피부 마이크로 이식 세대를위한 새로운 세분화 방법 후 조직 특성

본 외과적 발명의 전반적인 목표는 상처 치유 목적으로 동일한 수술 과정에서 즉시 사용할 수 있는 자가 피부 미세 이식편을 제작하는 것입니다. 이 방법은 만성 상처 치유, 화상 및 외상 후 궤양과 같은 재생 의학 및 피부 조직 공학 분야의 핵심 질문들에 대한 해답을 제시하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 전문적인 기술이 없는 의사도 매우 쉽게 사용할 수 있으며, 신속하고 경제적이라는 점입니다.

먼저, 생검 펀치를 사용하여 환자로부터 피부 샘플을 채취합니다. 그 다음 상피층을 제거하여 폐기합니다. 각 조직 샘플을 1 milliliter의 식염수와 혼합하여 자가 미세 이식편을 생성합니다.

임상 적용을 위한 바이오컴플렉스를 준비하려면, 마이크로그라프트 용액 1 milliliter를 콜라겐 스펀지에 옮깁니다. 즉시 바이오컴플렉스를 환자의 손상 부위에 도포하십시오. in vitro 실험을 통해 바이오컴플렉스의 생존력을 테스트합니다.

3일간 배양한 후, 0.3% formalin을 바이오컴플렉스 위에 직접 붓고 상온에서 10분 동안 고정합니다. 마이크로톰을 사용하여 5 micrometers 두께로 절편을 자르고 유리 슬라이드에 직접 부착합니다. 그런 다음 절편을 15 내지 20 milliliters의 xylene에 3분 동안 담급니다.

다음으로, 절편의 파라핀을 제거하고 재수화하기 위해 농도가 점차 낮아지는 에탄올 용액에 각각 1시간씩 침전시킨 후 탈이온수에 넣습니다. 그런 다음 1 g/L hematoxylin 1~2 mL를 사용하여 1~2분 동안 절편을 염색합니다. 이후 물로 옮겨 염색약을 씻어냅니다.

이제 1% Eosin Y와 70% ethanol 1~2 mL를 물로 희석하여 섹션을 4~5분 동안 염색합니다. 그 후 흐르는 수돗물로 슬라이드를 헹굽니다. 섹션을 농도가 점차 높아지는 ethanol에 각각 1시간씩 담근 후, xylene에서 1시간 동안 배양합니다.

마지막으로, 커버글라스를 덮기 전 샘플에 염기성 마운팅 매질을 도포합니다. 그런 다음 광학 현미경을 사용하여 100배 배율로 관찰합니다. 채취에 관한 국가 규정에 따라, 40세에서 55세 사이의 다조직 기증자 4명의 몸통 부위에서 더마톰(dermatome)을 사용하여 각각 0.6 mm, 1 mm 또는 0.2 mm 두께의 유두층, 각질층 또는 진피 샘플을 채취합니다.

샘플을 0.9% NaCl에 넣고 오비탈 셰이커(orbital shaker)에서 5분 동안 흔들어 조직을 부드럽게 세척합니다. 5mm 생검 펀치(biopsy punch)를 사용하여 표피와 진피 피부 조직으로부터 직경이 균일한 샘플을 채취하고 모든 조직 표본의 무게를 측정합니다. 다음으로, 표피 또는 진피 피부 조직의 균일한 샘플을 각각 8개, 3개 또는 4개씩 조직 파쇄기(tissue disruptor)에 넣고, 분쇄를 위해 식염수 1.5 mL를 첨가합니다.

이 표에 표시된 대로 모든 조직 샘플에 대해 분리 공정을 수행하십시오. 대조군으로는 온전한 조직 샘플에서 유래한 해당 수의 펀치 생검 조직을 사용하십시오. 기계적 분리 후, 마이크로그라프트가 포함된 생리식염수를 흡입하여 각 샘플을 12-웰 플레이트의 개별 웰에 각각 넣으십시오.

각 샘플에 10% FBS와 항생제가 보충된 RPMI-1640 배지 1 milliliter를 첨가합니다. 세포 생존율을 평가하기 위해, 각 웰에 0.5 milligrams per milliliter의 MTT 용액이 포함된 배지 1 milliliter를 첨가하고, 37-degree Celsius 및 5%carbon dioxide 조건에서 3시간 동안 배양합니다. 배양 후, MTT 배지를 제거하고 1 milliliter의 DMSO로 교체합니다.

10분 동안 배양한 후, DMSO에 담긴 각 시료를 큐벳으로 옮기고 분광광도계를 사용하여 570 nm에서 광학 밀도를 측정하십시오. 570 nm에서의 흡광도와 세포 분산 전 사용된 조직의 무게(g)의 비율로 세포 생존율을 계산하십시오. 다음으로, 단일 공여자로부터 얻은 표피 및 진피 조직 시료에서 식염수를 흡입하여 제거한 후, 세포 생존율 테스트를 위해서는 12-웰 플레이트의 각 웰에, 형태학적 분석을 위해서는 배양 플라스크에 각 시료를 개별적으로 배치하십시오.

12-well 플레이트에는 10% FBS와 항생제가 포함된 RPMI-1640 1 milliliter를, 배양 플라스크에는 5 milliliters를 추가하고 각각 37-degree Celsius 및 5% carbon dioxide 조건에서 24시간 또는 7일 동안 배양합니다. 24시간 후에 광학 현미경을 사용하여 세포 현탁액의 존재 여부를 평가함으로써 형태학적 분석을 수행합니다. 7일째에 이 과정을 반복합니다.

FACS 분석을 통해 CD146, CD34 및 CD45와 같은 중간엽 및 조혈 세포 마커를 사용하여 진피 샘플을 분석합니다. 분리된 세포에 배지를 추가한 다음 37°C에서 3일 동안 배양합니다. 그리고 앞서 설명한 대로 미생물 분석을 수행하여 조직의 무균 상태를 평가합니다.

여기에 표시된 바와 같이, 콜라겐 지지체에 즉시 적재한 인간 자가 미세 이식편을 다리 병변에 이식하였습니다. 그 결과 30일 후 조직 재생과 동반된 완전한 재상피화가 관찰되었습니다. 또한, 5개월 후의 임상 추적 관찰 결과 손상 부위의 질감과 부드러움이 양호한 것으로 나타났습니다.

이 표에 나열된 바와 같이, 한 단계로 처리할 수 있는 생검 조직의 임계값을 8개, 4개 및 3개로 설정하였으며, 양호한 세포 생존율을 유지하기 위한 최적의 해리 조건을 확인하기 위해 네 가지 서로 다른 시간 동안 조직을 해리하였습니다. 본 영상에서 시연된 기계적 해리법은 온전한 조직과 비교하여 다양한 시간대에서 평가했을 때, 표피와 진피를 포함한 모든 피부 샘플에서 평균 30%의 세포 생존율을 유지하는 것으로 나타났습니다. 이 그래프는 배양 후 24시간 또는 7일이 지난 시점에서, 배양 중 균질화 시점의 피부 조직 샘플 세포 생존율이 시작 시점과 비교하여 실질적인 변화가 관찰되지 않았음을 보여줍니다.

하지만, 배양 시작 시점과 비교했을 때 배양 24시간 후 사멸 샘플의 생존율이 감소한 것이 관찰되었습니다. 그러나 배양 7일 후에는 세포 생존율이 회복되었습니다. 진피에서도 유사한 결과가 관찰되었습니다.

이 기술을 숙달하고 적절하게 수행한다면 5분 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때 피부에서 상피층을 제거하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 이 절차 이후에는 골 치유 메커니즘과 같은 다른 질문에 답하기 위해 골 조직 분해와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

이 기술은 개발 이후 재생 의학과 조직 공학 분야의 연구자들이 환자의 조직 치유 과정을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 이 미세 이식 절차를 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 조직을 다루는 작업은 매우 위험할 수 있다는 점을 잊지 마십시오.

본 절차를 수행하는 동안에는 항상 보안경 착용과 같은 안전 주의 사항을 준수해야 합니다.