Name: 유사 분열 동안 다기능 세포 주기 단백질의 역할을 연구 하기 Mitotic 세포 동기화와 고해상도 Confocal 현미경 검사 법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: 학습하세요 HeLa 세포의 이중 티미딘 동기화와 고해상도 공초점 현미경을 이용하여 유사 분열 단계에서 다기능 단백질의 역할을 연구하는 방법을. 이 기법은 세포 주기 역학과 단백질 기능을 정밀하게 분석하는 데 활용됩니다.

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우리는 안정적으로 mCherry-히스톤 H2B GFP-α-tubulin 표현 HeLa 세포를 공유 하기 위한 동북 대학, 일본의 박사 고조 다나카에 감사. 이 작품은 DV (R00CA178188)에 NCI 그랜트와 노스웨스턴 대학에서 창업 자금 지원 되었다.

1. 더블 티 미 딘 블록 및 릴리스: 시 약 준비
<ol><li>500 mL Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 매체와 10 %FBS, 페니실린, 스 보충을 확인 합니다.</li>
	<li>살 균 물과 aliquots-80 ° c.에 있는 매장에서 티 미 딘 100 m m 재고 확인</li>
</ol>2. 프로토콜 Mitotic 진행 (그림 1A)의 고정된 셀 이미징에 대 한
<ol><li>6 잘 플레이트 커버 슬립 (70% 에탄올과 UV 방사선 살 균)과 DMEM 매체의 2 mL의 우물으로 하루 1, 105 HeLa 세포 x 씨 ~ 2. 37 ° C, 5% CO2에서 24 h에 대 한 습도 인큐베이터에서 세포 성장.</li>
	<li>1세인트 티 미 딘 블록: 하루에 2, 철저 하 게 신선한 DMEM 미디어 (100 m m 재고, 2mm 최종 농도)에 티 미 딘의 필요한 볼륨을 혼합.</li>
	<li>티 미 딘을 포함 하의 2 개 mL를 추가 셀 6-우물의 각 음에 미디어 접시 및 18h에 품 어.</li>
	<li>3 일에 매체를 발음 하 고 씻고 1 x PBS의 2 mL로 두 번 셀과 신선한 prewarmed DMEM; 한 번 9 h 블록에서 셀 출시를 위한 신선한 prewarmed DMEM 매체에서 세포를 성장 한다.</li>
	<li>2차 티 미 딘 블록: 다시 티 미 딘을 포함 하의 2 개 mL를 추가 미디어 (2mm 최종 농도) 셀 6 잘 플레이트의 각 음에.</li>
	<li>또 다른 18 h에 대 한 품 어.</li>
	<li>4 일에 매체를 발음 하 고 1 x PBS의 2 mL로 두 번 셀 및 신선한 prewarmed DMEM 한 번 씻어.</li>
	<li>(제어 및 Cdt1) 희석 siRNAs와 transfection 시 약 10 분에 대해 별도로 혈 청 무료 성장 매체에 혼합 그들이 함께 실시간에 20 분 동안 품 어 각 transfection에 사용 되는 siRNA의 최종 농도 100 nM. 티 미 딘에서 세탁 셀에 반응 혼합물을 추가 합니다.</li>
	<li>차단 해제 4% 커버 슬립에 셀을 수정 하 9-10 h 37 ° C에서 세포를 품 어 PFA 실시간에서 20 분 주의: PFA는 독성, 적절 한 보호를 착용.</li>
	<li>
Immunostain 셀, RT에서 10 분 동안 0.5% (v/v) 세제 permeabilizing 및 5 분의 1 x PBS로 두 번 셀을 세척 후.
	<ol>
<li>1 시간 뒤에 1% (w/v)에 1 차 항 체 (마우스 안티-α-tubulin 항 체 1:1, 000, 토끼 안티-Zwint1 항 체 희석 1:400, 및 안티-인-ɣ H2AX 희석 1:300에서 마우스에 희석)의 50 µ L로 세포를 치료 하는 RT에 대 한 1 x PBS에서 1 %BSA (w/v)으로 세포를 차단 1 x 1 h 37 oc.에 대 한 PBS에 BSA</li>
		<li>씻은 후 1 x PBS로 세포 밖으로 몇 번이 고, 실시간에 1 시간에 50 µ L의 각 커버 유리 (알 렉 사 488와 1% (w/v) BSA 1 x PBS에서 1: 250 희석에 Rhodamine 빨간색)에 대 한 2 차 항 체와 세포 치료</li>
		<li>씻은 후 5 분 동안 두 번 1 x PBS와 셀, DAPI와 세포 치료 (0.1µg / mL 1 x PBS에) 실시간에서 5 분</li>
		<li>씻은 후 5 분 동안 두 번 1 x PBS와 셀, 셀 분명 현미경 슬라이드에 적절 한 설치 미디어를 직면 하 고 커버 슬립을 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>60 X 100 X 1.4 나 계획 Apochromatic DIC 기름 침수 목표와 immunostained 단백질에 대 한 셀 필요한 이미지의 품질에 대 한 필요에 따라 적절 한 카메라를 장착 하는 거꾸로 높은 해상도 confocal 현미경에 장착 된 이미지.</li>
	<li>Z-스택 소프트웨어를 사용 하 여 0.2 µ m 두께의 현미경에 적합으로 실 온에서 이미지를 취득 합니다.</li>
</ol>3. 프로토콜 Mitotic 진행 (그림 3A)의 라이브 셀 이미징에 대 한
<ol><li>하루에 1, 씨앗 약 0.5-1 x 105 HeLa 세포 안정적 DMEM 매체의 1.5 mL와 35 m m 유리 하단 요리에 mCherry H2B GFP-α-tubulin (약간 세포 유형 및 표현 하는 단백질을 기준으로 변수) 표현 하 고는 습도에 그들을 성장합니다 37 oC, 5% CO2에서 24 h에 대 한 보육.</li>
	<li>1세인트 티 미 딘 블록: 하루에 2, 포함 하는 티 미 딘 1.5 mL를 추가 셀 접시 (100 m m 티 미 딘, 2mm 최종 농도)에 미디어.</li>
	<li>18 h에 품 어.</li>
	<li>3 일에 티 미 딘을 포함 하는 매체를 발음 하 고 몇 번이 고, 두 번 1 x PBS의 2 mL와 함께 한 번 신선한 prewarmed DMEM 세포를 씻어.</li>
	<li>(제어 및 Hec1) 희석 siRNAs와 transfection 시 약 10 분에 대해 별도로 혈 청 무료 성장 매체와 함께 그들을 혼합 실시간에 20 분 동안 품 어 각 transfection에 사용 되는 siRNA의 최종 농도 100 nM. 티 미 딘에서 세탁 셀에 반응 혼합물을 추가 합니다.</li>
	<li>8 h 블록에서 셀 출시를 위한 신선한 prewarmed DMEM 매체의 1.5 ml에서 세포 성장.</li>
	<li>2차 티 미 딘 블록: 포함 하는 티 미 딘 1.5 mL를 추가 미디어 (2mm 최종 농도) 접시에 셀.</li>
	<li>또 다른 18 h에 대 한 품 어.</li>
	<li>하루에 4, 매체를 발음 하 고 몇 번이 고, 두 번 1 x PBS의 2 mL와 함께 한 번 신선한 prewarmed DMEM 세포를 씻어. 그런 다음 셀을 성장에서 신선한 prewarmed Leibovitz의 (L-15) 중간 보충 10 %FBS 20 mM HEPES 8 h 블록에서 셀 출시를 위한 pH 7.0에서.</li>
	<li>이미 무대와 실험 온도 안정 시키기 위해 이미징 시작 하기 전에 적어도 30 분에 전환 했다는 고해상도 confocal 현미경에 설정 온도 제어 챔버에 접시를 놓습니다.</li>
	<li>셀 표시 될 때까지 60 x 목적으로 밝은 분야에 초점을 맞춥니다 다음 수동으로 선택의 영역에는 무대를 구별 합니다.</li>
	<li>빛과 레이저 전원/노출, 이미지 수집 매개 변수 및 선택의 현미경 이미지 수집 소프트웨어를 사용 하 여 실험 기간을 설정 합니다. GFP (488 여기; 385 nm 방출) 및 mCherry (561 nm 여기 및 385 nm 방출) 이미지에 대 한 필터를 사용 합니다.</li>
	<li>별도로 최대 16 h 동안 펄스 전송된 빛과 형광 이미지 마다 10 분을 획득 하 여 시간 경과 실험을 수행 합니다.</li>
	<li>현미경에 적합 한 소프트웨어를 사용 하 여 이중 티 미 딘 블록에서 출시 후 9 h는 12 1.0 µ m 구분 된 z 비행기로 이미지를 취득 합니다.</li>
	<li>Mitotic 진행에 대 한 개별 셀을 추적 하는 이미지를 분석 하 고 마지막으로 소스 소프트웨어 피지/ImageJ 해당 영화를 조립.</li>
</ol>

<ol><li>Lajtha, L. G., Oliver, R., Berry, R., Noyes, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+radiation+effect+on+the+process+of+synthesis+of+deoxyribonucleic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of radiation effect on the process of synthesis of deoxyribonucleic acid.</a> Nature. 182 (4652), 1788-1790 (1958).</li>
<li>Puck, T. T., Steffen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+Cycle+Analysis+of+Mammalian+Cells.+I.+A+Method+for+Localizing+Metabolic+Events+within+the+Life+Cycle%2C+and+Its+Application+to+the+Action+of+Colcemide+and+Sublethal+Doses+of+X-Irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Life Cycle Analysis of Mammalian Cells. I. A Method for Localizing Metabolic Events within the Life Cycle, and Its Application to the Action of Colcemide and Sublethal Doses of X-Irradiation.</a> Biophys. J. 3, 379-392 (1963).</li>
<li>Santaguida, S., Musacchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+life+and+miracles+of+kinetochores%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The life and miracles of kinetochores.</a> EMBO J. 28 (17), 2511-2531 (2009).</li>
<li>Musacchio, A., Desai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Molecular+View+of+Kinetochore+Assembly+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">A Molecular View of Kinetochore Assembly and Function.</a> Biology (Basel). 6 (1), E5(2017).</li>
<li>Chaudhry, M. A., Chodosh, L. A., McKenna, W. G., Muschel, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+HeLa+cells+in+G1+or+G2+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of HeLa cells in G1 or G2 phases.</a> Oncogene. 21 (12), 1934-1942 (2002).</li>
<li>Zhou, J. Y., Ma, W. L., Liang, S., Zeng, Y., Shi, R., Yu, H. L., Xiao, W. W., Zheng, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+microRNA+expression+profiles+during+the+cell+cycle+in+synchronized+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Rep%22%5BJournal%5D)">Analysis of microRNA expression profiles during the cell cycle in synchronized HeLa cells.</a> BMB Rep. 42 (9), 593-598 (2009).</li>
<li>Stumpf, C. R., Moreno, M. V., Olshen, A. B., Taylor, B. S., Ruggero, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+translational+landscape+of+the+mammalian+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The translational landscape of the mammalian cell cycle.</a> Mol. Cell. 52 (4), 574-582 (2013).</li>
<li>Chen, X., Simon, E. S., Xiang, Y., Kachman, M., Andrews, P. C., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+analysis+of+cell+cycle-regulated+Golgi+disassembly+and+reassembly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics analysis of cell cycle-regulated Golgi disassembly and reassembly.</a> J. Biol. Chem. 285 (10), 7197-7207 (2010).</li>
<li>Rosner, M., Schipany, K., Hengstschläger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merging+high-quality+biochemical+fractionation+with+a+refined+flow+cytometry+approach+to+monitor+nucleocytoplasmic+protein+expression+throughout+the+unperturbed+mammalian+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle.</a> Nature Protocols. 8 (3), 602-626 (2013).</li>
<li>Coquelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+non-synchronized+cells+in+the+G1%2C+S+and+G2+phases+of+the+cell+cycle+for+the+study+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Enrichment of non-synchronized cells in the G1, S and G2 phases of the cell cycle for the study of apoptosis.</a> Biochem. Pharmacol. 72 (11), 1396-1404 (2006).</li>
<li>Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Synchronization procedures.</a> Methods Enzymol. 351, 457-467 (2002).</li>
<li>Cooper, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rethinking+synchronization+of+mammalian+cells+for+cell+cycle+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Rethinking synchronization of mammalian cells for cell cycle analysis.</a> Cell Mol. Life Sci. 60 (6), 1099-1106 (2003).</li>
<li>Whitfield, M. L., Sherlock, G., Saldanha, A. J., Murray, J. I., Ball, C. A., Alexander, K. E., Matese, J. C., Perou, C. M., Hurt, M. M., Brown, P. O., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+periodically+expressed+in+the+human+cell+cycle+and+their+expression+in+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors.</a> Mol. Biol. Cell. 13 (6), 1977-2000 (2002).</li>
<li>Vassilev, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+small-molecule+inhibitor+reveals+critical+mitotic+functions+of+human+CDK1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Selective small-molecule inhibitor reveals critical mitotic functions of human CDK1.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (28), 10660-10665 (2006).</li>
<li>Varma, D., Chandrasekaran, S., Sundin, L. J., Reidy, K. T., Wan, X., Chasse, D. A., Nevis, K. R., DeLuca, J. G., Salmon, E. D., Cook, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+the+human+Cdt1+replication+licensing+protein+by+the+loop+domain+of+Hec1+is+required+for+stable+kinetochore-microtubule+attachment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Recruitment of the human Cdt1 replication licensing protein by the loop domain of Hec1 is required for stable kinetochore-microtubule attachment.</a> Nat. Cell Biol. 14 (6), 593-603 (2012).</li>
<li>Garcia, M., Westley, B., Rochefort, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Bromodeoxyuridine+specifically+inhibits+the+synthesis+of+estrogen-induced+proteins+in+MCF7+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">5-Bromodeoxyuridine specifically inhibits the synthesis of estrogen-induced proteins in MCF7 cells.</a> Eur. J. Biochem. 116 (2), 297-301 (1981).</li>
<li>Bostock, C. J., Prescott, D. M., Kirkpatrick, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+the+double+thymidine+block+for+synchronizing+mammalian+cells+at+the+G1-S+border%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">An evaluation of the double thymidine block for synchronizing mammalian cells at the G1-S border.</a> Exp. Cell Res. 68 (1), 163-168 (1971).</li>
<li>Martin-Lluesma, S., Stucke, V. M., Nigg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Hec1+in+spindle+checkpoint+signaling+and+kinetochore+recruitment+of+Mad1%2FMad2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of Hec1 in spindle checkpoint signaling and kinetochore recruitment of Mad1/Mad2.</a> Science. 297, 2267-2270 (2002).</li>
<li>Brouwers, N., Mallol Martinez, N., Vernos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Kif15+and+its+novel+mitotic+partner+KBP+in+K-fiber+dynamics+and+chromosome+alignment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Role of Kif15 and its novel mitotic partner KBP in K-fiber dynamics and chromosome alignment.</a> PLoS One. 12 (4), e0174819(2017).</li>
<li>Dou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+localization+of+Mps1+kinase+to+kinetochores+is+essential+for+accurate+spindle+microtubule+attachment%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Dynamic localization of Mps1 kinase to kinetochores is essential for accurate spindle microtubule attachment.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), E4546-E4555 (2015).</li>
<li>Chan, Y. W., Jeyaprakash, A. A., Nigg, E. A., Santamaria, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aurora+B+controls+kinetochore-microtubule+attachments+by+inhibiting+Ska+complex-KMN+network+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Aurora B controls kinetochore-microtubule attachments by inhibiting Ska complex-KMN network interaction.</a> J Cell Biol. 196 (5), 563-571 (2012).</li>
</ol>

저자 들은 경쟁 금융 관심 선언 합니다.

이중 티 미 딘 동기화의 가장 중요 한 장점은 이러한 세포 유사 분열 염색체 맞춤, 양극의 분석 또한 활성화 한 마음으로 입력의 많은 짧은 시간 창에 mitotic 세포의 증가 샘플 크기 제공 훨씬 더 높은 효율성과 형성과 염색체 분리를 주축.
많은 규제 단백질 복합물 및 신호 통로 유사 분열을 통해 정상적인 진행을 보장에 헌신 하는 고이 과정의 규제 완화 수 있습니다 tumorigenesis. 라이브 셀 이미징 HeLa 세포 안정적으로 mCherry H2B와 GFP tubulin 그리고 대부분 제어 셀 코 (그림 3B) 후 anaphase 약 60 분 이내에 그들의 염색체 분리 이중 티 미 딘 블록 쇼에서 발표의. 다른 한편으로, Hec1 기능을 보여줍니다 대부분 셀 고르지 염색체 anaphase 발병 또는 apoptosis (그림 3C)와 오랜 기간 동안 mitotic ...

세포 주기에서 세포 그들의 게놈 및 확산의 정확한 복제에 대 한 높은 규제 하 고 일시적으로 제어 이벤트의 시리즈를 받 다. 포유류에서 세포 주기 interphase 및 M으로 구성 됩니다. Interphase에 구성 된 3 단계-G1, S, 및 g 2 셀 그것의 게놈을 복제 하 고 정상적인 세포 주기 진행1,2에 필요한 증가 겪 습. M-단계에서 이루어진 유사 분열 (의향, prometaphase, 분열, anaphase, 및 telophase) cytokinesis, 부모의 셀 두 유전으로 동일한 딸 세포를 생성 합니다. 그 뒤 분열 중 기 격판덮개 (분열)에 그들의 정렬 드라이브 유사 분열, 중복 된 게놈의 chromatids 압축된 (의향) 이며 조립된 mitotic 스핀 들 (prometaphase)의 microtubules 잡혀 자신의 kinetochores에 자매 들 자매 chromatids는으로 분할 하 고 반대 스핀 들 이송 기둥 (anaphase) 분리를 동등한. 2 개의 딸 세포는 걸 기반으로 수축 성 반지 (telophase 및 cytokinesis)의 활동에 의해 물리적으로 구분 됩니다. kinetochore chromatids의 centromeric 지역에서 조립 전문된 배치할 구조 이며 스핀 들 microtubules에 대 한 첨부 파일 사이트 역할. 그것의 주요 기능은 염색체 캡처, 맞춤, 운전 하 여 염색체 분리3,4의 충실도 유지 하기 위해 스핀 들 어셈블리 검사점을 중재 하는 동안 부적 절 한 스핀 들 microtubule 첨부 파일 수정에 도움이입니다.
셀 동기화의 기술은 세포 주기 진행에 관련 된 분자 구조 이벤트를 이해 하기 위한 이상적인 도구 역할을 합니다. 이 접근은 다양 한 형태의 분석, 유전자 발현의 프로 파일링을 포함 하 여 세포질 생화학 과정의 분석 및 단백질의 subcellular 지 방화의 검출에 대 한 특정 단계에서 세포 인구를 풍부 하 게 사용 되었습니다. 개별 유전자 제품의 연구 뿐만 아니라 전체 게놈 유전자 식5, 미르 식 패턴6, microarray 분석 등의 분석을 포함 하는 방법에 대 한 동기화 된 포유류 세포를 사용할 수 있습니다. 변환 규칙7, 그리고 단백질 수정8의 proteomic 분석. 동기화는 또한 세포 주기 진행에 유전자 발현 이나 단백질 노크 다운 또는 노크-아웃, 또는 화학 물질의 효과 연구에 사용할 수 있습니다.
세포 세포 주기의 여러 단계에서 동기화 할 수 있습니다. 물리적, 화학적 방법은 널리 셀 동기화에 사용 됩니다. 셀 동기화에 대 한 가장 중요 한 기준은 동기화 되도록 noncytotoxic 하 고 되돌릴 수 있습니다. 동기화 약리학 대리인에 의해 세포의 잠재적인 불리 한 세포 결과, 때문에 화학 종속 방법을 공부 하는 주요 세포 주기 이벤트에 대 한 유리한 수 있습니다. 예를 들어 hydroxyurea, amphidicolin, mimosine, 그리고로 바 스타 틴, G1/S 단계에서 셀 동기화에 사용할 수 있습니다 하지만, 그들이 억제 생화학 경로에 그들의 효력 때문에 그들은 세포 주기 검문소 메커니즘을 활성화 하 고 중요 한 죽 셀9,10일부 다른 한편으로, "티 미 딘 블록"로 알려진 성장 매체에 티 미 딘을 추가 하 여 DNA 복제의 피드백 저해 특정 포인트11,,1213에 세포 주기를 체포 수 있습니다. 또한 nocodazole와로-33069,14처리 하 여 셀 G2/M 단계에 동기화 수 있습니다. Nocodazole, microtubule 어셈블리를 방지 하는 상대적으로 높은 세포 독성. 또한, nocodazole 체포 셀 interphase 조 mitotic 미끄럼으로 돌아갈 수 있습니다. 이중 티 미 딘 블록 체포 셀 g 1/S 단계에서 블록에서 출시 후, 셀 통해 G2 및 유사 분열으로 동시 진행을 찾을 수 있습니다. 티 미 딘 블록에서 발표 하는 세포의 세포 주기의 정상적인 진행 셀 고정 또는 라이브 영상으로 높은 해상도 confocal 현미경에서 관찰할 수 있습니다. 셀 입력 하 고 이중 티 미 딘 블록에서 출시 후 유사 분열을 통해 진행 하는 경우에 특히 mitotic 단백질의 섭 동 효과 공부 될 수 있다. Cdt1, 다기능 단백질 DNA 복제 원점 g 1 단계에서 라이센스에 관련 된 이며, 유사 분열15중 kinetochore microtubule 첨부 파일에 대 한 필요 이기도. 유사 분열 동안 Cdt1의 기능을 공부 하나는 복제 라이센스만 G2/M 단계 동안 특히 그것의 소모를 초래 하는 동시에 g 1 단계에 고갈의 효과 방지 하는 방법을 채택 해야 합니다. 여기, 우리는 고정 및 라이브 셀 이미징에 의해 이중 티 미 딘 블록 세포 주기의 다른 단계 동안 여러 기능을 수행 하는 단백질의 mitotic 역할을 연구 하기에 따라 상세한 프로토콜 제시.

<table><tbody><tr><td>DMEM (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td>4 &deg에 저장; C</td></tr><tr><td>DPBS (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td>4 &deg에 저장; C</td></tr><tr><td>레보비츠' s (1x) L-15 medium</td><td>Life Technologies</td><td>21083-027</td><td>4 &deg에 저장; C</td></tr><tr><td>세럼 감소 매체 (Opti-MEM)</td><td>Life Technologies</td><td>319-85-070</td><td>Store at 4 &deg; C</td></tr><tr><td>페니실린과 스트렙토 마이신</td><td>생명 기술</td><td>15070-063 (펜 스트렙)</td> <td>1 : 1,000 희석</td></tr><tr><td>Dharmafect2</td><td>GE Dharmacon</td><td>T-2002-02</td><td>4 &deg에 저장; C</td></tr><tr><td>Thymidine</td><td>MP Biomedicals LLC</td><td>103056</td><td>멸균 용해수에 용해</td></tr><tr><td>Cdt1 siRNA</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Ref 10</td></tr><tr><td>Hec1 siRNA</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Ref 13</td></tr><tr><td>GFP-H2B</td><td></td><td></td><td></td>를 발현하는 HeLa</tr><tr><td>세포 GFP-&알파;-튜불린 및 mCherry H2B</td><td>도호쿠의 Kozo Tanaka 박사의 관대한 선물 일본</td><td></td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드 용액</td><td>Sigma-Aldrich Corporation</td><td>F8775</td><td>독성, 주의 필요</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich Corporation</td><td>D9542</td><td>독성, 주의 필요</td></tr><tr><td>마우스 안티-&알파;-튜불린</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Sc32293</td><td>1:1,000 희석</td></tr><tr><td>토끼 개미-Zwint1</td><td>Bethyl</td><td>A300-781A</td><td>1:400 희석</td></tr><tr><td>마우스 anti-phospho-&gamma; H2AX (Ser139)</td><td>Upstate Biotechnology</td><td>05-626, 클론 JBW301</td><td>1:300 희석</td></tr><tr><td>Alexa 488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td></td><td>1:250 희석</td></tr><tr><td>Rodamine Red-X</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td></td><td>1:250 희석</td></tr><tr><td>BioLite 6 웰 멀티디쉬</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130184</td><td></td></tr><tr><td>35mm 유리 바닥 접시</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35GCOL-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>니콘 이클립스 TiE 도립 현미경</td><td>니콘 악기</td><td></td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 용 회전 디스크</td><td>요카가와</td><td>CSU-X1</td><td></td></tr><tr><td>울트라 888 EM-CCD 카메라</td><td>Andor</td><td>iXon 울트라 EMCCD</td><td></td></tr><tr><td>4 파장 레이저</td><td>현미경 용 애질런트 기술</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인큐베이션 시스템</td><td>Tokai Hit</td><td>TIZB</td><td></td></tr><tr><td>NIS-elements 소프트웨어</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

유사 분열 동안 다기능 세포 주기 단백질의 역할을 연구 하기 mitotic 세포 동기화와 고해상도 confocal 현미경 검사 법

Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis

연구 단계에 종속적으로 세포 주기의 다양 한 규제 이벤트의 세포 성장 및 부문에 대 한 명확한 이해를 제공합니다. 세포 인구 세포 사이클의 특정 단계에서 동기화 실험적인 노력에 매우 유용 하 게 발견 되었습니다. 치료는 상대적으로 덜 독성 화학 물질에 의해 세포의 동기화 연구 결과 세포 주기 이벤트 하 고 선택한 mitotic 단계의 특정 농축을 위한 약리 억제 약물의 사용을 통해 유리한 수 있습니다. 동기화 인간의 세포는 세포의 여러 단계에서 S 단계 및 이중 티 미 딘 블록와 M 단계 모두를 포함 하 여 주기 고 염색체 정렬에 mitotic 단백질의 기능을 공부에 대 한 절차를 공개 프로토콜 설명 하는 여기, 그리고 분리입니다. 이 프로토콜 설립된 interphase 기능을 소유 하는 다기능 단백질의 mitotic 역할을 공부 하는 데 매우 유용 했습니다. 우리의 경우에서 Cdt1, 복제 원점 g 1 단계에서 라이센스에 대 한 중요 한 단백질의 mitotic 역할 수 수 공부 효과적으로 g 2/M-특정 Cdt1 고갈 될 수 있는 경우에. 우리는 더블 티 미 딘 동기화를 사용 하 여 g 2/M-특정 Cdt1의 고갈에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 또한 셀 고정, 프로토콜을 설명 하 고 라이브 셀 이미징 티 미 딘 릴리스 후 고해상도 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여. 방법은 하나 고정 및 라이브 셀 mitotic 세포의 큰 샘플 크기를 수 있습니다 Hec1, 복잡 한, Ndc80의 구성 요소와 같은 생리 적 및 교란 조건에서 mitotic 단백질의 기능을 분석 하는 데 유용도 분석으로 우리가 여기에 표시.

Mitotic 진행 및 셀에서 microtubule 안정성의 연구에서 출시 후 두 티 미 딘 블록 고정 Cdt1 g 1 단계에서 DNA 복제 근원의 라이선스에 포함 된다. 그것은 S 단계 저하 하지만 다시 G2/M 단계에 축적. 공부 하 고 유사 분열에서의 역할, 생 Cdt1를 사용 하 여 가장 적합 한 셀 동기화 기법, 더블 티 미 딘 블록15G/M 단계에서 구체적으로 고갈 될 필요가 있다. 셀에에서 있을 때 셀 S 단계 및 시간에 의해 또한 Cdt1 기능 필요, g 1에서 복제 근원의 라이선스 오래 완료 2nd 티 미 딘 블록에서 출시 직후 siRNAs와 페 했다. 9 h siCdt1 transfection와 더블 티 미 딘 블록 출시 후 Cdt1 고갈 부 럽 (그림 1B)에 의해 검증 되었다. 고정 셀 9 h 이중 ...

선물이 HeLa 세포 분석 고해상도 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 다음의 더블 티 미 딘 동기화에 대 한 프로토콜. 이 메서드는 동기적으로 S 단계에서 또한 interphase 기능을 소유 하는 다기능 단백질의 mitotic 역할에 대 한 연구를 활성화 하는 유사 분열을 진행 하는 셀의 많은 수를 얻기에 키.

유사 분열 동안 다기능 세포 주기 단백질의 역할을 연구 하기 Mitotic 세포 동기화와 고해상도 Confocal 현미경 검사 법

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The ...

이 절차의 전반적인 목표는 이중 티미딘 동기화 및 고해상도 컨포칼 현미경을 사용하여 중요한 간기 기능을 가질 수 있는 다기능 단백질의 유사분열 역할을 연구하는 것입니다. 이 방법은 세포 주기 및 유사분열에 관여하는 단백질의 정상적인 기능을 설명하는 방법에 대한 세포 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세포가 정상적인 생리적 행동을 유지할 수 있고 이 방법을 수행하기가 매우 쉽다는 것입니다.이 절차를 시연하는 사람은 이 방법의 사용 전문가인 제 연구실의 박사후 연구원인 Dr.Mohammed Amin입니다. 유사분열 세포 진행의 고정 세포 이미징을 위해 70% 에탄올 및 UV 멸균 커버 슬립과 2밀리리터의 DMEM 배지를 포함하는 6웰 플레이트의 각 웰에 약 2배의 10에서 5번째 HeLa 세포를 파종하는 것으로 시작합니다. 세포 배양 인큐베이터에서 24시간 후, 웰당 2ml의 갓 희석된 티미딘과 신선한 배지로 세포를 차단하고 플레이트를 다시 18시간 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다.다음날, PBS 2밀리리터로 세포를 두 번 씻고 신선한 섭씨 37도 배지로 한 번 씻습니다. 세포를 9시간 동안 인큐베이터에 다시 넣어 블록에서 세포를 분리한 다음 웰당 2ml의 티미딘 보충 배지를 더 추가합니다. 두 번째 차단 배양 후, 2 밀리리터의 PBS로 세포를 두 번 세척하고 2 밀리리터의 신선한 섭씨 37 ° 배지로 한 번 세척하고 새로 제조 된 siRNA 100 나노 몰을 적절한 웰에 첨가합니다.9-10시간 후 상등액을 흡인하고 실온에서 20분 동안 4%의 파라포름알데히드로 커버 슬립에 세포를 고정합니다. PBS로 세척한 후 실온에서 0.5% 세제로 10분 동안 고정 셀을 투과시킨 다음 PBS에서 5분 동안 2회 세척합니다. PBS에서 1% BSA로 세포를 실온에서 1시간 동안 차단합니다.그런 다음 섭씨 37도에서 1시간 동안 50마이크로리터의 관심 항체로 세포에 라벨을 붙입니다. 배양이 끝나면 PBS에서 세포를 세 번 세척하고 50마이크로리터의 적절한 관심 2차 항체로 라벨링합니다. 실온에서 1시간 후, 각 세척마다 5분씩 PBS에서 세포를 두 번 세척하고 실온에서 5분 동안 DAPI로 세포에 라벨을 붙입니다.PBS에서 5분씩 두 번 세척하여 DAPI 염색을 수행하고 적절한 장착 매체를 사용하여 개별 투명 현미경 슬라이드에 커버 슬립을 장착합니다. 그런 다음 적절한 카메라가 장착된 도립 고해상도 컨포칼 현미경에 장착된 60 또는 100 X 1.4 개구수 계획 아포크매틱 DIC 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하여 0.2마이크로미터 두께의 Z 스택에서 면역염색된 단백질의 이미지를 획득합니다. 유사분열 세포 진행의 살아있는 세포 이미징을 위해 mCherry H2B 및 GFP 알파 튜불린을 안정적으로 발현하는 mCherry H2B 및 5번째 HeLa 세포에 약 0.5 - 1배 10을 1.5ml의 DMEM 배지가 포함된 35ml 유리 바닥 접시에 파딩합니다.세포 배양 인큐베이터에서 24시간 동안 세포를 성장시킵니다. 그런 다음, 티미딘은 방금 설명한 것처럼 세포를 두 번 차단하고, 이번에는 각 티미딘 블록의 끝에서 2밀리리터의 PBS로 세포를 두 번, 예열 DMEM 배지 1밀리리터로 한 번 세척하고 첫 번째 티미딘 세척 중 첫 번째 블록 후 siRNA로 세포를 처리합니다. 10% FBS와 20밀리몰 HEPES를 보충한 신선하고 예열된 Leibovitz's 배지에서 세포를 8시간 동안 성장시켜 두 번째 블록에서 세포를 방출합니다.그런 다음 첫 번째 플레이트를 고해상도 컨포칼 현미경의 온도 제어 챔버에 놓고 60X 대물렌즈 및 명시야 이미징을 사용하여 세포에 초점을 맞춥니다. 세포가 보이면 플레이트 위치를 선택한 영역으로 수동으로 조정하고 이미지 획득 소프트웨어를 사용하여 레이저 출력 및 노출, 이미지 획득 매개변수 및 실험 기간 기간을 설정합니다. 적절한 GFP 및 mCherry 필터를 선택하고 최대 16시간 동안 10분마다 펄스 투과광 및 형광 이미지를 획득하여 유사분열 과정의 타임 랩스 이미지를 얻을 수 있습니다.이중 티미딘 블록에서 방출된 후 9시간 후에 1마이크로미터 분리된 12개의 z-평면에서 이미지를 획득합니다. 그런 다음 개별 유사분열 세포를 추적하여 이미지를 분석하고 적절한 소스 소프트웨어를 사용하여 해당 동영상을 조립합니다. 대부분의 대조군 및 Cdt1 siRNA 세포는 이중 티미딘 블록에서 방출된 후 9시간에 중기 단계에 있지만, 10시간에 고정하면 대부분의 Cdt1 siRNA 처리 세포는 후기 중복사기에 여전히 정지되어 있는 반면, 대조 세포는 아나페이즈에 들어가 예상대로 염색체를 분리하는 것으로 나타났습니다.이중 티미딘 블록에서 방출된 후 9시간 후 냉 처리하면 대조군 고갈 세포 내의 세포에 비해 Cdt1이 고갈된 세포에서 상대적으로 덜 견고한 안정적인 동키토코어 미세소관의 유지를 촉진합니다. DNA 복제 기원 라이선스는 G2-M 단계에서 Cdt1 또는 대조군이 고갈된 세포에서 교란되지 않는데, 이는 이러한 세포가 후속 G2 단계에서 DNA 손상의 마커인 인광화된 감마 H2AX의 축적을 유도하는 것으로 밝혀지지 않았기 때문입니다. 그러나 비동시성 배양액의 Cdt1 siRNA transfection은 부적절한 DNA 복제 라이선싱으로 인한 DNA 손상으로 인해 phospho gamma H2AX positive foci의 축적을 유도합니다.핵막이 파괴된 후 정상 세포는 유사분열에 들어가 약 30분에서 60분 이내에 유사분열에서 벗어나기 위해 아나페이즈 발병을 겪습니다. 그러나 강력한 키네토코어 미세소관 부착 형성에 필요한 핵심 키네토코어 단백질인 Hec1의 RNAi 매개 녹다운은 몇 시간의 유사분열 지연 후에도 아나페이즈 시작 또는 유사분열 종료로의 정상적인 유사분열 진행을 지연시킵니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행되면 3-4일 안에 완료할 수 있습니다.시술을 시도하는 동안 냉동실에서 티미딘을 해동한 후 티미딘을 완전히 녹여야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 웨스턴 블로팅(western blotting)과 같은 다른 방법을 수행하여 다음과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다: 유사분열 중 관심 단백질의 발현 패턴은 간기(interphase)와 비교됩니다. 개발 후 이 기술은 세포 생물학 분야의 연구자들이 인간 세포 배양 모델에서 암 생물 발생을 탐구하고 고해상도 컨포칼 현미경을 사용하여 관심 단백질의 세포주기 관련 기능을 식별할 수 있는 길을 열었습니다.파라포름알데히드 및 DAPI와 같은 시약으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑과 실험실 가운을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기 이미지는 기본 프로토콜을 설명하고 siRNA의 transfection 후 라이브 포유 동물 조직 배양 세포의 mitotic 타이밍을 계량.

siRNA Transfection 후의 유사 분열의 시간 저속 영상

SAC는 자매 chromatids의 mitotic의 분리를 모니터링의 신호를 시작하는 곳이 kinetochore입니다. 방법으로 염색체 운동과 함께 kinetochore 단백질과 그 조정 중 하나의 모집 및 매출을 시각화하기 위해 설명되어...

생활에서 보여주는 동적 Kinetochore 단백질 행동과 염색체 모션으로 Mitotic 검사 점 유학<em&gt; Drosophila</em&gt; Syncytial 태아

전환이 anaphase-추진 단지 (APC / C)에 의존 ubiquitination과 여기 cyclin B.의 후속 파괴를, 우리는, 펄스 - 체이스 라벨에 따라, 시스템을 설립 전체 세포 인구에서 cyclin B의 proteolysis를 모니터링 할 수 있으며를 통해 실행됩니다 anaphase에 Metaphase mitotic 검문소에 의한 간섭의 검색을 용이하게한다.

전체 세포 인구의 단일 셀 수준에서 Cyclin B의 Proteolysis 유학

신경 전구 세포의 유사 분열은 신경의 중요한 매개 변수입니다. 신경 전구 세포의 유사 분열에 대한 우리의 이해의 대부분은 고정 된 조직의 분석을 기반으로합니다. 배아 뇌 조각의 라이브 영상은 통제 된 환경에서 높은 공간적 해상도로 유사 분열을 평가하기 위해 다양한 기술입니다.

개발 마우스 배아의 피질 유사 분열의 라이브 영상

우리는 세포주기의 특정 단계와 관련된 사건을 연구하기위한 배경 정보를 제공하는 두 가지 세포 동기화 프로토콜을보고합니다. 우리는이 접근법이 교란되지 않은 세포주기 또는 세포주기에 영향을 미치는 약물에 노출되었을 때 특정 유전자의 조절을 분석하는데 유용하다는 것을 보여준다.

두 개의 상보적인 세포 동기화 프로토콜에 의한 세포주기 조절 유전자 발굴 연구

이 프로토콜 레이블 및 라이브 염색체 mitotic 세포 Histone2B GFP BacMam 2.0 레이블 및 회전 디스크 confocal 현미경 시스템을 사용 하 여 시각화 하는 간단 하 고 편리한 방법을 설명 합니다.

유사 분열 동안 염색체 분리의 라이브 셀 이미징

여기에서, 우리는 연구원이 유사분열과 만두증 도중 살아있는 핵분열 효모 세포에 있는 단백질 행동 그리고 핵 역학을 공부하는 것을 허용하는 비 독성 현미경 검사법인 살아있는 세포 화상 진찰을 제시합니다.

형광 라이브 세포 현미경 검사법에 의한 미토틱 및 Meiotic 핵분열 효모 핵 역학의 검사

여기에서 우리는 스핀들 형성 및 유사분열 진행의 역학을 평가하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 타임랩스 이미징을 적용하면 사용자가 유사분열의 다양한 단계에서 세포를 식별하고, 유사분열 결함을 추적 및 식별하며, 항 유사분열 약물에 노출될 때 스핀들 역학 및 유사분열 세포 운명을 분석할 수 있습니다.

미토틱 스핀들 교란에 따른 메타페이즈 타이밍 및 세포 운명의 역학을 평가하기 위한 라이브 셀 이미징

타임 랩스 현미경은 신진 효모에서 감수 분열을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 이 프로토콜은 세포 주기 동기화, 타임랩스 현미경 검사 및 표적 단백질의 조건부 고갈을 결합하여 감수 분열 염색체 분리 동안 특정 단백질의 기능을 연구하는 방법을 설명하는 방법을 설명합니다.

S. cerevisiae에서 감수 분열을 연구하기 위해 타임 랩스 현미경 및 단백질의 단계 별 핵 고갈 사용

이 프로토콜은 효모 세포 주기 정지 및 선택적 방출의 두 가지 방법을 자세히 설명하고 S. cerevisiae에서 세포 주기 의존적 과정을 연구하기 위한 형광 현미경의 사용에 대해 자세히 설명합니다.

발아 효모의 세포 주기 의존적 과정의 조작 및 분석

학습하세요 HeLa 세포의 이중 티미딘 동기화와 고해상도 공초점 현미경을 이용하여 유사 분열 단계에서 다기능 단백질의 역할을 연구하는 방법을. 이 기법은 세포 주기 역학과 단백질 기능을 정밀하게 분석하는 데 활용됩니다.

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