마우스 비장에서 불변 자연 살해 T 세포를 분리하고 확장을위한 최적화 방법

이 절차의 전반적인 목표는 쥐의 비장에서 채취한 변이체 자연살해물질(natural killer T) 또는 INKT 세포를 증식시키는 것입니다. 이는 먼저 비장 단핵 세포를 분리한 다음 자기 세포 분리를 통해 CD five 양성 림프구 집단을 농축함으로써 수행됩니다. 그런 다음 비장 INKT 세포 분획은 형광 활성화 세포 분류에 의해 추가로 분리됩니다.

마지막 단계에서는 선별된 INKT 세포를 in vitro 확장을 위해 안착시킵니다. 궁극적으로 확장된 INKT 세포의 사이토카인 프로파일은 Eliza에 의해 평가될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 INKT 세포의 정제 및 확장에 다양한 기술의 조합이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.

이 절차는 내 연구실의 대학원생인 shrogen이 할 것입니다. 비장을 적출한 후 조직을 70미크론 나일론 필터로 옮긴 다음 2ml 주사기 플런저를 사용하여 여과기를 통해 비장을 50ml 원뿔형 튜브에 부드럽게 으깨고 5ml의 PBS로 필터를 세척합니다. 그런 다음 3ml의 석탄 팩을 15ml 튜브에 추가하고 밀도 구배를 5ml의 세포 현탁액으로 오버레이합니다.

원심분리로 세포를 분리하고 계면을 새로운 15ml 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 10ml의 차가운 PBS로 세포를 세척하고 펠릿을 2ml의 팩스 버퍼에 재현탁시켜 CD에 대해 5개의 양성 비장 림프구를 농축합니다. 더 많은 팩스 버퍼를 사용하여 세포 희석을 90마이크로리터당 7번째 세포의 1배로 10배로 조정하고 세포에 10마이크로리터의 안티 CD 5마이크로비드를 추가합니다.

섭씨 4도에서 15분 후 4밀리리터의 팩스 버퍼로 셀을 세척하고 펠릿을 500마이크로리터의 새 팩스 버퍼에 다시 현탁시킵니다. 제조업체의 권장 사항에 따라 자기 세포 분리를 통해 CD 5개의 양극 세포를 분리합니다. 그런 다음 농축 된 CD 5 개의 양성 림프구를 1 회 10 회 20 마이크로 리터 당 6 개의 세포에 희석하여 안티 CD 16, CD 32 및 PE 결합 알파 갈 공기 CD 1D 테트라 머를 함유 한 이낙스 버퍼를 30 분 후 암흑 속에서 실온에서 30 분 동안 배양하고, 관심있는 항체와 함께 세포를 섭씨 4도에서 다시 30 분 동안 배양한다.

그런 다음 새 팩스 버퍼에서 세포를 세척하고 5 분 동안 6 개의 셀에 1 회 10 회 10 회 20 마이크로 몰 DPI 작업 용액 10 마이크로 리터로 염색합니다. 실온에서 이제 약 1 배 10에서 4 번째 농축 CD를 획득하고, 유세포 분석기에서 5 개의 양성 림프구 이벤트를 전자적으로 획득하고, 낮은 세포로 전방 산란을 통해 세포 이중선 및 응집체를 전자적으로 배제합니다. 모집단이 적은 전방 산란 내에서 DAPI 양성 CD 8개의 양성 CD 19 양성 세포를 게이트아웃하고 측면 산란 및 전방 산란 영역 플롯을 사용합니다.

림프구를 전자적으로 선택하기 위해, 알파 갈 SER CD 1D 사량체를 CD 3 엡실론에 의해 플롯하고, 알파 갈 세르 CD 1D 포지티브 CD 3 엡실론 양성 INKT 세포를 전자적으로 ga한다. 그런 다음 5 개의 양성 농축 림프구를 10 배 이하로 획득하여 5 개의 양성 농축 림프구가 농축 세포 분획에 존재하는 알파 갈 SER CD 1D 테트라 머 양성 CD 3 개의 엡실론 양성 INKT 세포의 비율을 결정합니다. 이 게이트 낮은 정렬을 사용하여 알파 alser CD 1D 테트라머 양성 CD 3개의 엡실론 양성 INKT 세포를 종류가 끝날 때 1밀리리터의 태아 송아지 혈청을 포함하는 팩스 튜브에 넣습니다.

팩스 튜브 측면에서 분리된 NKT 셀을 10ml의 RPMI 1640 배지로 헹굽니다. 그런 다음 세포를 스핀다운하고 1ml의 RPMI 1640에 펠릿을 재현탁시킨 다음 40마이크로리터의 세포 분취액을 사용하여 분류된 세포의 순도를 평가합니다. 동일한 게이팅 전략을 사용합니다.

INKT 세포를 확장하기 위한 분류 매개변수를 설정하는 경우, 세포를 스핀다운하고 분리된 세포를 IL 2 IL 12 및 항 CD 28이 보충된 완전한 RPMI 1640 배지에서 밀리리터당 5번째 세포까지 5배 10으로 재현탁합니다. 그런 다음 96 웰 평평한 바닥의 안티 CD 3 엡실론 코팅 플레이트에 웰 당 10 - 5 번째 INKT 세포를 한 번에 파종하고 세포 배양 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 배양합니다. 2일 후, 완전한 RPMI 1640의 휴지 조건에서 배양하기 위해 코팅되지 않은 새로운 평평한 바닥 96웰 플레이트로 세포를 옮깁니다.

또 다른 이틀 부화를 위한 배지. 분류 후 4일째에 각 웰의 상층액을 부드럽게 피펫팅하여 세포를 제거하고 15ml 원추형 튜브에 모읍니다. 원심분리 후, 입천장을 5 곱하기 10에서 밀리리터당 5번째 세포로 다시 현탁시킵니다.

완전한 RPMI 16 배지에 IL 7이 보충되고 시드 1이 10 곱하여 웰 당 5 번째 세포가 공급됩니다. 바닥이 평평한 새로운 96 웰 플레이트에서 4일 후에 세포를 인큐베이터로 되돌리고 원심분리를 위해 새로운 15ml 원추형 튜브로 당깁니다. 용해성 항 CD 28을 함유하는 완전한 RPMI 1640 배지에 펠릿을 다시 현탁시키고 세포를 웰당 5번째 세포 중 10개씩 항CD 3개 엡실론으로 코팅된 96 웰 평면 바닥 플레이트에 시딩하고 세포를 또 다른 3일, 4일, 11-18일 동안 인큐베이터에 반환합니다.

19일째에 시연된 것처럼 IL 7 항 CD 28 및 항 CD 3 엡실론 치료를 반복합니다. 세포를 새로운 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 그것들을 스핀다운하고 펠릿을 5배 10으로 다시 현탁시켜 완전한 RPMI 1640.Medium에서 밀리리터당 5번째 셀로 재현탁합니다.

그런 다음 평평한 바닥 96 웰 플레이트에 웰당 10개에서 5개의 세포를 한 번에 파종하고 세포를 세포 배양 인큐베이터에서 2일 동안 휴지시킵니다. IL 2 IL 12 및 용해성 항 CD 28의 존재 하에서 플레이트 결합 안티 CD 3 엡실론으로 분류된 INKT 세포를 자극하면 2일간의 배양 후 INKT 수가 약 3배 증가합니다. IL 7의 존재 하에서 INKT 세포의 후속 확장은 배양 4일차에 존재하는 INKT 세포의 수를 3-4배 증가시키는 결과를 낳습니다.

특히 이러한 배양 조건을 반복하면 서로 다른 날의 배양 배지 변화 사이에 눈에 띄는 세포 손실 없이 두 차례의 팽창 후 평균 7배의 10배에서 7번째 INKT 세포를 얻을 수 있으며, 그 결과 18일 동안 최소 70배 팽창할 수 있습니다. 플레이트 결합 재조합 뮤린으로 활성화된 추가 팽창된 INKT 세포. 알파 alser가 로드된 CD 1D는 자극 후 48시간에 IL 2, IL 4, IFN 감마, TNF 알파 및 IL 6을 생성하며, 이는 INKT 세포가 확장 후 TH 1 및 TH 2 사이토카인을 생산하는 능력을 유지함을 보여줍니다.

이 절차를 시도하는 동안, 유세포분석 중에 INKT 세포를 식별하기 위해서는 알파 세라마이드가 적재된 cdre로 INKT 세포를 적절하게 염색하는 것이 필수적이라는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 물론.