Name: 핵소체 염색질 조직을 바탕으로 마우스 전 정부 난 모세포의 분리 및 특성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-07T12:00:01.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: 학습하세요 마우스 전정부 난모세포의 핵소체 염색질 조직을 바탕으로 한 분리 및 특성 분석 방법입니다. Hoechst 33342 염색을 통해 SN 및 NSN 난모세포를 식별하고 생식생물학 연구에 활용하세요.

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M.M.과 C.A.R.은 Pavia (I) Fondazione IRCCS Ospedale San Matteo의 Ministero della Salute, Ricerca Finalizzata/giovani ricercatori anno 2009의 재정 지원을 인정합니다. M.M과 C.A.R.은 이미지 준비에 도움을 준 Marianna Longo에게 감사의 뜻을 전합니다.

이 프로토콜은 유럽의 원칙 (EU 2천10분의 63)과 과학 연구에 사용되는 동물을 보호하는 이탈리아어 (2천14분의 26) 법에 따라 수행된다. 경추 탈구 안락사는 난소 분리를 위해 사용되며, 이는 본 연구를 덮는 승인 프로토콜에 나열된 개인 전문가에 의해 수행되고 훈련된다. 1. 동물 <ol><li> 제어 온도와 습도 방에 6 주령의 암컷 마우스에 성인 3을 유지한다 (12L의 단계와 : 12D와 공급 임의로). </li><li> 난포 자극 호르몬 (FSH)의 효과를 모방하여 모낭의 성장을 자극하는 임신 한 암말의 혈청 성선 자극 호르몬의 2.5 IU (PMSG) 마우스에 복강 주사. 이후 전 정부 난자 수집 48 시간의 난소를 분리합니다. 하여 기관 가이드 라인에 따라, 이전에 PMSG 주입 암컷 마우스를 안락사. </li><li> 신속 체강에서 난소를 제거하고 배양 접시의 계속에 그들을 배치후속 난자 격리를위한 M2 매체 aining (섹션 3 참조). <ol><li> 해부 멸균 가위를 사용하여 복막에 절개 하였다 복벽을 덮는 피부에 절개를. 방광에서 시작하여 V 자 모양을 형성, 복부를 노출 절개를 열고 멸균 핀셋을 사용하여 한쪽에 용기를 이동하고 자궁 튜브를 지역화. </li><li> 신장 아래에있는 난소를 관찰한다. 멸균 트위터와 각 튜브를 잡고 그들을 해제 난소의 하단에 작은 절개를합니다. 미리 평형화 매체를 함유하는 페트리 접시의 하단 양쪽 난소를 전송. </li></ol></li></ol> 2. 호르몬 준비 <ol><li> 적절한 주입 부피 0.1 mL의 2.5 IU 호르몬의 작용 농도를 얻기 위해 멸균 등​​장 성 식염수로 (다른 스톡 농도에서 사용 가능) PMSG 희석. 참고 : 호르몬 솔루션은 0.5 ml의 튜브에 분주하고 저장해야합니다 -2사용 일까지 0 ° C. -20 ° C 3 개월 이상 희석 분취 량을 보관하지 마십시오. 해동 후에 직렬 주사를 수행하는 경우, +4 ℃에서 호르몬 용액의 분취 량을 저장 4 일 이내에이를 사용. </li></ol> 3. 전 정부 난 모세포 분리 적절한 난 모세포 분리의 경우 : <ol><li> 난자 분리 절차를 시작하기 전에 최소한 1 시간 동안 5 % CO 2, 37 ℃에서 13 M2 매체 (M2)를 평형. 두 개의 배양 접시 (35mm X 10mm), 난소 천공과에서 분리 한 후 난자 전송을 위해 미네랄 오일 (~ 1.5 ml)로 덮여 M2의 작은 방울과 두 번째 (20 μL)에 대한 (M2) 1 ml의 하나를 준비합니다 난소 (3.4-3.6 참조). 준비가 사용되는 때까지 5 % CO 2, 37 ° C에서 인큐베이터에서 모두 배양 접시를 유지합니다. </li><li> 난 모세포의 분리 과정에서 실체 현미경을 사용합니다. </li><li> 스트레치에 의한 난자를​​ 수집하는 얇은 입 유리 피펫을 준비힝 유리 파스퇴르 피펫은 분젠 버너에서 오는 수직 화염 (그림 1)을 통해, (두 손으로 피펫의 끝을 잡고) 수평으로 유지했다. <ol><li> 유리가 녹기 시작하면, 불꽃에서 피펫을 원하는 피펫을 얻기 위해 빠른 당기는 운동을 수행합니다. 단단히 길이와 내부 모세관의 직경을 조정 손톱으로 피펫의 좁은 점에 가까운 초과 유리를 잘라. 얇은 모세관은 난자의 직경보다 약간 큰 ~ 100 ㎛의 내부 직경을 가지고 있는지 확인합니다 (~ 80 μm의). </li><li> 입 피펫, 적절한 팁을 이용하여 뽑아 피펫에 흡인기 관의 한쪽 끝을 연결하고 이빨을 확보 입 타단 장소. </li></ol></li><li> 무균 핀셋을 사용하여, 난소를 수집하고 세포 배양 용 배양 접시 (35mm X 10mm)의 바닥에이를 증착. M2 1ml의 이전에 37 ℃에서 평형화 그들을 덮5 % CO 2 (그림 2). </li><li> 부드럽게 M2 (그림 3)에서 전 정부 난자를 해제 멸균 인슐린 주사기 바늘로 난소의 난포에 구멍. </li><li> 부드럽게 입 여포 세포 및 다른 가능한 조직 파편 (도 4a)를 제거하고 이전 (배아 배양에 적합한 광유 덮여 M2의 작은 방울 (20 μL)의 하단에이를 정착 좁은 파스퇴르 피펫을 통해 난자를 피펫 준비도 4B). 주 : (M2)의 여러 다른 방울을 통해 지속적으로 피펫 팅에 의한 난자의 투명대에 연결된 모든 난구 세포를 제거하는 것이 중요하다. 매질의 pH의 변화를 피하기 위해 가능한 한 빨리이 단계를 수행한다. </li></ol> Hoechst33342 4. 전 정부 난 모세포 염색 참고 : 전 정부 난자는 SN (둘러싸인 핵소체), N​​SN (핵소체를 둘러싸인되지 않음) 또는 구별 할 수있다다른 중간 형태로, Hoechst33342의 supravital 농도 (또는 염기에 대한 구체적인 다른 마커 AT) (14) 염색 후 자신의 염색질 조직을 기반으로. NSN은 따라서,하지의 이름을하면서 사실, SN 난자는 핵소체 주위 헥스 양성 반지를 보여줍니다. 적절한 난자 염색의 경우 : <ol><li> 어둠 속에서 10 분 동안 50 NG / μL의 supravital 농도 Hoechst33342 (20 μL) (M2)에 희석 방울로 입 피펫을 사용하여 난자를 전송합니다. </li><li> Hoechst33342 함께 배양 후, 조직 염색질 (SN 또는 NSN)에 기초한 정렬, 광유 덮여 M2의 작은 방울 (5 μL)의 바닥에 입을 피펫으로 각 단일 난자 옮긴다. 난자의 염색질 구성을 시각화 Hoechst33342 필터 (발광 파장 486 ㎚)을 갖추고있는 형광 현미경을 사용합니다. 주 : 사용 된 형광 현미경의 종류에 따라, 난T는 이미지 수집을 위해 유리 바닥 배양 접시를 사용하는 것이 필수적 될 수 있습니다. 35mm 요리에 대한 시편 홀더를 장착 공 초점 현미경 올림푸스 Fluoview Fv10i는 0.17 mm의 표준 두께 허용 0.13 0.21 mm 정도의 범위와 이미지 수집에만 유리 바닥 요리가 필요합니다. </li><li> 아마도, 더 이상보다 5-10 초 동안 존재 핵소체 주위의 링 부재 (도 5)를 가시화하기에 충분한 시간을 난 모세포를 자극. </li><li> 체외 성숙을 유도 또는 분자 나 세포 분석을위한 적절한 버퍼에 보관 5 % CO 2, 37 ℃에서 (M2)에서, 문화 전 정부의 SN과 NSN 난자를 정렬 한 후. </li></ol>

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</ol>

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이 프로토콜은 분리 및 마우스 전 정부 GV 난자를 분류하기 위해 사용 된 방법을 설명한다. 몇 가지 예외를 제외하고, 밑줄 특별히 중요한 단계가 없습니다. ) 난자의 활력을 유지하고 b)에 사용되는 배지에서 pH 변화를 방지 : 첫째 :이 절차는 가능한 한 빨리 수행되어야한다. 둘째 : 난자는 IVM과 체외 수정은 다음 단계는 특히, 염색질 손상 및 난자의 후속 죽음을 피하기 위해 Hoechst33342에 (5 ~ 10 초) 간략하게 흥분한다. 현재까지이 SN과 NSN 마우스 전 정부 난자를 정렬하는 가장 빠른 방법입니다. 불임 목적을 위해 인간의 전 정부 난자를 정렬하는 데 사용, 불행하게도, Hochest33342 여성 마우스 (및 기타 포유 동물 실험 모델)의 SN과 NSN 난 모세포의 특성을하는 효율적인 방법이 될 입증되었습니다하지만 할 수 없습니다. 미성숙 난자의 체외 성숙 일상적 너무 인간에서 사...

난소 전 정부 구획실로부터 분리 전 정부 완전히 자란 난자 (GV, 새싹 소포)는 일상적 같은 다른 목적을 위해 사용되는 예를 들면, 중기 II 단계까지 시험 관내 성숙 뒤에 분자 세포 메카니즘의 연구. 그들의 아름다운 외관에도 불구하고 대부분의 전 정부 난자, 전부는 아니지만, 감수 분열을 완료하고 포배기에 도달 할 수있다; 시비 3-5 발생할 경우 실제로 인간 1,2- 포함한 많은 포유류 종에서, 이들 중 약 30 %, 2 단계에서 셀들이 개발 체포. 현재까지, 몇몇 파라미터는 그렇게 할 수없는 것과 배아 발달을 유지할 수 난자를 구별하기 위해 사용된다. 예를 들어, 크레 실 블루 염색 (BCB)은 BCB + 또는 BCB- 염색 관련이 정렬 방법의 유용성이 있지만 글루코오스 -6- 포스페이트 탈수소 효소의 활성에 기초하여 난자를 정렬하는 방법으로서 유효한여전히 6-8 의존 실험실. 또 다른 잘 확립 된 방법은 염색질 조직에있는 (Hoechst33342 같은) 어떤 DNA의 인터 염료로 염색하는 경우, 전 정부 난자의 70 %가 핵소체 주위에 염료 긍정적 인 반지를 보여 핵소체 (SN)를 둘러싸인라고 30 %를 유지하면서 더 발견 긍정적 인 신호를 보여주고 (NSN) 3-5하지 둘러싸인 핵소체라고합니다. 최근에 우리는 보여 주었다 세포질 그릴 (9) (CPLS, 포유류의 난자와 배아 모두 모계 유래의 mRNA와 리보솜에 중요한 저장 사이트)의 부재 (10)의 존재와 함께 (CPLS 형성 (11)에 대한 필수) 이잖아요의 하향 조절, 그들의 세포질 9,12- 지질 방울, 2 세포 단계 이상으로 진행 NSN 난자의 무능력과 관련된 다른 원인이 될 수 있습니다. 불행하게도, 몇몇 기술은 전 정부 SN과 NSN의 난자와 정렬을 적용 할 수 있습니다,이러한 이유로, (핵 염색, 정착 절차 또는 입 피펫으로 조작없이) 덜 침습적 방법의 개발이 모두 인간과 동물의 배아 발달의 속도를 높이기 위해 매우 중요해질 수있다. 본 논문에서는 세부 간단하고 빠른 프로토콜은 광고 정렬 SN과 여성의 생쥐에서 NSN 전 정부 난자를 격리하는 데 사용됩니다 그것은 여성 배우자, 난자의 성숙과 배아 개발의 연구에 관심이있는 모든 과학자들에게 해결됩니다.

<table><tbody><tr><td>PMSG</td><td>Sigma</td><td>G4527</td><td></td></tr><tr><td>EmbrioMax M2</td><td>Millipore</td><td>MR-015-PD</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst33342</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 접시 35mmx10mm</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>&micro;-접시 35mm, 높은 유리 바닥</td><td>Ibidi</td><td>81158</td><td></td></tr><tr><td>교정된 마이크로필러리 피펫</td>용 <td>Pasteur</td><td></td> Borosilicate Corning 7095D-9 흡인기 튜브 어셈블리 Sigma A5177 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

핵소체 염색질 조직을 바탕으로 마우스 전 정부 난 모세포의 분리 및 특성

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

이 프로토콜은 생쥐 전방(Germinal Vesicle) 난모세포를 체외 성숙(IVM) 및 체외 수정(IVF) 후 배반포 단계로 발달할 수 있거나(SN, Surrounded Nucleolus) 할 수 없거나(NSN, Not Surrounded Nucleolus)로 분리하고 특성화하는 간단하고 빠른 방법을 설명합니다. Hoeschst33342 (또는 다른 DNA 삽입 염료)를 사용하여 NSN 난모세포에서와 같이 SN 난모세포에서 고리를 나타내거나 그렇지 않은 nucleolus의 heterochromatin에 결합할 수 있습니다. 이는 IVM 또는 IVF 시술에 최종적으로 사용될 수 있는 두 전방 난모세포를 분류하는 가장 쉽고 빠른 방법입니다. 
간단히 말해서, 프로토콜은 다음 단계로 구성됩니다 : 여포 성장을 자극하기위한 호르몬 주입; 멸균 바늘로 난소를 뚫어 GV 단계에서 전 구획에서 난모 세포를 분리; 난모 세포의 입 피펫팅을위한 얇은 유리 피펫 준비; 초 생명 농도로 준비된 Hoechst33342로 난모 세포를 분류; IVM, IVF 또는 기타 분자/세포 분석.
불행히도 덜 침습적인 기술을 사용하여 SN 및 NSN 난모세포를 분류할 수 있는 증거는 아직 거의 없습니다. 만약 이들이 확인된다면, 인간 보조 생식 기술에 잠재적으로 적용될 수 있지만, 몇 가지 측면이 수정되어야 합니다. 현재까지 이 기술은 멸종 위기에 처한 종과 경제적 이해관계가 있는 종 모두에서 IVM 및 IVF 성공적인 절차를 극적으로 증가시키는 데 잠재적인 영향을 미칠 수 있습니다.

다음 이미지 Hoechst33342 의해 난자 &#39;정렬에 피펫 준비부터 마우스 난소 전 정부로부터 난자를 분리하기 위해 사용 된 방법을 보여준다. 이 방법은 매우 간단하고, CO2 인큐베이터, 실체 현미경과 Hoechst33342의 관측을위한 올바른 필터를 갖춘 형광 현미경에 장착 된 임의의 실험실에서 수행 될 수있다 (1) 수치는 피펫 제조의 초기 단계를 보여준다. 유리 등을 용융 및 연질되기 시작 피펫의 양단 동시에, 피펫은 화염 인출되어야 떨어져 뽑아되어야한다. 적절하게 보정하는 경우 또는, 유리 모세관은 동일하게 또는 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 당겨질 수있다. 너무 얇은 경우, 난자 작은 캡 내부 단편화 될 수있다 : 그것은 오른쪽 모세관 직경 오른쪽 입 피펫이 매우 중요하기 때문이다 중요한 단계illary하고, 예를 들면, 난 모세포를 이동할 때 난 모세포를 함유하는 배지의 적당한 흡인이 손실 될 수 ...

여기에서 우리는 핵소체 조직을 기반으로 마우스의 전 정부 난자의 특성에 대한 프로토콜을 제시한다.

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

본 절차의 전반적인 목표는 향후 배아 발달을 완전히 유지할 수 있는 능력에 따라, 염색질 구성으로 마우스 난포성 난자를 특성화하는 데 필요한 모든 단계를 상세히 설명하는 것입니다. 이 방법은 포유류 난소의 난포강에 존재하는 두 가지 서로 다른 종류의 난포성 난자인 SN(핵소 주변부 둘러싸임)과 NSN(핵소 주변부 둘러싸이지 않음)을 어떻게 구별하고 분리할 것인가와 같은 발생 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 난소를 채취하려면, 3~6주령의 암컷 마우스 복강 내에 임신마 혈청 성선 자극 호르몬 2.5 international units를 주입하는 것으로 시작하십시오.이틀 후, 수확 약 한 시간 전에 멸균 페트리 접시 하나를 M2 배지로 채우고, 두 번째 페트리 접시에는 M2 배지를 20 µL씩 여러 방울 떨어뜨린 후 각 방울을 1.5 mL의 미네랄 오일로 덮습니다. 그런 다음, 배지가 평형을 이룰 수 있도록 모든 페트리 접시를 37 °C, 5% CO2 인큐베이터로 옮깁니다. 다음으로, 멸균 해부 가위를 사용하여 호르몬이 주입된 첫 번째 마우스의 복벽을 덮고 있는 피부를 절개한 후, 복막을 절개합니다.멸균 핀셋을 사용하여 장을 옆으로 밀어 방광에서 시작하여 V자 모양을 형성하는 수란관의 위치를 확인합니다. 신장 아래에서 난소를 찾은 후, 수란관 하나를 잡고 조직 하단을 작게 절개하여 해당 난소를 분리합니다. 동일한 과정을 반복하여 다른 쪽 난소를 채취한 다음, 두 난소를 미리 평형을 맞춘 M2 배지가 채워진 Petri dish에 넣습니다.난포강 난자를 분리하기 전에, 유리 파스퇴르 피펫의 양 끝을 잡고 분젠 버너 불꽃 위에 수평으로 유지하여 유리 마우스 피펫을 제작합니다. 유리가 녹기 시작하면 피펫을 불꽃에서 제거하고 빠르게 당겨 분리합니다. 손톱을 사용하여 피펫의 좁은 지점 근처의 불필요한 유리를 단단하게 끊어 팁의 길이를 줄이고, 내부 모세관 직경이 약 100 µm가 되도록 조절합니다.적절한 피펫 직경을 선택하는 것이 중요합니다. 직경이 너무 좁으면 난자가 끼이거나 파편화되어 사멸할 수 있습니다. 그다음 피펫의 수정되지 않은 끝부분을 흡입 튜브에 연결하십시오.다음으로, 난소를 1 mL의 평형화된 M2 배지가 들어 있는 페트리 접시로 옮기고, 멸균된 인슐린 주사 바늘을 사용하여 난소의 난포강 난포를 부드럽게 천자합니다. 난자가 방출되면 마우스 피펫을 이용해 조심스럽게 수집하며, 이때

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

Oocytes는 meiotic 성숙하는 동안 염색체 분리의 오류로 인해 aneuploidy하는 경향이 있습니다. Aneuploid 계란은 다운 증후군과 같은 불임, 유산 또는 발달 장애를 일으킬 수 있습니다. 여기서 우리는 oocytes과 meiotic 성숙을 연구하고 ploidy 평가 방법에 선택의 자료를 소개하는 방법을 설명합니다.

마우스 Oocyte의 Microinjection, 성숙과 Ploidy 평가

이 비디오는 갓 채취한 쥐 난소에서 전방 난모세포를 분리하는 방법을 설명합니다. 이러한 전방 난모세포는 추가 특성화 및 발달 연구에 사용할 수 있습니다.

마우스 전방 난모세포 분리: 갓 수확한 마우스 난소에서 전방 난모세포를 분리하는 방법

여기서는 마우스 난자 감수 스핀들 어셈블리 및 조직을 평가하기 위해 면역 분석 하였다 특정 된 siRNA 매개 mRNA의 파괴를위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 성적 증명서의 체외 고갈과 다른 스핀들 및 / 또는 난자에 MTOC 관련 요인의 기능 평가에 적합합니다.

siRNA를 매개 음소거로 마우스 난 모세포의 감수 스핀들 평가

여기, 선물이 oocyte 발달 능력 그들의 체 외에서 성숙 germinal 소포에서 분열 II 단계 동안 수행의 비-침략 적 평가 대 한 프로토콜. 이 방법은 입자 이미지 velocimetry (PIV)와 신경망 분석 시간 경과 영상을 결합합니다.

발달 능력 또는 무능 한 마우스 가득 Oocytes의 신경 네트워크 기반 식별

포유류에서 oogenesis 오류가, 특히 염색체 missegregation 인 것으로 알려져 있다. 이 원고 chromatin 확산 마우스 의향에 대 한 준비 방법에 설명 합니다 분열 I 및 II 준비 oocytes. 이러한 기본 기술을 chromatin-바인딩 단백질 및 포유류 oogenesis 전체 염색체 형태학 연구에 대 한 수 있습니다.

Chromatin 확산 마우스 Oocyte 진행 의향에서 분열 II의 분석에 대 한 준비

인간의 질병과 관련 된 유전자 변종 발견 될 하기 시작, 그것은 점점 더 빠르게 그 확인 된 이체의 생물학적 의미를 평가 하는 시스템을 개발 하는 것이 중요 되고있다. 이 프로토콜에는 인간 유전자 기능 여성 감수 분열 동안 마우스 oocytes를 사용 하 여 나로 평가 하는 방법을 설명 합니다.

감수 분열 동안 인간 유전자 기능을 평가 하기 위해 마우스 Oocytes를 사용 하 여 나

난소 조직 문화 여 포 개발, 배 란, 그리고 여 포가 폐쇄 증의 모델로 사용할 수 있습니다 하 고 동적 난소 프로세스의 규제 메커니즘을 나타냅니다.

난소 조직 문화 현상을 마우스 난소에서 시각화 하

근적외선 펨토초 레이저를 사용하여 중기 I 동안 마우스 난 모세포에서 세포질 미세 소관 조직 중심의 고갈을 가능하게하는 최적화 된 프로토콜이 제시됩니다.

마우스 난모세포에서 세포질 미세소관 조직 센터의 다광자 레이저 제거

이 프로토콜은 생쥐 난모세포 시스템의 핵 모양과 내부 막이 없는 세포 소기관에 대한 세포골격의 물리적 영향을 문서화하기 위한 실험 프레임워크를 제공합니다. 이 프레임워크는 다른 세포 유형 및 컨텍스트에서 사용하도록 조정할 수 있습니다.

공간 규모에 걸쳐 마우스 난모세포핵의 세포골격 기반 교반 캡처

시냅스와 재조합의 감수분열 오류는 포유류 난모세포에 일반적입니다. 이러한 과정에 관여하는 단백질에 대한 엄격한 분석은 난자형성이 어떻게 그리고 왜 잘못되는지를 이해하는 데 필수적입니다. 여기에 제시된 기술을 통해 재조합 및 시냅스를 종합적으로 모니터링하여 마우스의 난모세포 품질을 평가할 수 있습니다.

시냅스와 재조합 평가를 위한 마우스 난모세포에서 퍼진 감수분열 염색체 준비(Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Oocytes for Assessment of Synapse and Recombination)

학습하세요 마우스 전정부 난모세포의 핵소체 염색질 조직을 바탕으로 한 분리 및 특성 분석 방법입니다. Hoechst 33342 염색을 통해 SN 및 NSN 난모세포를 식별하고 생식생물학 연구에 활용하세요.

핵소체 염색질 조직을 바탕으로 마우스 전 정부 난 모세포의 분리 및 특성

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