유사 분열 동안 다기능 세포 주기 단백질의 역할을 연구 하기 Mitotic 세포 동기화와 고해상도 Confocal 현미경 검사 법
December 5th, 2017
선물이 HeLa 세포 분석 고해상도 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 다음의 더블 티 미 딘 동기화에 대 한 프로토콜. 이 메서드는 동기적으로 S 단계에서 또한 interphase 기능을 소유 하는 다기능 단백질의 mitotic 역할에 대 한 연구를 활성화 하는 유사 분열을 진행 하는 셀의 많은 수를 얻기에 키.
이 절차의 전반적인 목표는 이중 티미딘 동기화 및 고해상도 컨포칼 현미경을 사용하여 중요한 간기 기능을 가질 수 있는 다기능 단백질의 유사분열 역할을 연구하는 것입니다. 이 방법은 세포 주기 및 유사분열에 관여하는 단백질의 정상적인 기능을 설명하는 방법에 대한 세포 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세포가 정상적인 생리적 행동을 유지할 수 있고 이 방법을 수행하기가 매우 쉽다는 것입니다.
이 절차를 시연하는 사람은 이 방법의 사용 전문가인 제 연구실의 박사후 연구원인 Dr.Mohammed Amin입니다. 유사분열 세포 진행의 고정 세포 이미징을 위해 70% 에탄올 및 UV 멸균 커버 슬립과 2밀리리터의 DMEM 배지를 포함하는 6웰 플레이트의 각 웰에 약 2배의 10에서 5번째 HeLa 세포를 파종하는 것으로 시작합니다. 세포 배양 인큐베이터에서 24시간 후, 웰당 2ml의 갓 희석된 티미딘과 신선한 배지로 세포를 차단하고 플레이트를 다시 18시간 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다.
다음날, PBS 2밀리리터로 세포를 두 번 씻고 신선한 섭씨 37도 배지로 한 번 씻습니다. 세포를 9시간 동안 인큐베이터에 다시 넣어 블록에서 세포를 분리한 다음 웰당 2ml의 티미딘 보충 배지를 더 추가합니다. 두 번째 차단 배양 후, 2 밀리리터의 PBS로 세포를 두 번 세척하고 2 밀리리터의 신선한 섭씨 37 ° 배지로 한 번 세척하고 새로 제조 된 siRNA 100 나노 몰을 적절한 웰에 첨가합니다.
9-10시간 후 상등액을 흡인하고 실온에서 20분 동안 4%의 파라포름알데히드로 커버 슬립에 세포를 고정합니다. PBS로 세척한 후 실온에서 0.5% 세제로 10분 동안 고정 셀을 투과시킨 다음 PBS에서 5분 동안 2회 세척합니다. PBS에서 1% BSA로 세포를 실온에서 1시간 동안 차단합니다.
그런 다음 섭씨 37도에서 1시간 동안 50마이크로리터의 관심 항체로 세포에 라벨을 붙입니다. 배양이 끝나면 PBS에서 세포를 세 번 세척하고 50마이크로리터의 적절한 관심 2차 항체로 라벨링합니다. 실온에서 1시간 후, 각 세척마다 5분씩 PBS에서 세포를 두 번 세척하고 실온에서 5분 동안 DAPI로 세포에 라벨을 붙입니다.
PBS에서 5분씩 두 번 세척하여 DAPI 염색을 수행하고 적절한 장착 매체를 사용하여 개별 투명 현미경 슬라이드에 커버 슬립을 장착합니다. 그런 다음 적절한 카메라가 장착된 도립 고해상도 컨포칼 현미경에 장착된 60 또는 100 X 1.4 개구수 계획 아포크매틱 DIC 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하여 0.2마이크로미터 두께의 Z 스택에서 면역염색된 단백질의 이미지를 획득합니다. 유사분열 세포 진행의 살아있는 세포 이미징을 위해 mCherry H2B 및 GFP 알파 튜불린을 안정적으로 발현하는 mCherry H2B 및 5번째 HeLa 세포에 약 0.5 - 1배 10을 1.5ml의 DMEM 배지가 포함된 35ml 유리 바닥 접시에 파딩합니다.
세포 배양 인큐베이터에서 24시간 동안 세포를 성장시킵니다. 그런 다음, 티미딘은 방금 설명한 것처럼 세포를 두 번 차단하고, 이번에는 각 티미딘 블록의 끝에서 2밀리리터의 PBS로 세포를 두 번, 예열 DMEM 배지 1밀리리터로 한 번 세척하고 첫 번째 티미딘 세척 중 첫 번째 블록 후 siRNA로 세포를 처리합니다. 10% FBS와 20밀리몰 HEPES를 보충한 신선하고 예열된 Leibovitz's 배지에서 세포를 8시간 동안 성장시켜 두 번째 블록에서 세포를 방출합니다.
그런 다음 첫 번째 플레이트를 고해상도 컨포칼 현미경의 온도 제어 챔버에 놓고 60X 대물렌즈 및 명시야 이미징을 사용하여 세포에 초점을 맞춥니다. 세포가 보이면 플레이트 위치를 선택한 영역으로 수동으로 조정하고 이미지 획득 소프트웨어를 사용하여 레이저 출력 및 노출, 이미지 획득 매개변수 및 실험 기간 기간을 설정합니다. 적절한 GFP 및 mCherry 필터를 선택하고 최대 16시간 동안 10분마다 펄스 투과광 및 형광 이미지를 획득하여 유사분열 과정의 타임 랩스 이미지를 얻을 수 있습니다.
이중 티미딘 블록에서 방출된 후 9시간 후에 1마이크로미터 분리된 12개의 z-평면에서 이미지를 획득합니다. 그런 다음 개별 유사분열 세포를 추적하여 이미지를 분석하고 적절한 소스 소프트웨어를 사용하여 해당 동영상을 조립합니다. 대부분의 대조군 및 Cdt1 siRNA 세포는 이중 티미딘 블록에서 방출된 후 9시간에 중기 단계에 있지만, 10시간에 고정하면 대부분의 Cdt1 siRNA 처리 세포는 후기 중복사기에 여전히 정지되어 있는 반면, 대조 세포는 아나페이즈에 들어가 예상대로 염색체를 분리하는 것으로 나타났습니다.
이중 티미딘 블록에서 방출된 후 9시간 후 냉 처리하면 대조군 고갈 세포 내의 세포에 비해 Cdt1이 고갈된 세포에서 상대적으로 덜 견고한 안정적인 동키토코어 미세소관의 유지를 촉진합니다. DNA 복제 기원 라이선스는 G2-M 단계에서 Cdt1 또는 대조군이 고갈된 세포에서 교란되지 않는데, 이는 이러한 세포가 후속 G2 단계에서 DNA 손상의 마커인 인광화된 감마 H2AX의 축적을 유도하는 것으로 밝혀지지 않았기 때문입니다. 그러나 비동시성 배양액의 Cdt1 siRNA transfection은 부적절한 DNA 복제 라이선싱으로 인한 DNA 손상으로 인해 phospho gamma H2AX positive foci의 축적을 유도합니다.
핵막이 파괴된 후 정상 세포는 유사분열에 들어가 약 30분에서 60분 이내에 유사분열에서 벗어나기 위해 아나페이즈 발병을 겪습니다. 그러나 강력한 키네토코어 미세소관 부착 형성에 필요한 핵심 키네토코어 단백질인 Hec1의 RNAi 매개 녹다운은 몇 시간의 유사분열 지연 후에도 아나페이즈 시작 또는 유사분열 종료로의 정상적인 유사분열 진행을 지연시킵니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행되면 3-4일 안에 완료할 수 있습니다.
시술을 시도하는 동안 냉동실에서 티미딘을 해동한 후 티미딘을 완전히 녹여야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 웨스턴 블로팅(western blotting)과 같은 다른 방법을 수행하여 다음과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다: 유사분열 중 관심 단백질의 발현 패턴은 간기(interphase)와 비교됩니다. 개발 후 이 기술은 세포 생물학 분야의 연구자들이 인간 세포 배양 모델에서 암 생물 발생을 탐구하고 고해상도 컨포칼 현미경을 사용하여 관심 단백질의 세포주기 관련 기능을 식별할 수 있는 길을 열었습니다.
파라포름알데히드 및 DAPI와 같은 시약으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑과 실험실 가운을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.
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개요
이 프로토콜은 HeLa 세포의 이중 티미딘 동기화 및 고해상도 공초점 현미경 분석의 사용을 설명합니다. 이 접근 방식은 간기 기능을 가진 다기능 단백질의 유사분열 역할 연구를 용이하게 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 세포 생물학
- 세포주기 조절
- 현미경 기술
배경
- 세포 주기를 이해하는 것은 세포 기능에 대한 통찰력을 얻는 데 중요합니다.
- 다기능 단백질은 간기와 유사분열 모두에서 중요한 역할을 합니다.
- 고해상도 이미징 기술은 세포 과정을 관찰하는 데 필수적입니다.
- 이중 티미딘 동기화는 동기화된 세포 집단을 얻는 방법입니다.
연구 목적
- 간기 기능을 가진 단백질의 유사분열 역할을 조사합니다.
- 세포 주기 진행에 관여하는 단백질의 정상 기능에 대한 이해를 향상시킵니다.
- 세포 주기 동태를 연구하는 효과적인 방법을 보여줍니다.
사용된 방법
- 여섯 웰 플레이트에 HeLa 세포를 접종합니다.
- 세포 주기를 동기화하기 위해 티미딘으로 세포를 차단합니다.
- 이미징을 위해 고해상도 공초점 현미경을 사용합니다.
- 절차 중에 세포의 정상적인 생리적 행동을 유지합니다.
주요 결과
- S 상에서 유사분열까지 HeLa 세포의 성공적인 동기화.
- 공초점 현미경을 사용한 유사분열 과정의 명확한 시각화.
- 세포 분열 중 다기능 단백질의 역할에 대한 통찰력.
- 동기화 방법을 수행하는 용이성을 입증했습니다.
결론
- 이중 티미딘 동기화 방법은 세포 주기 동태를 연구하는 데 효과적입니다.
- 이 접근 방식은 유사분열에서 단백질 기능 조사를 가능하게 합니다.
- 고해상도 이미징은 세포 과정에 대한 귀중한 데이터를 제공합니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma R&D teams to isolate mitotic functions of multifunctional proteins that also regulate interphase processes, reducing target validation ambiguity. By synchronizing cell populations and applying high-resolution confocal microscopy, researchers obtain quantitative, phase-specific data essential for mechanistic de-risking in early discovery. The approach supports predictive confidence in target selection by distinguishing mitotic from interphase roles, informing go/no-go decisions in oncology and cell cycle-targeted therapeutic pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by isolating mitotic roles of proteins with dual interphase/mitotic functions.
- Operational Value: Enables functional target validation through phase-specific perturbation and imaging.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by clarifying whether observed phenotypes stem from mitotic or interphase activity.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces synchronized mitotic cell populations for consistent, reproducible compound or siRNA screening.
- Quantitative Output: Enables measurement of mitotic progression, chromosome alignment, and segregation defects as assay endpoints.
- Scalability: Compatible with high-resolution imaging platforms for multi-well format adaptation and large sample acquisition.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Mitotic defects observed in synchronized cells model chromosomal instability relevant to cancer phenotypes.
- Translational Continuity: Links discovery-phase target validation to preclinical models via conserved mitotic mechanisms.
- Risk-Adjusted Decisions: Provides mechanistic insight to prioritize targets with reduced likelihood of on-target interphase toxicity.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, providing mitotic-specific functional data before compound screening or phenotypic assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling conditional depletion and visualization of protein function in defined mitotic stages.
- Screening: Generates standardized, synchronized mitotic cells suitable for assay-dependent readouts like kinetochore-microtubule stability or anaphase timing.
- Analytics: Delivers quantitative imaging metrics (e.g., metaphase-to-anaphase transition, kinetochore fiber intensity) for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects mitotic protein function to chromosomal stability phenotypes with relevance to preclinical cancer models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable synchronization and imaging workflow applicable across multiple targets in the cell cycle and mitosis space.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in target validation by separating mitotic from interphase protein functions.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible cell preparation and imaging compatible with confocal microscopy workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence by providing phase-resolved functional data early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted target prioritization by identifying proteins with selective mitotic roles and lower interphase liability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture synchronization, siRNA transfection, and immunofluorescence or live-cell imaging protocols.
- Depends on access to high-resolution confocal microscopy with Z-stack capability and appropriate laser/filter sets for GFP, mCherry, and DAPI.
- Necessitates standardization of thymidine block/release timing and fixation/permeabilization conditions across users and cell lines.
- Adaptation to non-HeLa systems may require optimization of synchronization efficiency and mitotic marker expression.
- Practical limitations include the need for careful toxin handling (paraformaldehyde, DAPI) and potential siRNA off-target effects requiring controls.
