마우스 수지상 세포 하위 집합의 분리를위한 효율적이고 높은 수율 방법

이 프로토콜의 전반적인 목표는 수지상 세포 또는 DC를 생성하기 위한 고효율, 고수율 방법을 개발하는 것이며, 이는 생체 내 표현형 및 기능적 발산을 운명적으로 반영합니다. 수지상 세포는 림프 기관에서 큰 개체군으로 존재합니다. 따라서 우리는 필터 리간드를 사용하여 기증자 조직에서 이러한 필수 세포의 빈도를 증가시켜 격리를 용이하게 합니다.

이 기술의 주요 장점은 상업적으로 이용 가능한 agent만을 사용하여 분석에 적합한 숫자의 모든 DC subset의 생성을 제거한다는 것입니다. 90% confluent 배양액에서 B16 흑색종 세포를 발현하는 flt-3 리간드를 수확하려면 먼저 PBS로 세포를 세척하고 섭씨 37도에서 05% 트립신으로 배양합니다. 5분 후, 섭씨 4도의 디마 배지 20ml로 프로테아제 활성을 소멸시키고 가벼운 탭핑과 부드러운 피펫팅으로 부착 세포 모델 층을 분리합니다.

원심분리로 세포를 모으고 계수합니다. 그런 다음, C57 블랙 6 수용 마우스에 피하 주사하기 위해 PBS의 밀리리터당 8 세포 농도의 1배로 단일 세포 현탁액을 다시 현탁시킵니다. 종양의 직경이 2-10밀리리터에 이르면 종양을 가진 동물에서 비장을 적출하고 새로운 RPMI 배지가 들어 있는 페트리 접시에 비장을 넣습니다.

메스를 사용하여 조직을 0.2제곱센티미터 조각으로 자른 다음 섭씨 37도에서 10밀리리터의 콜라겐 분해 효소와 드나제에 조각을 배양합니다. 30분 후, 부분적으로 소화된 조직 슬러리를 70미크론 세포 여과기에 붓고 5ml 주사기 플런저를 사용하여 여과기의 그물망을 통해 나머지 조직 조각을 누릅니다. 필터를 10ml의 새 배지로 헹구고 나머지 단일 세포 현탁액과 함께 세척액을 풀고 세포를 펠릿화합니다.

우리는 세포 펠릿을 2ml의 적혈구 용해 완충액에 10분 동안 실온에서 현탁시킵니다. 그런 다음 10ml의 새로운 RPMI 배지로 세포를 세척하고 FC 블록을 포함하는 세포 분류 버퍼에서 10 - 밀리리터당 8 세포로 다시 현탁시킵니다. 혈장 사이토드 DC를 분리하려면 플라즈마 사이토드 DC 분리 키트에서 300마이크로리터의 비오틴 표지 항체 칵테일을 200마이크로리터의 비장 단일 세포 현탁액과 철저히 혼합합니다.

세포를 얼음물 욕조에 15분 동안 넣고 3분마다 부드럽게 두드립니다. 그런 다음 12ml의 세포 분류 버퍼로 세포를 세척하고 펠릿을 500마이크로리터의 새 분류 버퍼에 다시 현탁시킵니다. 다음으로, 300마이크로리터의 항비오틴, 항체 접합 비드에 세포를 담아 얼음물에서 15분 동안 규칙적으로 두드려 배양합니다.

새 분류 버퍼에서 셀을 세척한 후 2ml의 세포 분류 버퍼에 팔레트를 다시 매달고 적절한 크기의 마그네틱 컬럼을 해당 자석에 로드합니다. 5ml의 새로운 섭씨 4도 세포 분류 버퍼로 컬럼을 평형을 이룹니다. 컬럼 상단에서 모든 버퍼가 배수되면 컬럼 헤드 표면 중앙에 셀을 조심스럽게 추가하고 플로우 스루를 수집합니다.

그런 다음 10ml의 신선한 섭씨 4도 분류 버퍼로 컬럼을 세척하고 동일한 튜브에 플로우스루를 수집합니다. 두 번째 자기 기둥을 통과한 후 94% 이상의 순도를 가진 플라즈마 사이토드 수지상 세포 집단을 기대할 수 있습니다. CD8aplha+ 및 CD8alpha-DC를 분리하려면 방금 시연된 바와 같이 나머지 비장 세포 현탁액을 CD8alpha+수지상 세포 분리 키트의 biotion 접합 항체 칵테일 100마이크로리터와 얼음 위에서 15분 동안 부드럽게 두드리며 혼합합니다.

배양이 끝나면 12ml의 섭씨 4도 세포 분류 버퍼로 세포를 세척하고 펠릿을 150마이크로리터의 섭씨 4도의 새로운 세포 분류 버퍼에 다시 현탁시킵니다. 다음으로, 세포를 CD8alpha+dendritic cell isolation kit anti-biotin beads 100마이크로리터와 혼합합니다. 얼음에서 15분 동안 가볍게 두드려 두드린 후 10ml의 섭씨 4도 세포 분류 버퍼로 셀을 세척하고 펠릿을 1ml의 새로운 섭씨 4도 분류 버퍼에 다시 현탁시킵니다.

배양이 끝나면 방금 설명한 것처럼 마그네틱 비드 분리로 세포를 분류하고 flow-through와 첫 번째 세척을 수집합니다. 그런 다음 세포를 스핀다운하고 펠릿을 섭씨 4도의 새로운 세포 분류 버퍼 1ml에 다시 현탁시킵니다. 이제 키트에서 200마이크로리터의 anti-CD8aplha 복합 자성 비드로 세포에 라벨을 붙이고 세포를 새 컬럼에 통과시켜 CD8alpha-수지상 세포 플로우 스루를 수집합니다.

CD8alpha+DC를 수집하려면 컬럼을 15ml 원뿔형 튜브로 옮기고 컬럼을 통해 5ml의 섭씨 4도 세포 분류 버퍼를 주입합니다. 두 번째 열을 통해 세포를 실행한 후 96% 이상의 CD8alpha+dendritic 세포 집단을 기대할 수 있습니다. CD8alpha 세포를 분리하려면 CD8alpha flow-through cell suspension을 회전시킵니다.

그런 다음 100마이크로리터의 항-CD11 c-마그네틱 비드로 세포를 라벨링하고 방금 설명한 대로 마그네틱 비드 양성 세포 집단을 수집하여 97%CD8alpha-dendritic cell subset population보다 큰 집단을 얻습니다. 마지막으로, 트리판 블루 제외를 통해 살아있는 세포의 수를 결정합니다. 종양이 만져질 수 있게 되면, B16 flt-3 리간드 종양을 가진 마우스는 비장 수지상 세포 subset의 확장과 상관관계가 있는 비장 세포의 극적인 증가를 일관되게 나타냅니다.

흥미롭게도, 이러한 동물에서 기존 DC에 대해 절대 세포 수가 15-20배 증가하는 것이 관찰되는 반면, 혈장 사이토드 DC 하위 집합에 대해서는 약 4배 증가만 관찰됩니다. 서로 다른 수지상 세포 부분 집합은 B220, CD11b, CD11c 및 CD8alpha 발현에 따라 특성화됩니다. 그러나 세포 집단은 또한 다른 고유한 하위 집합 마커를 나타내지만, mPDCA1은 CD8alpa+DC에서 높게 발현된 혈장 사이토드 DC DEC205에서만 독점적으로 발현되었으며 CD11b 및 33D1은 CD8alpha-DC에서 가장 두드러지게 검출되었습니다.

이 방법을 사용하여 CD8alpa+DCs가 불변 NKT 세포로 알려진 특수 T 세포 집단에 CD 결합 분자에 의해 항원을 제시하는 데 가장 효율적임을 입증했습니다. DC 절연의 가장 중요한 특징은 엄격한 무균 및 무 항산화 조건을 유지하는 것입니다. 시술 과정에서 이러한 T 세포는 항독제에 매우 민감하게 반응합니다.

이 절차를 시도하는 동안에는 반복적인 기계적 자극이 수상변 세포의 성숙 상태를 변화시킬 수 있으므로 세포를 부드럽게 다루는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 일단 숙달되면 이 기술을 사용하여 단일 비장에서 많은 수의 모든 주요 DC 부분 집합을 분리할 수 있습니다. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.