 성 질환 (7)와 암을 포함하여 병변의 범위의 경감 또는 개발에 기능적으로 관여하는 것으로 밝혀졌다SUP&gt; 8. 현재, 합성하여 iNKT 세포 리간드는 immunopathological 다수의 조건을 조절 할 수있다 유망한 새로운 백신 보조제를 구성한다. 이것은 이전하여 iNKT 세포 그러나 마우스 조직으로부터 분리 다음 시험 관내에서 생성 될 수 있음을 입증되었다; 이러한 연구의 많은 주요 항원 제시 세포 (APC를) 및 / 또는 세포주 (9)의 사용을 채택 Vα14 TCR 트랜스 제닉 (Tg)가 인 iNKT 세포 유래 하이 브리 도마 (11, 12)의 생성을위한 마우스 (10), 또는 흉선종. 또한, 마우스의 큰 숫자는 같은 αGalCer로드 CD1d 이량 체, 및 긴 배양 배 시약의 높은 볼륨이 일부 공개 프로토콜 덜 윤리적, 경제적으로 9, 13을 호소합니다. 이 보고서에서 우리는 고립과 마우스의 비장에서하여 iNKT 세포의 체외 확장에 적응하는 방법을 설명합니다. 구체적으로는, 프로토콜이 방법을 기술FACS 셀 소팅에 필요한 마우스, 시약 및 시간을 감소시키고, 비장 체외로 정렬하여 iNKT 세포의 확장을위한 최적화 방식이 제안 마우스 비장하여 iNKT 세포를 풍부하게.

<table><tbody><tr><td>재료</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>재조합 뮤린 IL-2</td><td>eBiosciences</td><td>14-8021</td><td></td></tr><tr><td>재조합 뮤린 IL-12</td><td>eBiosciences</td><td>39-8122-65</td><td></td></tr><tr><td>재조합 뮤린 IL-7</td><td>eBiosciences</td><td>14-8071</td><td></td></tr><tr><td>정제 안티 마우스 CD3e (145-2C11)</td><td>eBiosciences</td><td>16-0032-86</td><td></td></tr><tr><td>정제 안티 마우스 CD28 (37.51)</td><td>eBiosciences</td><td>16-0281-85</td><td></td></tr><tr><td>e450-conjugated anti-mouse CD19 (eBio1D3)</td><td>eBiosciences</td><td>48-0193-82</td><td></td></tr><tr><td>e450-conjugated anti-mouse CD8&alpha; (53-6.7)</td><td>eBiosciences</td><td>48-0081-82</td><td></td></tr><tr><td>FITC-conjugated anti-mouse CD5 (53-7.3)</td><td>eBiosciences</td><td>11-0051-81</td><td></td></tr><tr><td>V500-conjugated anti-mouse CD3&epsilon; (500A2)</td><td>BD biosciences</td><td>560771</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 CD5 (Ly-1) 마이크로 비즈</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-049-301</td><td></td></tr><tr><td>정제 안티 마우스 CD16 / 32 (2.4G2)</td> <td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>MACS MS 컬럼</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue, 0.4 % (wt / vol)</td> <td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium</td><td>Gibco</td><td>12633-020</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-056</td><td>[Ca2+/Mg2+ - 무료]</td></tr><tr><td>태아 종아리 세럼</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-123</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458-100ML</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마-알드리치</td><td>A7906-100MG</td><td></td></tr><tr><td>&베타;-메르캅토에탄올</td><td>시그마-알드리치</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque plus</td><td>GE Healthcare</td><td>71-7167-00 AF</td><td></td></tr><tr><td>장비</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96웰 플레이트 F-bottom</td><td>Greiner-bio one</td><td>657-160</td><td></td></tr><tr><td>24웰 플레이트</td><td>Greiner-bio one</td><td>665-180</td><td></td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td><td>Greiner-bio one</td><td>655-180</td><td></td></tr><tr><td>15ml 팔콘 튜브</td><td>Greiner-bio one</td><td>188-271</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 팔콘 튜브</td><td>Greiner-bio one</td><td>227-261</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m 필터</td><td>Greiner-bio one</td><td>542-070</td><td></td></tr><tr><td>30 &micro; m 필터</td><td>Millipore</td><td>SVGP01050</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS 분리기</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>MS 열</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>워터 재킷 CO2 인큐베이터</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>혈구계</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>해부 키트</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria III</td><td>BD 생명과학</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 비장에서 불변 자연 살해 t 세포를 분리하고 확장을위한 최적화 방법

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

급속 자극시 사이토 카인을 분비하는 능력은 불변성 자연 살해 T (하여 iNKT) 세포 계보의 기능적 특성이다. 하여 iNKT 세포 따라서 면역 반응을 활성화시키고 스티어링 적응 가능한 타고난 T 세포군으로 특징 지어진다. 뮤린하여 iNKT 세포의 배양 및 확장을위한 개선 된 기술의 개발은 시험 관내 및 생체 내 모델 시스템 인 iNKT 세포 생물학 연구를 용이하게한다. 여기에서 우리는 고립과 쥐의 비장하여 iNKT 세포의 확장을위한 최적화 된 절차를 설명합니다. C57BL / 6 마​​우스로부터 비장을 제거하고 해부 변형하고, 생성 된 세포 현탁액을 밀도 구배 매체를 통해 적층된다. 원심 분리 후, 비장 단핵 세포 (다국적)를 수집 및 CD5 양성 (CD5 +) 림프구는 자성 비드를 사용하는 농축된다. CD5 + 분획 내의하여 iNKT 세포는 계속해서 ^ 묻5; CD1d 테트라을 GalCer는로드 및 형광 활성 세포 정렬 (FACS)로 정제. FACS는 뮤린 재조합 IL-7의 존재 하에서 확장되기 전에, 재조합 쥐 사이토 플레이트 - 결합 T 세포 수용체 (TCR) 자극의 조합을 사용하여 iNKT 세포는 처음에 다음 체외 배양 정렬. 약 108 인 iNKT 세포들은 시험 관내 기능 분석을위한, 또는 마우스 생체 내 전달 실험에 사용할 수있는 배양 후 18-20 일 내에 발생 될 수있는이 기술을 사용.

밀도 구배를 사용하여 비장 단핵 세포의 분리는 약 1 시간 소요 적혈구 (적혈구)을 용해시키기 위해 요구되는 시약의 사용을 제거한다. 생존 세포의 높은 수율이 제거되고 기관의 긴장 중에 생성 방법 및이 파편을 사용하여 얻어진다. 일반적으로, 비장 림프구 풀 내하여 iNKT 세포의 주파수 사용이 동물의 연령, 성별, 건강 상태에 따라 달라질 수 있으나 전체 T 림프구의 1 % 내지 5의 범위이다. 약 106 인 iNKT 세포 6-8 주령 마우스의 비장으로부터 얻어지는 3 마우스의 비장 및 풀링하여 iNKT 세포의 높은 수율로 얻을 수있다. 마우스 항 CD5 자성 비드의 사용은 상당히 CD5 항원을 발현 B 림프구의 작은 집단으로부터 떨어져, 비장 MNC 분획 내의하여 iNKT 세포가 풍부하고,이 절차를 이용하여 분리 된 세포의 대부분은 CD5 +의 lympho를 구성cytes. 예를 들어, CD5 농축 후의 다국적 기업 5-8 %가 CD5...

여기에서는 쥐의 비장에서 많은 수의 쥐 불변 자연 살해 T 세포를 생성하는 데 사용할 수 있는 적응된 프로토콜을 제시합니다. 의정서는 비장 iNKT 세포가 한정된 수의 동물 및 시약을 사용하여 시험관 내에서를 위해 풍성하게 하고, 고립되고 확장될 수 있는 접근 방식을 개략적으로 설명합니다.

마우스 비장에서 불변 자연 살해 T 세포를 분리하고 확장을위한 최적화 방법

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

본 절차의 전반적인 목표는 생쥐 비장에서 수집한 변이 자연 살해 T 세포(invariant natural killer T cells 또는 INKT 세포)를 증식시키는 것입니다. 이를 위해 먼저 비장 단핵구를 분리한 후, 자기 세포 분리법을 통해 CD5 양성 림프구 집단을 농축합니다. 그 후 형광 활성 세포 분류법(fluorescence activated cell sorting)을 통해 비장의 INKT 세포 분획을 추가로 분리합니다.마지막 단계에서, 분리된 INKT 세포를 체외 확장을 위해 배양합니다. 최종적으로, 확장된 INKT 세포의 사이토카인 프로파일을 ELISA로 평가할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자는 INKT 세포의 정제와 확장에 서로 다른 여러 기술의 조합이 필요하므로 어려움을 겪을 수 있습니다.이 절차는 제 실험실의 대학원생이 시연할 예정입니다. 비장을 채취한 후, 조직을 70 micron 나일론 필터로 옮긴 다음, 2 mL 시린지 플런저를 사용하여 비장을 거름망을 통해 50 mL 코니컬 튜브로 부드럽게 으깨어 넣고 필터를 5 mL PBS로 세척하십시오. 그런 다음 15 mL 튜브에 3 mL의 density gradient pack을 넣고, 그 위에 5 mL의 세포 현탁액을 층이 지게 가볍게 얹으십시오.원심분리를 통해 세포를 분리하고 계면을 새로운 15 milliliter 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 10 milliliters의 차가운 PBS로 세포를 세척하고, CD5 양성 비장 림프구를 농축하기 위해 펠렛을 2 milliliters의 fax buffer에 재현탁합니다. fax buffer를 추가하여 세포 희석도를 90 microliters당 1 × 10⁷ cells로 조정하고, 세포에 10 microliters의 anti-CD5 마이크로비드를 첨가합니다.4°C에서 15분 후, 4 mL의 FACS 완충액으로 세포를 세척하고 펠렛을 500 µL의 신선한 FACS 완충액에 재현탁합니다. 제조사의 권장 사항에 따라 자기 세포 분리법을 사용하여 CD5 양성 세포를 분리합니다. 그다음, 농축된 CD5 양성 림프구를 anti-CD16, CD32 및 PE 접합 alpha-gal sCD1D tetramer가 포함된 FACS 완충액에서 20 µL당 1×10⁶ cells 농도로 희석하여 실온의 암실에서 30분 동안 처리합니다. 이후 대상 항체와 함께 4°C의 암실에서 추가로 30분 동안 세포를 배양합니다.그 다음 신선한 fax 버퍼로 세포를 세척하고, 1 × 10⁶ cells당 20 µM DPI 작업 용액 10 µL를 사용하여 5분 동안 염색합니다. 실온에서 유세포 분석기를 통해 약 1 × 10⁴개의 농축된 CD5 양성 림프구 이벤트를 획득하며, 이때 세포 이중체와 응집체를 전자적으로 제외하기 위해 전방 산란광(forward scatter)의 low cells 구역을 전자적으로 게이팅합니다. 전방 산란광 low 군집 내에서 DAPI 양성, CD8 양성, CD19 양성 세포를 게이트로 제외하고, 측방 산란광(side scatter) 및 전방 산란광 영역 플롯(area plots)을 사용합니다.림프구를 전자적으로 선택하기 위해 CD3ε 및 α-gal SER CD1D tetramer를 플롯합니다. 표시된 대로 α-gal SER CD1D tetramer 양성 및 CD3ε 양성 iNKT 세포를 전자적으로 게이팅합니다. 그 다음, 2 × 10⁵개 이하의 CD5 양성 농축 림프구를 수집하여, 농축된 세포 분획에 존재하는 α-gal SER CD1D tetramer 양성 및 CD3ε 양성 iNKT 세포의 백분율을 결정합니다. 이 게이트를 사용하여, α-gal SER CD1D tetramer 양성 및 CD3ε 양성 iNKT 세포를 1 mL의 소태아혈청(fetal calf serum)이 담긴 FACS 튜브로 분리합니다.분리된 NKT 세포를 10 mL의 RPMI 1640 배지로 팩스 튜브(fax tube) 벽면에서 헹궈냅니다. 그 후 세포를 원심 분리하고, 침전물을 1 mL의 RPMI 1640에 다시 현탁하며, 40 µL의 세포 분획을 사용하여 동일한 게이팅 전략으로 분리된 세포의 순도를 평가합니다.INKT 세포의 확장을 위해 소팅 파라미터를 설정하는 방법은 다음과 같습니다. 세포를 원심 분리한 후, IL-2, IL-12 및 anti-CD28이 첨가된 완전 RPMI 1640 배지에서 분리된 세포를 5 × 10⁵ cells/mL 농도로 재현탁합니다. 그다음, anti-CD3ε가 코팅된 96-well 평底 플레이트에 웰당 1 × 10⁵ INKT 세포를 분주하고, 세포 배양 인큐베이터에서 37 °C로 배양합니다. 2일 후, 세포를 코팅되지 않은 새로운 평底 96-well 플레이트로 옮겨 완전 RPMI 1640에서 휴지 상태로 배양합니다.추가로 2일간 배양하기 위한 배지입니다. 분리 후 4일째 되는 날, 각 웰의 상층액을 조심스럽게 피펫팅하여 세포를 분리하고 15 mL 원심분리 튜브에 모읍니다. 원심분리 후, 펠릿을 5 × 10⁵ cells/mL 농도로 재현탁합니다.IL-7이 첨가된 완전 RPMI 1640 배지에서 웰당 1×10⁵개의 세포를 새로운 평底 96웰 플레이트에 분주합니다. 4일 후 세포를 인큐베이터에서 꺼내어 원심분리를 위해 새로운 15mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 펠릿을 가용성 anti-CD28이 포함된 완전 RPMI 1640 배지로 재현탁하고, anti-CD3ε가 코팅된 96웰 평底 플레이트에 웰당 1×10⁵개의 세포를 분주한 뒤, 다시 인큐베이터에서 3~4일 동안 배양합니다 (11-18).19일 차에 시연한 것과 동일하게 IL-7, anti-CD28 및 anti-CD3ε 처리를 반복합니다. 세포를 새로운 15 mL 원심 분리 튜브(conical tube)로 옮깁니다. 원심 분리 후 펠렛을 complete RPMI 1640 배지에서 5 × 10⁵ cells/mL 농도로 재부유합니다.그런 다음 평 bottom 96-well plate의 웰당 1x10⁵개의 세포를 분주하고, 세포 배양 인큐베이터에서 2일 동안 안정시킵니다. IL-2, IL-12 및 가용성 anti-CD28 존재 하에 plate-bound anti-CD3ε로 정렬된 iNKT 세포를 자극하면, 2일간의 배양 후 iNKT 세포 수가 약 3배 확장됩니다. 이후 IL-7 존재 하에 iNKT 세포를 추가로 확장시키면 배양 4일 차에 존재하는 iNKT 세포 수가 3~4배 증가합니다.특히 이러한 배양 조건을 반복하면, 서로 다른 날짜에 배양 배지를 교체하는 동안 가시적인 세포 손실 없이 두 차례의 확장 과정을 거쳐 평균 7 × 10⁷개의 iNKT 세포를 얻을 수 있으며, 이는 18일 동안 최소 70배의 확장을 가져옵니다. alpha-GalC가 로딩된 플레이트 결합 재조합 마우스 CD1d로 활성화하여 추가 확장된 iNKT 세포는 자극 후 48시간에 IL-2, IL-4, IFN-gamma, TNF-alpha 및 IL-6를 생성하며, 이는 iNKT 세포가 확장 후에도 Th1 및 Th2 사이토카인을 생성하는 능력을 유지하고 있음을 보여줍니다.이 절차를 수행할 때, 유세포 분석 시 iNKT 세포를 식별하기 위해서는 alpha ceramide가 로딩된 cdre로 iNKT 세포를 적절하게 염색하는 것이 필수적이라는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 자기 분리기를 사용하여 음성 선택을 통해 마우스의 비장에서 T 세포를 농축하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 특정 세포 표면 항원에 대한 항체 또는 리간드를 사용하여 고갈을 위해 샘플의 다른 세포를 표적으로 삼는 것을 포함합니다.

T-세포 농축: 자기 분리를 통해 혼합 세포 집단에서 T-세포를 분리하는 기술

이 비디오는 자연 살해 세포 또는 NK 세포를 포함한 림프구를 선택적 증식을 위해 인간의 간 조직에서 분리하는 방법을 보여줍니다. 효소 및 기계적 분해 후 밀도 구배 분리는 NK 세포를 포함한 림프구 분리를 촉진합니다. 수집된 림프구는 NK 세포의 선택적 증식에 추가로 사용될 수 있습니다.

선택적 확장을 위한 간 조직에서의 자연 살해 세포 분리

이 비디오는 항원 펩타이드가 로드된 MHC-Igs 및 항-CD28 항체로 기능화된 자기 나노입자 기반 인공 항원 제시 세포(aAPC)를 사용하여 희귀 항원 특이적 CD8+ T 세포를 분리하는 프로토콜에 대해 설명합니다. aAPC와 항원 펩타이드 표적 T 세포 수용체를 특이적으로 발현하는 CD8+ T 세포의 상호 작용 후 in vitro 확장은 이 CD8+ T 세포 집단의 농축 및 확장을 초래합니다.

항원 특이적 CD8+ T 세포의 나노 입자 기반 농축 및 증식

이 비디오는 동종 조혈모세포와 GvHD 유도 비장 동종성 T 림프구를 사용하여 치사량에 방사선 조사를 받은 마우스에서 장 이식편대숙주병(GvHD)의 유도를 보여줍니다. 이 프로토콜은 중증 급성 장 GvHD 모델을 확립하여 질병의 메커니즘을 이해하고 혁신적인 치료 옵션을 개발하는 데 도움이 됩니다.

동종 골수 및 비장 세포 이식을 통한 마우스 모델에서 이식편 대 숙주 질환 유도

이 영상은 불변 자연적인 살해 T 세포, 일컬어 iNKT 세포를 고립시키기를 위한 방법을 설명합니다. 절차는 비장에 있는 iNKT 세포의 활성화 그리고 증식을 자극하기 위하여 합성 당지질을 쥐로 주입하는 것으로 시작됩니다. 연속적으로, 단 하나 세포 현탁액은 비장에서 준비되고 형광단으로 레테르를 붙인 iNKT 세포 인식 복합물로 배양되고, 자석 구슬 근거한 별거가 뒤이어, iNKT 세포를 고립시키기 위하여 배양됩니다.

마우스 모델에서 불변 자연 살해 T 세포 분리

순진한 CD4+ T cell은 활성화 시점의 환경에 따라 다양한 subset으로 분극화합니다.  naive CD4+ T cell을 다양한 effector subset으로 분화하는 것은 T cell receptor stimuli 및 specific cytokine signal의 추가를 통해 in vitro에서 달성할 수 있습니다.

마우스 나이브 CD4<sup&gt; +</sup&gt; T 세포의 분리 및<em&gt; 시험관</em&gt; T 세포 하위 집합으로 차별화

뚜렷한 수지상 세포 부분 집합은 림프 기관에서 드문 집단으로 존재하므로 면역학 실험을 위한 충분한 수와 순도로 분리하기가 어렵습니다. 여기에서는 현재 알려진 마우스 비장 수지상 세포의 모든 주요 부분 집합을 분리하기 위한 고효율, 고수율 방법에 대해 설명합니다.

마우스 수지상 세포 하위 집합의 분리를위한 효율적이고 높은 수율 방법

여기, 선물이 수용자 조 혈 줄기 세포 이식에 설명 합니다 및 원심 콜론의 반복적인 미니 내 시경 평가 존재, 특성, 그리고 라이브 내 저 승 염증의 심각도 대 한 현장에서 프로토콜 쥐 장 이식-비교-호스트 질병에서 고통.

장 이식-비교-호스트 질병 및 라이브 쥐에서 미니 내 시경 평가의 유도

우리는 마우스 비장에서 불변 자연 킬러 T (iNKT) 세포를 풍부하게하고 체외 및 생체 내 연구에 적합한 숫자로 시험관 내에서 확장하기 위해 신속하고 강력한 프로토콜을 설명합니다.

체외 및 생체 내 연구를 위한 마우스 불변 천연 킬러 T 세포의 정화 및 확장

여기에서는 말초혈액자연살해(PBNK), 간 조직으로부터 NK세포, 말초혈액단핵세포(PBMC) 또는 제대혈(CB)에서 유래한 키메라 항원 수용체(CAR)-NK세포를 확장시키는 방법을 제시한다. 이 프로토콜은 확장된 NK 세포의 최적화된 순도 외에도 221-mIL-21 영양세포를 사용하는 NK 및 CAR-NK 세포의 확장을 보여줍니다.

멤브레인 결합-IL-21-변형 B 세포주를 이용한 자연살해(NK) 및 CAR-NK 세포 확장 방법

배우세요 마우스 비장에서 불변 자연 살해 T 세포를 분리하고 확장하는 최적화된 방법을. 자기 세포 분리와 형광 활성화 세포 분류를 활용하여 iNKT 세포 수율을 극대화하고 면역학 연구에 활용할 수 있습니다.

마우스 비장에서 불변 자연 살해 T 세포를 분리하고 확장을위한 최적화 방법

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