디자인, 포장, 높은 역가 CRISPR 레트로와 렌티 배달 정위 주입을 통해

이 절차의 전반적인 목표는 연구자들이 형광 단백질, CAS9 및 sgRNA를 발현하는 바이러스를 설계 및 패키징한 다음 마우스 뇌에 입지론적으로 주입할 수 있도록 하는 것입니다. 이 방법은 신경 및 신경 발달 장애의 기저에 있는 유전자의 역할과 같은 신경 과학 분야의 특정 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 유전자 조작 동물을 만드는 데 시간과 자원이 많이 드는 과정 없이 특정 유전자를 조작할 수 있다는 것입니다.

세포를 준비하기 전에 웹 사이트를 사용하여 단일 가닥 올리고를 설계하는 데 사용할 20 뉴클레오티드 가이드 가닥 또는 sgRNA를 생성합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 oligo를 주문하고 이를 사용하여 최종 플라스미드를 생성한 후 cryotube의 모든 th-od 세포를 15ml 원뿔형 튜브로 피펫팅하여 계속합니다. 다음으로 2ml의 예열된 CO2 평형 완전 IMDM을 추가합니다.

그런 다음 500회 G.에서 5분 동안 세포를 원심분리한 후 상층액을 흡인하고 세포 펠릿을 완전한 IMDM 10ml에 재현탁합니다. 세포를 10cm 세포 배양 접시에 플레이트로 고정하고 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 도금 후 24시간 후에 기존 매체를 흡인하고 예열된 IMDM 10ml를 첨가하여 매체를 교체합니다.

셀이 합쳐지면 분할합니다. 세포를 분리하려면 배지를 흡인하고 5ml의 PBS로 플레이트를 세척합니다. 그런 다음 1ml의 0.25%트립신을 플레이트에 추가하고 세포가 플레이트에서 들어 올려질 때까지 섭씨 37도에서 배양합니다.

그 후, 트립신 반응을 중화시키기 위해 0.5ml의 IMDM을 첨가하고 세포를 1.5ml 튜브에 피펫팅합니다. 다음으로, 5분 동안 500배 G로 세포를 회전시킵니다. 1ml의 IMDM에 세포를 재현탁시키고 10마이크로리터의 세포를 90마이크로리터의 PBS에 희석합니다.

혈구계(haemocytometer) 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수하고 완전한 IMDM으로 세포를 다시 플레이팅합니다. 5일째에는 형질 주입 2시간 전에 배지를 교체하고 10cm 플레이트에 정확히 10ml의 배지가 있는지 확인합니다. 다음으로, 2개의 5ml 원형 바닥 폴리스티렌 튜브를 사용하여 2회 디스에 대한 transfection 시약을 준비합니다.

첫 번째 튜브를 DNA로, 두 번째 튜브를 2X HBS로 표시합니다. 그런 다음 PH 7.4에서 Tris EDTA에서 DNA 농도를 마이크로리터당 1마이크로그램으로 조정합니다. 렌티바이러스(Lentivirus) 및 레트로바이러스(retrovirus)에 대한 트랜스펙션(transfection) 시약을 만들려면, 라벨이 붙은 DNA가 표시된 튜브에 필요한 성분을 천천히 첨가하면서 튜브를 계속 두드려 혼합합니다.

그런 다음 2X HBS라고 표시된 튜브에 2X HBS 1ml를 추가합니다. 다음으로, DNA 튜브의 내용물 1ml를 2X HBS 튜브에 한 번에 한 방울씩 천천히 추가합니다. 2X HBS 튜브를 지속적으로 두드리고 각 방울 후에 형성된 인산칼슘 침전물을 관찰하여 transfection complex의 성공적인 생성을 보장합니다.

그 후 실온에서 30분 동안 어두운 곳에서 튜브를 배양합니다. 30분 후, 각 10cm 세포판에 느린 방울로 1ml의 transfection 시약을 추가하고 섭씨 37도에서 밤새 세포를 배양합니다. 6일째에 미디어를 교체합니다.

7일째에 10ml 혈청학적 피펫을 사용하여 바이러스 입자가 포함된 배지를 50ml 원추형 튜브로 옮긴 후 섭씨 4도에서 보관합니다. 그런 다음 각 세포 플레이트에 8ml의 0.5%FBS 배지를 추가합니다. 8일째에 바이러스 입자가 포함된 세포 배지를 수집하고 50ml 원뿔형 튜브에서 전날 수확한 세포와 결합합니다.

이 단계에서 바이러스 상등액을 2000배 G로 10분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 0.45마이크로미터의 저단백질 결합 주사기 필터를 통해 바이러스 매체를 여과하여 바이러스 매체를 정제합니다. 다음으로, 5X 폴리에틸렌 글리콜 6000 용액을 매체에 첨가합니다.

튜브를 여러 번 뒤집어 섞습니다. 그런 다음 바이러스 혼합물을 섭씨 4도에서 최소 12시간 동안 배양합니다. 9일째에 바이러스 혼합물을 2500배 G에서 45분 동안 원심분리합니다.

45분 후 상층액을 버리고 다시 2분 동안 돌립니다. 그런 다음 상층액을 다시 제거합니다. 그 후, 320마이크로리터의 멸균 PBS를 첨가하여 펠릿을 재현탁시키고 실온에서 30분 동안 셰이커에서 배양합니다.

다음 날, 바이러스를 분주하고 분취액을 섭씨 영하 80도에서 동결합니다. 이 절차를 시작하려면 주사 부위를 준비하기 위해 마취된 마우스의 머리를 면도합니다. 4%이소플루란을 콧방울에 직접 분사합니다.

다음으로 마우스를 정위 기기에 놓습니다. 이어바를 고정하기 전에 이빨이 슬롯에 떨어질 때까지 바이트 바를 입에 삽입합니다. 동물의 몸이 가열 패드 위에 있고 코가 콧방울 안에 있는지 확인하십시오.

다음으로 발을 꼬집어 마취를 확인합니다. 그런 다음 인공 눈물을 바르고 눈을 윤활합니다. 그런 다음 면도한 머리에 포비돈 요오드와 리도카인을 면봉으로 닦습니다.

이제 두피 정중선을 따라 작게 절개합니다. 면봉으로 두개골을 말리고 과산화수소를 바르면 브레그마를 시각화하는 데 도움이 됩니다. 해부 스코프를 사용하여 두개골에서 브레그마를 찾고 그 위에 드릴 비트를 놓습니다.

X, Y 및 Z 평면의 디지털 정위 좌표를 0으로 설정합니다. 머리가 꼬리 꼬리 Y축에서 수평을 이루도록 하려면 드릴비트를 람다에 놓고 머리의 수평을 유지하여 Z 좌표가 브레그마와 람다에서 대략 0이 되도록 합니다. 머리가 X축을 따라 수평을 이루도록 하려면 브레그마와 람다 사이의 중간점에 드릴비트를 놓고 양쪽 중간점에서 1mm 떨어진 곳에서 Z 좌표를 측정하여 동일한지 확인합니다.

다음으로, 이소플루란을 2%로 낮추고 원하는 좌표 위에 드릴을 놓고 두개골을 조심스럽게 뚫습니다. 모든 구멍을 뚫은 후 바이러스가 채워진 주사기를 정위 기기에 부착합니다. 주사기를 구멍 중앙에 놓고 두개골의 Z 좌표를 0으로 설정합니다.

주사기를 가장 깊은 Z 깊이까지 천천히 내리고 정위 주입기를 사용하여 분당 0.25마이크로리터의 속도로 주입을 시작합니다. 가장 깊은 Z 깊이에서 주입이 완료된 후 1분 정도 기다렸다가 다음 좌표로 올리고 주입을 다시 시작합니다. 모든 Z 사출 좌표가 주입될 때까지 이 패턴을 계속합니다.

마지막 주입 후 주사기를 제거하기 전에 2분 정도 기다리십시오. 그런 다음 정위 기구에서 마우스를 제거하고 두피를 봉합합니다. 수술 부위에 리도카인과 항균 크림을 바르고 진통제를 투여한 후 동물을 가열된 회복실로 옮깁니다.

이 10X 광시야 형광 이미지는 고역가 레트로바이러스가 형광단 발현을 통해 형태를 평가할 수 있는 많은 수의 세포를 감염시킨다는 것을 보여주었습니다. 이 예에서는 GFP 또는 mCherry를 발현하는 바이러스를 치상회에 동시 주입했습니다. 레트로바이러스 시스템을 사용하면 하나의 바이러스를 사용하여 GFP로 표시된 유전자 조작 하나와 mCHerry로 표시된 다른 조작을 만든 다음 각 바이러스로 인한 단일 또는 추가 변화를 평가할 수 있습니다.

이것은 21개의 연속 절편에 걸쳐 바이러스 확산의 닫힌 윤곽을 추적한 주입 범위의 3D 재구성입니다. 그런 다음 윤곽 추적을 정렬하여 부피 정량화를 위한 3D 이미지를 생성했습니다. 총 바이러스 확산은 녹색으로, dendate 국소 확산은 자주색으로 표시됩니다.

이 이미지는 바이러스가 치상회(dentate gyrus)의 꼬리축(rostral caudal axis)을 채우는 것 외에도 바늘 궤도와 말뭉치(corpus callosum)를 따라 퍼지는 것을 보여줍니다. 생체 내 바이러스 주사 후 조직학, 전기 생리학 또는 현미경 이중으로 살아있는 것과 같은 다른 방법을 사용하여 신경 세포 발달에 대한 유전자 조작의 결과를 연구합니다.