최적화 된 N를 사용 하 여 급성 뇌 조각의 준비-메 틸-D-glucamine 보호 복구 방법

이 프로토콜에서는 최적화 된 N의 구현을 보여 줍니다.-메 틸-D-glucamine (NMDG) 보호 복구 방법의 뇌 조각 준비. 단일 미디어 공식 안정적으로 다양 한 실험적인 응용 프로그램에 대 한 어떤 나이의 동물에서 건강 한 뇌 조각 얻을 하는 데 사용 됩니다.

이 절차의 전반적인 목표는 패치 클램프 전기생리학 실험에 적합한 성숙한 성인 동물의 건강한 뇌 절편을 준비하는 것입니다. 따라서 뇌 절편 준비를 위한 이 최적화된 NMDG 보호 회복 방법을 통해 연구자들은 다양한 뇌 영역과 거의 모든 연령의 동물에 걸쳐 뇌 세포 유형의 고유 및 시냅스 특성을 탐구할 수 있습니다. 따라서 이 특정 기술의 주요 장점은 이전 방법론에 비해 신경 보존 수준이 더 높은 뇌 절편을 준비할 수 있다는 것입니다.

또한 이러한 뇌 절편은 패치 클램프 녹음에 더 적합합니다. 이 방법은 성체 쥐의 뇌 조직에 최적화되었습니다. 신경 외과 적으로 절제 된 인간 뇌 조직을 포함한 다양한 다른 종에 활용 될 수 있습니다.

이 절차를 시작하려면 조직 슬라이서 기계 및 수술 기구로 슬라이싱 스테이션을 설정하십시오. 빠른 접착 접착제를 사용하여 지르코늄 세라믹 인젝터 블레이드를 블레이드 암에 부착합니다. 그런 다음 시편 홀더를 삽입하고 블레이드의 앞쪽 가장자리를 시편 홀더 테두리에 맞춥니다.

블레이드가 금속을 긁지 않도록 작은 간격을 남겨 둡니다. 250ml 비커에 200ml의 NMDG HEPES aCSF를 채웁니다. 그리고 일정한 발암으로 얼음에서 10분 이상 미리 식히십시오.

그런 다음 150ml의 NMDG HEPES aCSF로 채워 초기 뇌 절편 회복 챔버를 설정합니다. 그리고 챔버를 섭씨 32도에서 34도의 수조에 넣습니다. 뇌 절편 보관 챔버를 설정하려면 저장소에 450 밀리리터의 HEPES aCSF를 채우고 사용할 때까지 일정한 발암으로 실온으로 데우십시오.

다음으로, 50ml 원뿔형 바이알의 열린 끝을 사용하여 이전에 준비된 접시에서 2% 아가로스 블록을 잘라내어 조직 매립을 위해 용융된 아가로스를 준비합니다. 원뿔형 바이알의 뚜껑을 느슨하게 한 다음 아가로스가 녹기 시작할 때까지 10-30초 동안 전자레인지에 돌립니다. 과열하지 마십시오.

용융된 아가로스를 1.5ml 튜브에 붓습니다. 아가로스를 섭씨 42도로 설정된 써모믹서를 사용하여 격렬하게 흔들어 용융 상태로 유지합니다. 그리고 용융된 아가로스가 조기에 응고되지 않도록 주의해야 합니다.

이때 슬라이서용 액세서리 냉각 블록을 얼음 위에서 미리 냉각하십시오. 이 절차에서는 두개골 두개골을 노출시키기 위해 머리 피부를 절개합니다. 그런 다음 가느다란 슈퍼 컷 가위를 사용하여 두개골 위의 피부를 잘라냅니다.

그리고 두개골의 꼬리 복부 기저부 양쪽에 측면으로 작은 절개를 만듭니다. 두개골의 꼬리 등 쪽에서 시작하여 등쪽 정중선 위로 위로 위로 이동합니다. 근본적인 뇌가 손상되지 않도록 주의합니다.

그 후, 후각 전구 수준에서 정중선에 수직으로 최종 T 컷을 만듭니다. 그런 다음 둥근 끝 집게를 사용하여 상부 내측 측면에서 시작하여 두개골을 잡고 한쪽에서 꼬리 측면 방향으로 벗겨냅니다. 다른 쪽이 갈라지도록 이 절차를 반복합니다.

그리고 두개골 뚜껑의 등쪽 절반을 제거하여 뇌를 노출시킵니다. 온전한 뇌를 미리 냉각된 NMDG HEPES aCSF의 비커에 부드럽게 퍼냅니다. 그리고 약 1분 동안 뇌를 균일하게 냉각시킵니다.

이제 큰 주걱을 사용하여 비커에서 여과지로 덮인 페트리 접시로 뇌를 옮깁니다. 선호하는 슬라이싱 각도와 원하는 뇌 관심 영역에 따라 뇌를 다듬고 장착합니다. 취급 중 장기간 산소 결핍을 방지하기 위해 신속하게 작업하십시오.

그 후, 접착 접착제를 사용하여 뇌 블록을 표본 홀더에 부착합니다. 표본 홀더의 내부 부분을 집어넣어 뇌 블록을 완전히 안쪽으로 빼냅니다. 그런 다음 뇌 블록이 아가로스로 완전히 덮일 때까지 용융된 아가로스를 홀더에 직접 붓습니다.

그런 다음 아가로스가 응고될 때까지 10초 동안 예냉각된 액세서리 냉각 블록을 시편 홀더 주위에 고정합니다. 시편 홀더를 슬라이서 기계의 소켓에 삽입하고 적절한 정렬을 확인합니다. 그런 다음 250ml 비이커에서 남은 사전 냉각된 산소화된 NMDG HEPES aCSF로 저장소를 채우고 적절한 산소화를 보장하기 위해 자르는 동안 거품 돌을 저장소에 놓습니다.

다음으로, 마이크로미터를 조정하여 아가로스가 내장된 뇌 표본을 진행하기 시작합니다. 슬라이서를 시작하고 진행 속도와 진동 주파수를 원하는 수준으로 경험적으로 조정합니다. 뇌의 관심 영역이 완전히 절단될 때까지 300마이크로미터 단위로 조직을 계속 전진시키고 절단합니다.

슬라이싱 절차의 총 시간은 15분 미만이어야 합니다. 초기 NMDG 복구용. 절편 절차가 완료되면 차단 플라스틱 목초지 피펫을 사용하여 모든 슬라이스를 수집하고 150ml의 NMDG HEPES aCSF로 채워진 섭씨 34도 회수 챔버로 옮깁니다.

급성 뇌 절편 회복 단계의 타이밍은 형태학적 보존과 각 뉴런의 전기생리학적 특성의 기능적 회복 사이의 균형을 유지할 수 있도록 하는 데 매우 중요합니다. 최적의 나트륨 스파이크 인 일정을 결정한 후 마우스 나이에 따라 표시된 시간에 표시된 양의 나트륨 스파이크 용액을 추가하여 Y 단계 나트륨 스파이크 인 절차를 수행합니다. 빠른 혼합을 용이하게 하기 위해 초기 회수 챔버의 버블러 굴뚝에 나트륨 스파이크인 용액을 직접 첨가합니다.

다양한 연령대와 함께 제공된 나트륨 스파이크인 일정은 정말 좋은 출발점입니다. 그러나 자신의 특정 실험 설계에 맞게 최적화하고 활용해야 합니다. 그 후, 모든 슬라이스를 실온에서 유지되는 HEPES aCSF 장기 보관 챔버로 옮깁니다.

패치 클램프 기록 실험 전에 HEPES 홀딩 챔버에서 슬라이스가 한 시간 더 회복되도록 합니다. 다음은 뉴런의 형태학적 보존 평가를 위해 다양한 뇌 영역과 3개월 된 쥐의 급성 절편에서 획득한 대표적인 IR DIC 이미지입니다. 여기에 표시된 결과는 보호 회수 단계 없이 대조군 NMDG 보호 절단 방법을 사용한 결과입니다.

이러한 결과는 최적화된 NMDG 보호 복구 방법에서 얻은 것입니다. 전반적으로 최적화된 NMDG 보호 회복 방법으로 신경 세포 보존이 개선되는 것이 관찰됩니다. 점진적인 나트륨 스파이크인 절차를 통한 최적화된 NMDG 보호 회수 방법을 기존 NMDG 보호 회수 방법과 비교했습니다.

GigaOhm 씰 형성 및 패치 클램프 기록의 평균 시간은 점진적인 나트륨 스파이크 인 절차를 NMDG 보호 복구 단계와 함께 적용했을 때 극적으로 크게 단축되었습니다. 이 뇌 절편 방법으로 달성한 향상된 뉴런 보존은 국소 시냅스 연결을 조사하기 위한 다중 전극 패치 클램프 전기생리학을 포함하되 이에 국한되지 않는 까다로운 실험 응용 분야를 용이하게 합니다. 여기에서 입증된 바와 같이, 신경 수술에서 파생된 성인 인간 ex vevo 신피질 뇌 절편을 사용합니다.

과학자들은 이 비디오를 시청함으로써 패치 클램프 기록에 적합한 뇌 절편을 준비하기 위해 앞서 설명한 새로운 나트륨 스파이크인 절차를 포함하여 최적화된 NMDG 보호 회수 방법을 구현하는 방법에 대해 잘 이해할 수 있을 것입니다. 따라서 이 프로토콜을 마스터한 후에는 매일 1시간 이내에 뇌 절편 절차를 완료할 수 있어야 합니다. 그리고 고품질의 재현 가능한 뇌 절편을 생성해야 하며 거의 모든 연령의 동물에게 효과가 있습니다.

따라서 이 절차, 이 방법은 전기생리학, 실시간 광학 이미징 및 광유전학, 수용체 이동 분석 및 뇌 세포 유형의 기능을 탐색하기 위한 기타 종류의 기능 분석과 같은 기술을 사용하여 뇌 기능에 대한 질문을 해결하는 데 적합한 뇌 절편을 준비하는 데 도움이 될 수 있습니다. 따라서 이 기술은 연구자들이 전통적으로 뇌 절편에서 성체 동물의 패치 클램프 기록에 적합하지 않은 뇌 영역을 포함하여 다양한 뇌 영역을 기능적으로 조사할 수 있도록 돕기 때문에 유용합니다.