핵소체 염색질 조직을 바탕으로 마우스 전 정부 난 모세포의 분리 및 특성

이 절차의 전반적인 목표는 장래의 배아 발달을 완전히 유지할 수 있는 능력에 따라 염색질 조직을 기반으로 마우스 전방 난모세포를 특성화하는 데 필요한 모든 단계를 자세히 설명하는 것입니다. 이 방법은 포유류 난소의 전방 구획에 존재하는 두 가지 다른 종류의 전방 난소체, SN(둘러싸인 핵소탈)과 NSN(포위되지 않은 핵소체)을 구별하고 분리하는 방법과 같은 발달 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 난소를 적출하려면 3주에서 6주 된 암컷 마우스 IP에 2.5 국제 단위의 임신한 암말 혈청 성선 자극 호르몬을 주입하는 것으로 시작합니다.

이틀 후, 수확 약 한 시간 전에 멸균 페트리 접시 하나에 M2 배지를 채우고 두 번째 페트리 접시에 M2 배지 20 미크론 방울을 여러 방울 넣고 각 방울을 1.5 밀리리터의 미네랄 오일로 덮습니다. 그런 다음 모든 페트리 접시를 섭씨 37도, 5% 이산화탄소 인큐베이터로 옮겨 매체가 평형을 이룰 수 있도록 합니다. 그런 다음 멸균 해부 가위를 사용하여 복벽을 덮고 있는 피부를 절개한 다음 첫 번째 호르몬 주입 마우스의 복막을 절개합니다.

멸균 핀셋을 사용하여 장을 옆으로 움직여 방광에서 시작하여 V자 모양을 형성하는 자궁관의 위치를 파악합니다. 신장 아래의 난소를 찾은 후 자궁관 하나를 잡고 조직 바닥을 작게 절개하여 해당 난소를 풀어냅니다. 이 과정을 반복하여 다른 난소를 채취한 다음 사전 평형화된 M2 배지로 채워진 페트리 접시에 두 난소를 놓습니다.

전방 난모세포를 분리하기 전에 유리 파스퇴르 피펫의 양쪽 끝을 잡고 피펫을 분젠 버너 불꽃 위에 수평으로 올려 유리 입 피펫을 만듭니다. 유리가 녹기 시작하면 화염에서 피펫을 제거하고 기기를 빠르게 분리하십시오. 손톱을 사용하여 여분의 유리를 피펫의 좁은 지점 가까이로 단단히 잘라 팁을 줄이고 약 100미크론의 내부 모세관 직경을 달성합니다.

올바른 피펫 직경을 갖는 것이 중요합니다. 너무 좁으면 ooyctes가 끼어 조각이 나서 죽습니다. 그런 다음 피펫의 변형되지 않은 끝을 흡인기 튜브에 연결합니다.

다음으로, 1ml의 사전 평형 M2 배지가 들어 있는 페트리 접시에 난소를 옮기고 멸균 인슐린 주사기 바늘을 사용하여 난소의 전방 여포를 부드럽게 뚫습니다. 난모세포가 방출되면 구강 피펫으로 부드럽게 모으고 난포 세포나 기타 조직 파편을 흡인하지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 여러 개의 사전 평형화된 M2 매체 방울을 통해 각 난모세포를 빠르게 피펫팅하여 난모세포의 투명대에 부착된 모든 적운 세포를 제거합니다.

난모세포가 제거되면 신선한 평형을 이룬 M2 배지의 개별 방울 바닥에 난모세포를 조심스럽게 가라앉힙니다. 난모세포를 염색하려면 구강 피펫을 사용하여 세포를 M2 배지에 희석된 Hoechst 33342 20마이크로리터 방울로 옮깁니다. 그런 다음 미네랄 오일로 덮인 M2 배지 5마이크로리터 방울이 들어 있는 새 페트리 접시에 난모세포를 옮기고 각 방울의 바닥에 난모세포를 개별적으로 가라앉히도록 주의합니다.

모든 난모세포가 이식되면 접시를 형광 현미경 아래에 놓고 핵소체 주위에 고리의 유무를 시각화할 수 있을 만큼만 세포를 여기시킵니다. 너무 오래 노출되면 염색질이 손상될 수 있고 난모세포가 죽을 수 있으므로 난모세포에 과도하게 노출되지 않도록 주의하십시오. SN 및 NSN 난모세포가 식별된 후, 염색질 조직에 따라 원하는 다운스트림 분석을 위해 관련 시약의 적절한 해당 페트리 접시로 세포를 분류합니다.

염색질 조직을 위한 Hoechst 33342 염색은 아마도 절차에서 가장 중요한 단계일 것입니다. 5-10초의 여기(excitation)는 각 난모세포의 핵소체를 둘러싼 염색질의 유무에 따라 난모세포를 분류하기에 충분해야 합니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 3시간 이내에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 실온에서 작업하고 난소와 난모세포를 모두 부드럽게 처리하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 난모세포는 체외 성숙 및 체외 수정에 사용할 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 발달 생물학 분야의 연구자들이 포유류 난소에 존재하는 두 종류의 전방 난모세포를 인식하고 구별하는 방법에 대한 답을 찾을 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 자신의 구강 피펫을 만들고 사용하는 방법, Hoechst 33342 염색을 통해 전방 난모세포를 분리하고 분류하는 방법을 잘 이해할 수 있습니다. 동물과 세포를 다루기 위해서는 개인 보호 장비를 착용하고 멸균된 기구를 사용하는 것과 같은 특별한 예방 조치가 필요하다는 것을 잊지 말자.