Name: 디자인, 포장, 높은 역가 CRISPR 레트로와 렌티 배달 정위 주입을 통해 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: 배우세요 CRISPR/Cas9 바이러스 설계 및 포장 방법을 통해 성체 마우스 뇌에 정위 주입하여 신경계 질환 관련 유전자 기능을 연구하세요. 이 기술은 유전자 조작 동물을 생성하지 않고도 특정 유전자를 효율적으로 연구할 수 있습니다.

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이 작품은 R01MH097949을 부여 NINH에서 지원하고, 자폐증은 BWL와 노리스 코튼 암 센터의 광학 이미징 공유 계측 그랜트 P30CA023108에 파일럿 그랜트 7359을 말한다.

<ol><li>Williams, M. R., DeSpenza, T. Jr, Li, M., Gulledge, A. T., Luikart, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactivity+of+newborn+Pten+knock-out+neurons+results+from+increased+excitatory+synaptic+drive%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Hyperactivity of newborn Pten knock-out neurons results from increased excitatory synaptic drive.</a> J Neurosci. 35 (3), 943-959 (2015).</li>
<li>Luikart, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pten+knockdown+in+vivo+increases+excitatory+drive+onto+dentate+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pten knockdown in vivo increases excitatory drive onto dentate granule cells.</a> J Neurosci. 31 (11), 4345-4354 (2011).</li>
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</ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

성공적인 바이러스 성 포장에 중요한 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 비정상 세포가 크게 발생 바이러스의 양을 감소하므로 셀 상태는 이전과 트랜시 중요하다. 형질 포장이 성공적이라면, 셀의 100 %가 형광을 표현해야하고, 세포는 기능 syncytium을 형성한다. 단계 3.2.4 튜브를 탭하면 효율적 고역가 형질 전환에 필요하고, HEPES 완충 생리 식염수의 pH가 정확해야한다. 바이러스 성 포장에 필요한 플라스미드를 생산하는 맥시 준비합니다 매우 순수해야합니다. 이 점, 상기 최종 용출 DNA를 침전시키고 에탄올 트리스 EDTA 버퍼에 일시 중지 다시 유용하다. 이는 카페인이 바이러스 컬렉션 전날 6 (스텝 3.4)에 첨가되어있는 배지에서 2 % 이하로하는 혈청의 양을 줄이기 위해 매우 중요하다. 혈청이 감소되지 않은 경우, 최종 정제 된 바이러스 혈청 PROT의 바람직하지 않은 양을 포함EIN. 폴리에틸렌 글리콜 바이러스 입자를 침전 6000의 사용은 초 원심 분리의 필요성을 제외한다. Cas9의 CRISPR 포함 된 바이러스는 일반적으로 단독으로 형광을 포함하는 바이러스보다 배 이하 (10) 주변의 역가를 참고하는 것도 중요합니다. 정위 수술 흡입 마취제의 사용은 주 사용 마취제에 비해 신속하고 정확한 제어 또는 동물의 의식을 허용하고 큰 연령대 통해 마취를 허용한다. 깨끗하고 무균 수술 악기를 유지하는 것이 매우 중요하며, 재생 가능한 타겟팅은 머리의 정확한 위치를 필요로한다. 정위 악기와 두개골이 제자리에 단단히 느낌이 머리의 어떤 피칭 또는 롤링이없는 것을 확인합니다. 또한 두개골의 정위 좌표를 결정하는 봉합사를 찾기 위해 건조되도록하는 것이 유용 할 수있다. 또한, 정위 좌표 각각에 대해 레이트 및 부피는 경험적으로 결정되어야한다. 이 기술은 (AAVs) .Therefore 아데노 - 관련 바이러스에 비해 때 렌티 또는 레트로 바이러스의 확산이 특히 제한되는 이산 뇌 영역에 감염 될 때, 이러한 바이러스는 가치가 있지만, 전체 감염 AAVs과 연관되지 않은 것을 제한하고 동물 행동 분석에 사용됩니다. 이 프로토콜 카페인의 사용은 크게 이러한 바이러스의 역가를 증가 시키지만 여전히 AAV 포장에서 얻어지는 적정량만큼 높지 않다. 또한, 일시적으로 형질 때 CRISPR / Cas9 안정 게놈 편집도 형성으로 안정적인 통합 형광 발현의 장점이 있고이 가능하다 진행중인 결국 목표 효과를 생성 할 수있다 Cas9 및 sgRNA의 발현을. AAVs와 CRISPR / Cas9 시스템은 세포 분열에 전파되는 게놈 변화를 생성하기에 충분한 과도 발현은, 그러나, 형광 발현이 유지되지 않을 것이다. 렌의 창조ti- 및 CRISPR / Cas9 체계를 이용하여 레트로 바이러스는 다양한 유기체의 모든 신규 유전자를 타겟팅하는 능력을 부여한다. 유전자 편집의 효율 Cas9 절단 타겟팅 가이드 RNA의 순서에 의존 할 것으로 보인다. 경험적으로 시퀀싱 Neuro2A 세포를 감염 후 10 % 내지 클론의 80 %가 삽입과 삭제를 포함하는 것으로 결정되었다. Neuro2A 세포에서 산출 INDEL 주파수 뉴런에서 그들의 반사 여부 현재 알려져 있지 않다. 이러한 Benchling 같은 안내 RNA 디자인 소프트웨어는 주어진 표적 서열의 효율을 예측할 수있다 「온 대상 &quot;점수를 포함한다. 예 : &quot;온 대상&quot;점수가 더 광범위하게 구현된다 경험적으로 CRISPR-Cas9 시스템과 같은 신경 세포와 다른 세포 유형으로 결정되는 신뢰할 수있는 요구에 어떤 정도. 렌티 바이러스 기반의 형질 전환 동물 생산은 렌티 바이러스-전달 유전자는 경기도가 있다는 보고서를 가변적으로 성공했다11 lenced. DNA의 CRISPR 매개 유전자 편집 전체 동물 모델을 생성하기 위해 세균 라인을 통해 전달 될 수있다. 따라서, 안정적인 게놈 편집 바이러스-전달 형광체 및 Cas9의 유전자의 침묵에도 불구하고 달성 할 수있다. 이 대상으로 게놈 변경에 대한 효율적인 플랫폼을 제공 할 수있다. CRISPR / Cas9 시스템의 바이러스 전달, 트랜스 제닉 생물을 요구하지 않는 반면, 이들 기술들에 상보 적이다. 예를 들어, inducibly 유전자 조작과 신경 활동 사이의 관계에 복잡한 연구를 촉진한다 Cre 호텔과 Cre 호텔 의존 opto- 또는 화학 - 유전 형질 전환 유전자를 발현하는 화합물 형질 전환 동물에 이러한 바이러스 입자를 주입. 두 번째 예는 유전자 - 유전자 상호 작용을 선별하기위한 시도 조건부 녹아웃에이 Cas9 / sgRNA 바이러스 입자를 제공하는 것입니다. 마지막으로,이 연구의 또 다른 흥미로운 경로는 환자 유래 세포의 표현형 및 치료 화합물의 선별,하는 수이다확인하고 다양한 질환 파쇄 유전자 네트워크를 탐색하는데 사용될 수.

정상적인 생리 질환 병리의 기초 연구를 정밀 모델 유기체에서 유전자 발현을 조작 할 필요가있다. 관심있는 유전 요소는 재조합 효소 인식 부위와 측면으로 접하고, 상기 포유 동물 모형 유기체이 크게 제작 및 형질 전환 마우스의 개발에 집중되어있다. 이것은 이러한 측면 유전자의 사이트 특정 조작 될 수 있습니다. 이 성공적인 전략되었지만, 시간 및 리소스 집약적이고; 예를 들어, floxed 유전자 Cre 호텔의 재조합 효소 및 Cre 호텔 리포터 유전자를 발현 것 트리플 형질 전환 동물을 만드는 것은 여러 교배 및 검증을 필요로한다. 대조적으로, 복제의 정위 주사는 floxed 유전자 동물에 형광 단백질 및 재조합 효소를 코딩하는 결함 바이러스 입자는 복합 유전형 또는 사육 한 전략을 필요로하지 않는다. 바이러스 발현 형광 단백질 및 Cre 호텔 경우 또한, 제 ENCO 바이러스와 공동 주입딩 다​​른 형광 단백질, 이것은 표적 유전자 조작을위한 내부 - 조직 제어를 제공한다. 이 전략은 여전히​​ 녹아웃 동물의 사용을 필요로하지만, 급속도로 매개되는 RNA 기반 전략은 형질 전환 동물에 대한 필요성을 회피. 예를 들어, 형광 단백질과 짧은 헤어핀 RNA (shRNA를)를 인코딩 복제 결핍 바이러스의 정위 주사는 관심의 유전자의 전사의 강력한 감소가 발생하는 세포의 내생의 RNAi 기계를 사용할 수 있습니다. 그러나, shRNA를 전략은 종종 겸손 세포의 표현형이 발생 미묘한 유전자 노크 다운을 생산하고 있습니다. 노크 다운 더 생리 학적 이형 유전자 장애에 대한 관련 될 수 있지만, 그 감소 견고성이 노크 아웃에 비해이 새로운 유전자의 표현형 발견에 적합하지 않습니다. 최근에 등장했습니다 세 번째 기술 관련 CRISPR-(정기적으로 Interspaced 짧은 팔린 드롬 반복 클러스터)를 CRISPR / Cas9은 (단백질 9) 시스템은, 작은 외래 RNA 및 DNA 절단 효소의 발현 양에 의존한다. CRISPR / Cas9 시스템은 외국 식별 바이러스로부터 DNA를 침입하고 Cas9 효소 3,4를 통해 열화를 대상으로하는 방법을 진화 원핵 면역 시스템에서 적응했다. 이 강력한 게놈 편집 기술은 표적 결실, 삽입 및 돌연변이를 만드는 데 사용될 수있다; 다음과 같은 프로토콜은 생체 내에서 발현을 녹아웃하기 위해 관심의 유전자에 삭제를하는 방법을 간략하게 설명합니다. Cas9 효소는 발판 RNA와 관심 영역에 상동과 인접 가이드 RNA로 표현해야합니다. 이 기술을 이용하여 유전자의 녹아웃 합성 RNA를 가이드 (sgRNA)를 사용하여 게놈의 특정 영역에 Cas9 타겟팅 및 관심 부위에서 이중 가닥 나누기 (DSBs)을 유발 요구한다. 이 DSBs 후 비 동종 최종 합류 (NHEJ)하는 제작을 통해 내생 세포 수리 기계 수리된다과오 또는 넌센스 돌연변이를 생성 할 수 있으므로 기능성 단백질 식 (5)의 손실을 만들 수 있습니다 삽입과 삭제에 광고. 본 시스템은 게놈 변경을 생성하기 때문에, 단지 Cas9 및 sgRNA의 일시적인 발현을 필요로한다. 안정 형광 표시기가 이와 같이 조작 된 세포 및 그 자손을 식별하기 위해 그러나 바람직하다. 레트로 바이러스 및 렌티 안정적으로 장기간의 발현 및 유사 분열 동안 유지 딸세포까지 전달되는 숙주 세포에 관심 DNA를 통합하는 이점을 갖는다. 이 프로토콜 설계 및 결함 복제 고역가 레트로 바이러스의 두 종류의 생산을 설명 인간 면역 결핍 바이러스 유래의 렌티 바이러스 입자 (렌티)과 말로 뮤린 백혈병 바이러스 (레트로 바이러스)에 기초하여 이들. 이러한 바이러스의 양이 안정한 큰 유전자의 발현을 지원할 수 있지만, 레트로 바이러스 입자는 게놈 내로 통합 할 수 뒤따라서 핵 봉투의 저하와 함께 반지 세포 분열은 레이블을 도구 및 출생 날짜 셀 (6)로 사용할 수 있습니다. 렌티 바이러스는 바이러스를 수집하는 동안 카페인 (8)의 사용을 포함하여 상대적으로 낮은 역가 7,이 방법론 인 명성을 가지고 있지만, 통상적으로 10 9 10 10 입자 / ml의의 역가를 생성합니다. 렌티 및 레트로 바이러스의 또 다른 이점은 매우 큰 인서트에 대한 내성이다. 다음 프로토콜 모음 형광 리포터는 sgRNAs 및 Cas9은 DNA를 변경뿐만 아니라 형광 단백질을 발현하는 CRISPR / Cas9 시스템을 이용하는 코딩하는 렌티을 설계 또는 레트로 바이러스에 대한 절차를 설명. 마우스 정위 신경 외과는 형태, 기능, 감염된 신경 세포의 연결을 연구하기 위해 생체 내에서 바이러스를 주입하기위한 유용한 방법이다. 신경 세포의 바이러스 감염이 팀 장기간에 걸쳐 발현을 조작하기 위해 사용될 수있다이러한 개발에 걸쳐 같은 즉, 표현은 정확하게 다양한 약물 유도 시스템 및 특정 Cre 호텔 구동 식의 사용에 의해 제어 될 수있다. 이 특정 프로토콜은 성인 쥐의 뇌에 대한 관심의 유전자를 녹아웃하는 sgRNA 및 Cas9를 발현하는 바이러스를 주입하는 방법에 대해 설명합니다. 마우스는 48 시간 후 분사 내에서 볼 수있는 바이러스 성 유전자의 절차와 표현에서 매우 신속하게 복구 할 수 있습니다. 그러나, 형광 발현 3 주 후 감염에 의해 근처 최대 수준의 결과 주간의 과정을 통해 증가가 나타납니다. 바이러스 정위 주사를 거쳐 마우스 동작, 전기 생리학 또는 형태 학적 연구에 사용할 수있다. 전반적으로, 이러한 절차의 목적은 정위 수술 특정 sgRNA 및 Cas9를 발현하는 바이러스를 사용하여 성인 마우스 뇌 유전자 녹아웃 방법을 설명한다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">세포 배양 시약 목록</td></tr><tr><td>293FT 세포주</td><td>Life Technologies</td><td>R700-07</td><td>Lentivirus</td></tr><tr><td>293GP 세포주</td>용 <td>Clontech</td><td>631458</td><td>Retrovirus</td></tr><tr><td>Iscove의 DMEM (IMDM) 수정</td>용<td>Corning&nbsp;</td><td>10-016-CV</td><td>10% FBS, 1% NEAA, 1% L-Gln, 그리고 &nbsp; 1% P/S</td></tr><tr><td>태아 소 혈청 (FBS)</td>을 포함한 완전한 IMDM <td>Corning</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산 (NEAA)</td><td>Corning</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민 용액, 100x (L-Gln)</td><td>Corning</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신 용액, 100x (P/S)</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>폴리스티렌 10&nbsp; cm 플레이트</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-3394</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA 1x</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">List of Transfection Reagents</td></tr><tr><td>5&nbsp; ml 폴리스티렌 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘 이수화물(CaCl2)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>C69-500</td><td>ddH2O 염화나트륨(NaCl)에서 2.5M 용액 만들기</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>BP2939-100</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성 (Na2HPO4)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>2x HEPES 완충 식염수 (HBS)</td><td></td><td></td><td>500 ml: 8.2 g NaCl, 5.95&nbsp; g Hepes, 0.106 g Na2HPO4, pH 7.01 (정확!)</td></tr><tr><td>카페인</td><td>시그마-알드리치</td><td>C0750-5G</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &마이크로; M 주사기 필터 유닛</td><td>EMD Millipore&nbsp;</td><td></td><td></td>SLGV033RS</tr><tr><td>0.45 &마이크로; M 주사기 필터 유닛</td><td>EMD Millipore&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SLHP033RS 60 cc L/L 주사기</td><td>Med-Vet International</td><td>MV60CCLL</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 원뿔형 튜브</td><td>코닝</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 글리콜&nbsp; &nbsp; 6000 (PEG 6000)</td><td>Millipore</td><td>528877</td><td></td></tr><tr><td>(10x) 인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>National Diagnostics</td><td>CL-253</td><td></td></tr><tr><td>0.5ml 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>USA Scientific</td><td>1605-0000</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Fisher Scientific</td><td>CB-40230A</td><td></td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC41678-5000</td><td></td></tr><tr><td>기증자 말 혈청</td><td>Cellgro</td><td>35-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>10ml 혈청학 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>anti-GFP, rabbit, 488 conjugate</td><td>Invitrogen</td><td>A21311</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Stereotaxic Surgery 시약</td></tr><tr><td>Vet-Syringe 수의사는 T.B. 주사기만 사용합니다. T.B. 100/bx</td><td>Med-Vet International</td><td>1CCVLS</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>스테인리스 스틸 메스 블레이드, #10, 100-pk</td><td>Med-Vet International</td><td>JOR580S</td><td></td></tr><tr><td>인공 눈물 연고</td><td>Med-Vet International</td><td>RXPARALUBE-O</td><td></td></tr><tr><td>PVP PrepSolution&nbsp;</td><td>Med-Vet International</td><td>HPIV108208H</td><td></td></tr><tr><td>생리식염수&nbsp;</td><td>Med-Vet International</td><td>DYND500MLSH</td><td></td></tr><tr><td>면 팁 애플리케이터</td><td>Med-Vet International</td><td>CTA6</td><td></td></tr><tr><td>삼중 항생제 연고&nbsp;</td><td>메드-벳 인터내셔널</td><td>RXTRIP-OI15</td><td></td></tr><tr><td>MONOJECT&reg; 바늘 소프트 팩 25g×5/8"</td><td>Med-Vet International</td><td>25058</td><td></td></tr><tr><td>6-0 실크 봉합</td>사 <td>Med-Vet International</td><td>MV-711</td><td></td></tr></tbody></table>

디자인, 포장, 높은 역가 crispr 레트로와 렌티 배달 정위 주입을 통해

Designing, Packaging, and Delivery of High Titer CRISPR Retro and Lentiviruses via Stereotaxic Injection

복제 결함 렌티바이러스 또는 레트로바이러스는 감염된 숙주 세포의 게놈에 형질전환 유전자를 안정적으로 통합할 수 있습니다. 이 기술은 형광 단백질, 세포 활성의 광 또는 화학 유전 컨트롤러 또는 모델 유기체에서 인간 유전자의 이종 발현을 인코딩하는 데 널리 사용되었습니다. 이러한 바이러스는 또한 형질전환 동물의 관련 표적 부위에 재조합효소를 전달하거나 유전자 발현을 조작하기 위해 작은 헤어핀 또는 마이크로 RNA를 전달하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 이러한 기술은 효과가 있었지만 형질전환 동물(재조합효소)에 의존하거나 높은 효능 및 특이성(shRNA/miRNA)이 부족한 경우가 많습니다. 이와는 대조적으로, CRISPR/Cas 시스템은 DNA에서 이중 가닥 절단을 유도하기 위해 외인성 가이드 RNA를 통해 유기체 게놈의 특정 부위를 표적으로 하는 외인성 Cas nuclease를 사용합니다. 그런 다음 이러한 절단은 NHEJ(Non-homologous end joining)에 의해 복구되어 유해한 미스센스 또는 넌센스 돌연변이를 초래할 수 있는 삽입 및 삭제(indel) 돌연변이를 생성합니다. 본 원고는 형광 리포터를 발현하기 위해 뉴런을 안정적으로 transduction할 수 있는 단일 lenti/retro 바이러스 입자의 설계, 생산, 주입 및 검증에 대한 상세한 방법을 제공하며, Cas9 및 sgRNA를 모델 유기체의 유전자를 knockout할 수 있습니다.

특정 시퀀스를 대상으로 올리고 하류 hU6 프로모터의 PXL 클로닝 벡터에 삽입하고, 발현 벡터는 BbsI 복제 사이트를 사용하여 가이드 RNA 지지체의 하류에있다 &quot;CRISPR / Cas9 레트로 바이러스에 대한 가이드 스트랜드 (sgRNA)를 설계하기위한 프로토콜의&quot;다음 (그림 1, 단계 1). 이 sgRNA 다음 PXL로부터 절단하고 BstBI 및 PACI 위치 (도 1, 단계 2)를 사용하여 pRubi 백본에 삽입된다. 마지막으로, 다른 sgRNA이 유전자의 또 다른 영역을 대상으로하고 NHEJ 통해 녹아웃 가능성을 증가 pRubi-Guide1 (도 1, 단계 3)에서 제 1 가이드의 하류에 배치 될 수 PXL로 클로닝. 정확한 구문 검증은 서열 분석에 의해 결정되어야한다. 이 구조가 만들어지면, 그것은 &quot;/ 역 렌티 바이러스 생산 - CaPO4 메소드 프로토콜&quot;다음 바이러스로 패키지 될 수있다. 성공적인 패키징은 V 역가를 위하여 HEK293 세포로의 바이러스 감염에 의해 확인irus. 더 형광 발현이없는 경우, 아마도 바이러스 포장 중에 오류가 있었다. 그림 2는 2 레트로 바이러스, 하나의 표현 GFP 다른 표현 mCherry의 대표 결과, (7 일짜리) 신생아 마우스의 치아 이랑에 공동 주입 및 이십일일에게 주입 후 몇 군데. mCherry 또는 GFP와 신경 세포의 표지는 단독으로 형광을 표현하는 하나의 바이러스가 CRISPR을 표현할 수 같은 조직에서 다양한 유전자 조작의 형태 학적 평가 / Cas9 매개 KO 다른 제어 바이러스를 할 수 있습니다. 정위 주입은 의도 된 좌표의 치아 이랑의 개별 감염에 의해 입증 된 바와 같이 정확한 해부학 적 선택을 할 수 있습니다. 감염 뇌 부분을 분석 할 때, 정확한 해부학 적 부위 감염되었다고 결정될 때까지 주변 조직을 유지하는 것이 중요하다. 감염의 징후가 없다면, 주입 인접 영역 발생 가능성이D는 주변 부분에서 식별 될 수있다. 또한 정확한 주입 영역을 찾기 위해 바늘 트랙을 찾는 것이 도움이 될 수있다. 생체 내 주입, 전체 치아 이랑 함께 주동이 / 꼬리 축 감염 세포를 따라 확산하는 경향이 때 3D 재구성 (그림 3)에 의해 분석으로 VSVG의 pseudotyped 바이러스는 거의 이가있는 이랑의 여백 밖으로 확산되지 않습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig1.jpg" /> 그림 1 :. 레트로 바이러스 pRubi-Guide1 - Guide2-CRISPR 플라스미드에 대한 복제 전략이 전략은 FU 기반 렌티 바이러스 플라스미드 동일합니다. sgRNA 올리고는 어닐링과 BsbI 복제 사이트를 사용하여 PXL에 삽입됩니다. 순서는 sgRNA가 성공적으로 PXL에 삽입되도록 한 후, BstBI 및 PACI와 플라스미드를 소화. (블랙 박스) 탈락되는 삽입 한 후 바이러스 다시 B로 복제됩니다하나 pRubi - Guide1 CRISPR를 (검은 색 점선). 두번째 sgRNA 또한 PXL 삽입 및 PACI 효소를 사용하여 분해 될 수있다. 이것은 다음 PACI 사이트를 사용하여 pRubi-Guide1의 CRISPR 벡터 (빨간 점선)에 복제됩니다. 생성 된 플라스미드는 가이드 가닥뿐만 아니라 필요한 바이러스 성 요소, 프로모터 및 형광 모두 포함되어 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53783/53783fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig2.jpg" /> 그림 2 :. mCherry (빨간색) 또는 GFP (녹색)를 발현하는 마우스 치아 이랑의 레트로 바이러스 주입 레트로 바이러스는 P7 마우스의 치아 이랑에 주입 하였다. 이십일일 나중에 마우스를 관류하고 뇌 단면 및 GFP 및 mCherry에 대한 염색 하였다. (A) 5 배 넓은 필드 형광 이미지는 홍보를 보여줍니다이가 이랑 주입 ecision 및 라벨 치아 이랑의 과립 신경 세포의 특이성. 해마의 형태는 DAPI (블루) 염색을 통해 알 수있다. 스케일 바는 200 μm의를 측정한다. (B) 10 배 넓은 필드 형광 화상이 고역가 렌티 바이러스는 그 형태 형광 발현을 통해 액세스 할 수있는 다수의 셀을 감염 것을 보여준다. 스케일 바는 100 μm의를 측정한다. GFP 또는 mCherry을 표현 (C) 바이러스는 치아 이랑에 공동 주입 하였다. 레트로 바이러스의 시스템을 사용하여, 하나는 GFP 및 mCherry로 표시된 다른 조작에 의해 표시된 하나의 유전자 조작을 한 바이러스를 사용하고, 각 인한 바이러스 단일 또는 첨가제 변화를 평가할 수있다. 스케일 바는 10 μm의를 측정한다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig3.jpg" /> 그림 3 :. 렌티 바이러스 주입의 해부학 적 확산 정위 공사 출<html> GFP-shPten 바이러스 및 성인의 두뇌로의 mCherry 제어 바이러스의 PTEN에 loxP / + 마우스 해마의 치아 이랑의 전체 주동이 / 꼬리 축을 따라 바이러스 확산의 결과. 이것은 바이러스의 확산 윤곽 재구성 소프트웨어를 사용하여 21 직렬 섹션 (Z = 50 ㎛의 / 제)를 통해 추적 하였다 폐쇄되는 주입의 범위의 3D 재구성에 나타낸다. 윤곽 트레이싱은 다음 볼륨 정량의 3D 이미지를 생성하기 위해 정렬했다. 전체 바이러스의 확산은 녹색으로 표시됩니다 (볼륨 = 54730800 μm의 3) 이가 지역화 확산은 (= 27,275,200 μm의 3 볼륨) 보라색에 표시됩니다. 바이러스는 니들 트랙 및 치아 이랑 (dentate gyrus)의 입쪽 / 꼬리 축 충전 이외에 니들 트랙 교차 뇌량 따라 퍼진다. 스케일 바는 200 μm의를 측정한다. 레 / ftp_upload / 53783 / 53783video1frame.jpg &quot;/&gt; 보충 비디오 sgRNAs 1. 디자인은 레트로 바이러스와 렌티 바이러스 백본으로 복제합니다. 이 합성 가이드 RNA (sgRNA) 디자인 예제에서는 마우스 CHD8의 게놈 서열은 NCBI에서 다운로드됩니다. 개시 코돈 및 엑손 구조이어서 벡터 NTI 시각화된다. 이것은 우리가 제 1 코딩 엑손 주변의 게놈 영역을 복사 Benchling으로이 순서를 입력 할 수 있습니다. Benchling은 우리 지역의 모든 잠재적 sgRNAs를 시각화 할 수 있습니다. 또한, 우리가 입력이 게놈 영역을 표시 한 후, Benchling은 우리에게 각 가이드 RNA의 대상 및 오프 목표 점수를 표시합니다. 사용자는 다음 가장 높은 온 - 오프 목표 점수 가이드 RNA를 선택할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53783/Benchling_GuideRNA_Design.mp4" target="_blank">이 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다.)</a>

CRISPR / Cas9 시스템은 과학계를 대상으로 게놈 편집에 액세스하고 저렴한 만들 수있는 가능성을 제공합니다. 이 프로토콜은 CRISPR / Cas9 시스템을 사용하여 관심의 유전자를 녹아웃 한 다음 성인 마우스 뇌에 stereotaxically을 주입합니다 바이러스를 만드는 방법을 설명하기위한 것입니다.

디자인, 포장, 높은 역가 CRISPR 레트로와 렌티 배달 정위 주입을 통해

Replication defective lentiviruses or retroviruses are capable of stably integrating transgenes into the genome of an infected host cell. This technique ...

이 절차의 전반적인 목표는 연구자가 형광 단백질, CAS9 및 sgRNA를 발현하는 바이러스를 설계 및 패키징한 후, 이를 마우스 뇌에 정위 고정 주입할 수 있도록 하는 것입니다.이 방법은 신경학적 및 신경 발달 장애의 기초가 되는 유전자의 역할과 같이 신경과학 분야의 구체적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 유전자 조작 동물을 제작하는 시간 및 자원 집약적인 과정 없이 특정 유전자를 조작할 수 있다는 점입니다.세포를 준비하기 전에, 웹사이트를 사용하여 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 설계에 사용될 20 뉴클레오타이드 가이드 가닥 또는 sgRNA를 생성하십시오. 올리고뉴클레오타이드를 주문하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 이를 사용하여 최종 플라스미드를 제작한 후, 크라이오튜브에 해동된 모든 세포를 15 milliliter 원심분리관으로 피펫팅하여 옮기십시오. 다음으로, 미리 데워진 CO2 평형 상태의 완전 IMDM 2 milliliters를 추가하십시오. 그런 다음 세포를 500 ×g에서 5분 동안 원심분리하십시오. 그 후 상층액을 흡입하여 제거하고 세포 펠릿을 10 milliliters의 완전 IMDM에 재현탁하십시오. 세포를 10 cm 세포 배양 접시에 도말하고 5% carbon dioxide 인큐베이터에서 37 °C로 하룻밤 동안 배양하십시오. 도말 24시간 후, 기존 배지를 흡입하여 제거하고 미리 데워진 IMDM 10 milliliters를 추가하여 배지를 교체하십시오. 세포가 합쳐지면(confluent) 세포를 분할하십시오. 세포를 분할하려면 배지를 흡입하여 제거하고 5 milliliters의 PBS로 플레이트를 세척하십시오. 그런 다음 플레이트에 0.25% trypsin 1 milliliter를 추가하고 세포가 플레이트에서 떨어질 때까지 37 °C에서 배양하십시오.그 후, trypsin 반응을 중화시키기 위해 IMDM 0.5 milliliters를 첨가하고 세포를 1.5 milliliter 튜브에 파이펫으로 옮깁니다. 다음으로, 세포를 500 times g에서 5분 동안 원심분리합니다. 세포를 1 milliliter의 IMDM에 재부유시키고, 세포 10 microliters를 90 microliters의 PBS에 희석합니다.헤모사이토미터 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 측정하고, 완전 IMDM을 이용하여 세포를 다시 분주합니다.5일째 되는 날, transfection 2시간 전에 배지를 교체하고 10 centimeter 플레이트에 배지가 정확히 10 milliliters가 되도록 합니다. 다음으로, 5 milliliter 라운드 바텀 폴리스티렌 튜브 2개를 사용하여 디쉬 2개 분량의 transfection 시약을 준비합니다. 첫 번째 튜브에는 DNA라고 표시하고, 두 번째 튜브에는 2X HBS라고 표시합니다. 그 후, pH 7.4의 Tris EDTA에서 DNA 농도를 1 microgram per microliter로 조정합니다.렌티바이러스 및 레트로바이러스용 트랜스펙션 시약을 제조하려면, DNA라고 표시된 튜브에 필요한 성분들을 천천히 첨가하면서 튜브를 계속해서 가볍게 두드려 혼합합니다. 그 후, 2X HBS라고 표시된 튜브에 2X HBS 1 mL를 첨가합니다. 다음으로, DNA 튜브의 내용물 1 mL를 2X HBS 튜브에 한 방울씩 천천히 첨가합니다. 2X HBS 튜브를 계속해서 가볍게 두드리며, 매 방울을 첨가할 때마다 인산칼슘 침전물이 형성되는지 관찰하여 트랜스펙션 복합체가 성공적으로 생성되었는지 확인합니다. 이어서 해당 튜브를 실온의 암소에서 30분 동안 배양합니다. 30분 후, 각 10 cm 세포 플레이트에 트랜스펙션 시약 1 mL를 천천히 한 방울씩 첨가하고, 세포를 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.6일째에 배지를 교체하십시오.7일째에, 10 mL 세롤로지컬 피펫을 사용하여 바이러스 입자가 포함된 배지를 50 mL 원심분리관으로 옮긴 후 4 °C에서 보관하십시오. 그다음, 각 세포 플레이트에 0.5% FBS 배지 8 mL를 첨가하십시오.8일째 되는 날, 바이러스 입자가 포함된 세포 배양액을 수집하여 50 milliliter 원추형 튜브에 담긴 전날의 수확물과 합칩니다.이 단계에서는 바이러스 상층액을 2000 ×g에서 10분 동안 원심분리합니다. 그 후, 0.45 µm 저단백 결합 시린지 필터로 여과하여 바이러스 배지를 정제합니다. 다음으로, 배지에 5X polyethylene glycol 6000 용액을 첨가합니다. 튜브를 여러 번 뒤집어 혼합합니다. 그런 다음 바이러스 혼합물을 4 °C에서 최소 12시간 동안 배양합니다.9일 차에, 바이러스 혼합물을 2500 ×g에서 45분 동안 원심분리합니다. 45분 후, 상층액을 제거하고 다시 2분 동안 원심분리합니다. 이어서 상층액을 다시 제거합니다. 그 후, 멸균된 PBS 320 µL를 첨가하여 펠렛을 재부유시키고, 상온의 셰이커에서 30분 동안 배양합니다. 다음 날, 바이러스를 소분하여 -80 °C에서 냉동 보관합니다.이 절차를 시작하려면, 마취된 마우스의 머리 부분을 제모하여 주사 부위를 준비합니다. 4% isoflurane을 노즈 콘(nose cone)으로 투입합니다. 다음으로 마우스를 정위 고정 장치(stereotaxic instrument)에 배치합니다. 치아가 슬롯에 안착될 때까지 바이트 바(bite bar)를 입에 넣은 후 이어 바(ear bars)를 고정합니다. 동물의 몸이 가열 패드 위에 있고 코가 노즈 콘에 위치해 있는지 확인합니다.다음으로 발가락 꼬집기(foot pinch)를 통해 마취 상태를 확인합니다. 그 후 인공눈물을 점안하여 안구를 윤활시킵니다. 이어서 제모한 머리 부위를 포비돈 아이오다인(povidone iodine)과 리도카인(lidocaine)으로 닦아냅니다.이제 두피 중앙선을 따라 작게 절개합니다. 면봉으로 두개골을 닦아내고 과산화수소를 도포하여 브레그마(bregma)를 더 잘 확인할 수 있도록 합니다. 해부 현미경을 사용하여 두개골에서 브레그마의 위치를 찾고, 그 위에 드릴 비트를 배치합니다.X, Y, Z 평면의 디지털 정위 좌표를 0으로 설정합니다. 머리가 주둥이-꼬리 방향의 Y축을 따라 수평이 되었는지 확인하려면, 드릴 비트를 lambda에 놓고 bregma와 lambda에서의 Z 좌표가 거의 0으로 동일해지도록 머리의 수평을 맞춥니다. X축을 따라 머리가 수평인지 확인하려면, 드릴 비트를 bregma와 lambda 사이의 중간 지점에 놓고, 중간 지점에서 양쪽으로 1 mm 떨어진 곳의 Z 좌표를 측정하여 두 값이 동일한지 확인합니다.다음으로, 드릴을 원하는 좌표 위에 배치하기 전 이소플루란 농도를 2%로 낮춘 후 두개골을 조심스럽게 드릴링합니다. 모든 구멍을 뚫은 후, 바이러스가 충전된 주사기를 정위 고정 장치에 부착합니다. 구멍 위에 주사기를 중앙에 맞추고 두개골 지점의 Z 좌표를 0으로 설정합니다. 주사기를 가장 깊은 Z 깊이까지 천천히 내리고, 정위 주입기를 사용하여 분당 0.25 microliters의 속도로 주입을 시작합니다. 가장 깊은 Z 깊이에서 주입이 완료되면 1분간 대기한 후 다음 좌표로 올려 다시 주입을 시작합니다. 모든 Z 주입 좌표에 주입이 완료될 때까지 이 과정을 반복합니다.마지막 주입 후, 주사기를 제거하기 전까지 2분 동안 기다립니다. 그런 다음 생쥐를 정위 고정 장치에서 분리하고 두피를 봉합합니다. 수술 부위에 리도카인과 항균 크림을 도포하고, 동물을 가열 회복 챔버로 옮기기 전에 진통제를 투여합니다.이 10X 광시야 형광 이미지는 고역가 레트로바이러스가 다수의 세포를 감염시켰음을 보여주며, 형광단백질 발현을 통해 해당 세포들의 형태를 평가할 수 있습니다. 본 예시에서는 GFP 또는 mCherry를 발현하는 바이러스를 치상회에 공동 주입하였습니다. 레트로바이러스 시스템을 이용하면, 하나의 바이러스로는 GFP로 표시된 유전적 조작을 수행하고, 다른 바이러스로는 mCherry로 표시된 조작을 수행함으로써 각 바이러스에 의한 단독 또는 가산적 변화를 평가할 수 있습니다.본 영상은 바이러스 확산의 폐쇄형 윤곽선을 21개의 연속 절편에 걸쳐 추적하여 주입 범위를 3D로 재구성한 것입니다. 이후 윤곽선 추적 데이터를 정렬하여 부피 정량화를 위한 3D 이미지를 생성하였습니다. 전체 바이러스 확산 범위는 녹색으로, 치상회(dentate gyrus)에 국한된 확산 범위는 보라색으로 표시되었습니다. 이 이미지는 바이러스가 치상회의 전후축을 채울 뿐만 아니라, 바늘 경로와 뇌량(corpus callosum)을 따라 확산되는 모습을 보여줍니다.in vivo 바이러스 주입 후, 유전자 조작이 뉴런 발달에 미치는 영향을 연구하기 위해 조직학, 전기생리학 또는 실시간 이광자 현미경법과 같은 다른 방법들을 사용합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

손상 3 - D 뇌 회로의 타겟팅 바이러스성을위한 확장 가능한 유체 인젝터 배열

Lentiviral 표현 벡터가 안정적으로 포유 동물 세포와 전체 생명체를 나누어와 비 나누어에서 다른 이펙터 분자 또는 리포터 구조를 표현하는 가장 효과적인 수단입니다. 여기 pseudoviral 입자에 lentivector 표현 구조를 패키지하고 pseudoviral 입자를 사용하여 대상 세포를 transduce하는 방법에 프로토콜을 제공합니다.

포장 HIV 또는 FIV 기반 Lentivector 식 구조 및 VSV-G Pseudotyped 바이러스성 입자의 형질 도입

체세포 줄기 세포의 확장을 제어하는​​ 것은 자신의 연구와 치료에 사용 hampering 결정하는 주요 요인입니다. 여기 시간적 마우스 뇌에서 생성 된 뉴런의 수를 증가하는 데 사용할 수있는 개발 및 성인기 동안 신경 줄기 세포 확장을 제어 할 수있는 시스템을 설명합니다.

의 배아와 성인 신경 줄기 세포의 확장<em&gt; 자궁에</em&gt; Electroporation 또는 바이러스 성 Stereotaxic 주입

출처: Chen, S., et al., 신생아 마우스 뇌의 선조체 세포에서 유전자 조작을 위한 정위 수술. J. Vis. 경험. (2018년)이 비디오는 Cre 재조합효소와 녹색 형광 단백질 또는 GFP를 암호화하는 바이러스 벡터를 유전자 변형 마우스 새끼의 선조체에 정위 주입하여 loxP 측면 STOP 카세트를 절제하여 적색 형광 단백질 또는 RFP를 리포터로 활성화하여 유전자 조작을 달성하는 방법을 보여줍니다.

마우스 새끼 선조체에서 유전자 조작을 위한 바이러스 벡터의 정위 미세 주입

출처: Pereira, M. et. al., 바이러스 벡터의 뇌내 주사에 의한 상주 신경교세포를 인터뉴런으로 생체 내 직접 재프로그래밍. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 형질전환 마우스의 대뇌 피질에 아데노 관련 바이러스를 정위 주사하여 Cre 의존성 뉴런 재프로그래밍 및 형광 리포터 유전자를 신경교세포에 전달하는 방법을 보여줍니다.

마우스 모델에서 신경교세포 재프로그래밍을 위한 바이러스 벡터의 정위 주입

출처: Fricano-Kugler, CJ, et al. 정위 주사를 통한 고역가 CRISPR 레트로 및 렌티바이러스의 설계, 포장 및 전달. J. Vis. 경험. (2016년)이 비디오는 마우스 뇌에서 정밀한 신경 유전자 편집을 위한 정위 바이러스 주입을 보여줍니다. 이 프로토콜은 치상회로의 정확한 바이러스 전달을 보장하여 형광 표지 및 CRISPR 매개 유전자 녹아웃을 가능하게 하여 생체 내에서 신경 회로, 유전자 기능 및 질병 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

마우스 뇌에서 표적 신경 유전자 편집을 위한 정위 바이러스 주사

마이크로 RNA는 뇌의 구조와 기능에 중요한 역할을한다. 여기에 우리가 과다 발현은 설계 miRNA의 발현 렌티 바이러스의 정위 주사를 사용하여 해마 miRNA의를 적용하는 방법을 설명합니다. 이 방법은을 평가하는 상대적으로 빠른 방법으로 사용할 수...

의 정위 주입 MicroRNA의 발현 마우스 해마 CA1 영역으로 렌티 바이러스 및 행동 결과의 평가

유전학과 광학을 결합 신경 과학 도구의 최근 개발, 공간 및 시간 해상도의 전례없는 수준의 신경 회로의 활동을 제어 할 수 있습니다, "optogenetics"라고. 여기에서 우리는 전두엽 피질과 subicular 피라미드 뉴런의 유전 정의 된 부분 집합의 optogenetic 조작과 생체 녹화에 통합하기위한 프로토콜을 제공합니다.

개별 피라미드 뉴런의 고 충실도 Optogenetic 제어하는​​ 방법<em&gt; 생체 내</em

렌티 바이러스는 cDNA를 표현 또는 shRNA를 생쥐의 특정 뇌 영역에서 유전자 발현을 조절할 수의 정위 주입. 여기, 우리는 오픈 필드 테스트 (OFT)과 강제 수영 시험 (FST)와 같은 행동 작업으로 정위 주사를 결합하는 프로토콜을 제시한다.

정위 사출 기술을 적용하는 것은 동물의 행동에 유전 적 영향을 연구하기

폴리글루타민 척수뇌 운동실조증은 CAG 확장으로 인해 응집 가능성이 높은 단백질이 생성되어 발생합니다. 이 프로토콜은 벡터 생성, 입체적 전달, 포함물 및 신경 마커 손실 분석을 설명하여, 신경퇴행성 질환의 기전 조사와 표적 치료제를 평가할 수 있는 통제된 플랫폼을 제공합니다.

렌티바이러스 유발 선관절 병리학을 폴리글루타민 척수소뇌 운동증의 전임상 모델로 활용하다

배우세요 CRISPR/Cas9 바이러스 설계 및 포장 방법을 통해 성체 마우스 뇌에 정위 주입하여 신경계 질환 관련 유전자 기능을 연구하세요. 이 기술은 유전자 조작 동물을 생성하지 않고도 특정 유전자를 효율적으로 연구할 수 있습니다.

디자인, 포장, 높은 역가 CRISPR 레트로와 렌티 배달 정위 주입을 통해

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