Name: 멀티플렉스 형광 Immunohistochemical 얼룩, 이미징, 및 림프 종 조직학 샘플 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: 배우세요 림프종 조직에서 다중 형광 면역조직화학 염색 및 이미징 기법을 활용한 암 관련 항원 동시 정량 분석 방법을. 이 프로토콜은 항원 공동 발현 및 종양 미세환경 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

S. B.N. 및 A.D.J. 싱가포르의 보건의 국립 의학 연구 위원회 전환 어워드 (NMRC/TA/0020/2013 NMRC/TA/0052/2016)에 의해 지원 됩니다. 저자는 싱가포르 국립 대학 암 연구소의 Vectra 스펙트럼 영상 현미경의 구입으로에서 A.D.J.에 용 Siew 윤 연구 그랜트를 인정합니다. 이 연구는 싱가포르 NHG 도메인 특정 검토 보드 B에 의해 승인 (2014/00693).

<ol><li>Swerdlow, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSwerdlow%2C+SH+%22WHO+Classification+of+Tumours+of+Haematopoietic+and+Lymphoid+Tissues%22">WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues</a>. , Revised Fourth Edition, Stylus Pub LIc. (2017).</li>
<li>Swerdlow, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+2016+revision+of+the+World+Health+Organization+classification+of+lymphoid+neoplasms%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The 2016 revision of the World Health Organization classification of lymphoid neoplasms.</a> Blood. 127 (20), 2375-2390 (2016).</li>
<li>Dabbs, D. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDabbs%2C+DJ+%22Diagnostic+Immunohistochemistry.+Theranostic+and+Genomic+Applications%22">Diagnostic Immunohistochemistry. Theranostic and Genomic Applications</a>. , Saunders. (2010).</li>
<li>Kim, S. -W., Roh, J., Park, C. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+for+Pathologists%3A+Protocols%2C+Pitfalls%2C+and+Tips%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology+and+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry for Pathologists: Protocols, Pitfalls, and Tips.</a> Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).</li>
<li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+immunohistochemistry%2C+imaging%2C+and+quantitation%3A+a+review%2C+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification%2C+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li>
<li>Anderson, M. W., Natkunam, Y. Immunohistochemical profiling of lymphoma. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAnderson%2C+MW+%22Neoplastic+Hematopathology%3A+Experimental+and+Clinical+Approaches%22">Neoplastic Hematopathology: Experimental and Clinical Approaches</a>. Jones, D. , Humana Press. 21-44 (2010).</li>
<li>Parra, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Platforms+of+Multiplexed+Immunofluorescence+for+Study+of+Paraffin+Tumor+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer+Treatment+and+Diagnosis%22%5BJournal%5D)">Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues.</a> Journal of Cancer Treatment and Diagnosis. 2 (1), 43-53 (2018).</li>
<li>Cregger, M., Berger, A. J., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+and+Quantitative+Analysis+of+Protein+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry and Quantitative Analysis of Protein Expression.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 130 (7), 1026-1030 (2006).</li>
<li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+multiplex+immunofluorescence+panels+using+multispectral+microscopy+for+immune-profiling+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+human+tumor+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13380(2017).</li>
<li>Tóth, Z. E., Mezey, É <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Visualization+of+Multiple+Antigens+with+Tyramide+Signal+Amplification+using+Antibodies+from+the+same+Species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Visualization of Multiple Antigens with Tyramide Signal Amplification using Antibodies from the same Species.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).</li>
<li>Ng, S. -B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Analysis+of+a+Multiplexed+Immunofluorescence+Panel+in+T-Cell+Lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+TECHNOLOGY%3A+Translating+Life+Sciences+Innovation%22%5BJournal%5D)">Quantitative Analysis of a Multiplexed Immunofluorescence Panel in T-Cell Lymphoma.</a> SLAS TECHNOLOGY: Translating Life Sciences Innovation. 23 (3), 252-258 (2017).</li>
<li>Bogusz, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffuse+large+B-cell+lymphoma+with+concurrent+high+MYC+and+BCL2+expression+shows+evidence+of+active+B-cell+receptor+signaling+by+quantitative+immunofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Diffuse large B-cell lymphoma with concurrent high MYC and BCL2 expression shows evidence of active B-cell receptor signaling by quantitative immunofluorescence.</a> PLoS One. 12 (2), e0172364(2017).</li>
<li>Kalyuzhny, A. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKalyuzhny%2C+AE+%22Signal+Transduction+Immunohistochemistry%3A+Methods+and+Protocols%22">Signal Transduction Immunohistochemistry: Methods and Protocols</a>. , Humana Press. (2011).</li>
<li>Bordeaux, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+validation%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Antibody validation.</a> BioTechniques. 48 (3), 197-209 (2010).</li>
<li>PerkinElmer. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Vectra+3+Quantitative+Pathology+Imaging+System+User%27s+Manual%22">Vectra 3 Quantitative Pathology Imaging System User's Manual</a>. , PerkinElmer, Inc. (2012).</li>
<li>Ho, J., Tumkaya, T., Aryal, S., Choi, H., Claridge-Chang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+beyond+P+values%3A+Everyday+data+analysis+with+estimation+plots%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Moving beyond P values: Everyday data analysis with estimation plots.</a> bioRxiv. , (2018).</li>
<li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multispectral+Imaging+of+T+and+B+Cells+in+Murine+Spleen+and+Tumor%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology+Author+Choice%22%5BJournal%5D)">Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor.</a> The Journal of Immunology Author Choice. 196 (9), 3943-3950 (2016).</li>
<li>PerkinElmer. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Opal+Multiplex+IHC+Assay+Development+Guide%22">Opal Multiplex IHC Assay Development Guide</a>. , PerkinElmer, Inc. (2017).</li>
</ol>

A.D.J.는 사용자 그룹 회의에 여행으로 퍼 킨 엘머에서 자금 지원을 받고 있다. 저자는 공개 다른 충돌의 관심을가지고.

mf IHC 병리학 림프 병 리에 diagnosticcriteria를 수정 하 고 임상 결과의 예측으로 특정 세포 유형에서 바이오 마커의 역할 분석을 사용 하도록 가능성이 있다. 새로운 연구 방법으로 mf IHC 점점 종양 세포17의 여러 면역 매개의 양적 및 공간 확인에 적용 됩니다. 종양 마커의 공동 식 mf IHC의 검출 재현성 및 신뢰성5표시 되었습니다. 그러나, 기술은 초기와 시 약 및 조직 고정 및 처리에 불일치 때문에 그들에 같은 조직 관련 요인에서 발생 하는 변화를 복종 남아 있습니다.
기술에 중요 한 특정, 잘 검증 된 항 체 사용 하는 민감하고 재현 가능한 결과 제공. 원래 그들의 항 원에 대 한 구체적 설명 및 나중 시연 노크 아웃 모델14사용 없는 단백질을 인식 하는 항 체의 문학에서 예입니다. 어떤 야생-타입에 노크 아웃 / 눕 ...

림프 신생 세포의 억제 되지 않는 악성 확산에 의해 발생 합니다. 이 세포 면역 시스템의 중요 한 구성 요소 이며, 골 수, 림프절, 비장, 및 다른 점 막 관련 림프 시스템 등 기본 2 차 면역 기관에 지역화. 림프 신생 형태학, immunophenotype, 유전자 기능 및 임상 프레 젠 테이 션을 포함 하 여 특징의 별자리에 따라 분류는 누가 장애의 다른 유형의 그룹입니다. 각 매개 변수는 역할을, 하는 동안 혈통 정의 기능을 유지 하 고 인식 하는 B 세포, T 세포 및 자연적인 살인자 (NK) 세포1에서 파생 된 신생 WHO 분류 시스템에 대 한 기초를 형성.
림프 종의 분류에 키 림프 톨2의 다양 한 하위의 백혈구 표면 표식에 대 한 항 체의 특성화 되었습니다. Immunohistochemistry (IHC) 전통적으로 이러한 마커 분석에 사용 되었습니다과 가벼운 현미경 통해 구상 될 수 있다 세포 및 조직 기반 분자 검출에 특정 항 원-항 체 인식의 원리에 따라 그러나 3. 기존의 밝은 필드 비 멀티플렉스 IHC에서 단일 슬라이드에 여러 목표물의 식별 한계가 있기 때문에 그것은 종종 단일 조직 섹션에 여러 개의 색상 신호를 안정적으로 구분 하기 어려운-특히 매우 낮은 식4의 항 원에 대 한 육안 평가 및 정량화 얼룩의 주관적, 분석 및 데이터 해석5에 변화를 일으키는 될 수 있습니다.
따라서, 기존의 IHC에 포 르 말린 조정의 파라핀 끼워 넣어진 (FFPE) 샘플은 림프 종 같은 면역학 다양 한 질병에 여러 목표물의 동시 검색 가능 합니다. 또한, 주변의 면역 세포에서 종양 약 세포를 구별 하지 않습니다 정확 하 게. 이 림프 종에 소설 biomarkers의 관련성을 보고 하는 연구를 방해. 이러한 맥락에서 다중 형광 IHC (mf-IHC) 제공 유망한 대안 항 coexpression의 양적 평가 허용 및 제한 보존 하는 동안 더 높은 정밀도로 공간 관계6,7. 이 이미징 기술은 디지털 이미지 분석 소프트웨어와 제휴는 때 데이터 해석은 보다 효율적 및 종양과 microenvironment이8,9의 연구를 용이 하 게 한다. 이 프로토콜에는 tyramide 기반 면역 형광 (IF) 다중화 방법 신호를 증폭 하는 적용 되 고 같은 종5,7 에 개발도 그 어떤 호스트 종에서 어떤 IHC 검증 항 체와 호환 , 10. 1 차 및 이차 항 체는 여러 얼룩의 순차 응용 프로그램에 대 한 허용 하는 각 단계 후 박탈 될 수 있도록 관심의 조직에 fluorophore의 직접 활용에 대 한 tyramide 기반 프로토콜 허용 항 체 분 없이.
멀티플렉스 전략 목표 및 림프 종에서 그들의 변종 면역학 패턴을 식별 하 여 예 후와 치료 결과 예측 하는 데 유용 있을 것입니다. IHC T와 B 림프 구 마커 및 angioimmunoblastic T-세포 림프 종 (AITL)에서 T-follicular 도우미 마커 패널의 연구에 대 한 우리의 실험실에 적용 된 다중 형광 주변 T 세포 림프 종의 하위 공격적으로 임상 특징 동작 및 종양이11. 이 방법의 유틸리티는 또한 확산 큰 B-세포 림프 종 (DLBCL) 어디 Bruton의 티로신 키 니 아 제 억제의 잠재적인 치료 사용 제안 동시 C-MYC 및 BCL-2 식을 B 세포 수용 체의 신호 증가에 나와 있는 12 . 
여기 우리는 적절 한 컨트롤 조직 선택 항 체 유효성 검사에서 전체 프로토콜 설명 및 림프 FFPE를 사용 하 여 멀티플렉싱 조직, 스캔을 사용 하 여 스테인드 슬라이드의 최종 분석 자동화 양적 병리학 이미징 시스템입니다.

<table><tbody><tr><td>항체 희석제</td><td>DAKO</td><td>REF S3022</td><td>차단</td></tr><tr><td>과산화효소 차단 용액</td><td>DAKO</td><td>S2023</td><td>과산화물 차단용</td></tr><tr><td>Vectra 다중 스펙트럼 자동 현미경</td><td>Perkin Elmer</td><td>Vectra2.0.8</td><td>스펙트럼 이미징</td></tr><tr><td>절대 에탄올</td><td>EMSURE</td><td>1.00983.2500</td><td>재수화용 에틸 알코올</td></tr><tr><td>증폭 희석제</td><td>PERKIN ELMER</td><td>FP1135</td><td>형광단 희석제 완충액</td></tr><tr><td>안티 마우스 IgG [염소] HRP 표지</td><td>PERKIN ELMER</td><td>NEF822001EA</td><td>2차 항체</td></tr><tr><td>Anti-Rabbit IgG [염소] HRP 표지</td><td>PERKIN ELMER</td><td>NEF812001EA</td><td>2차 항체</td></tr><tr><td>BCL2</td><td>DAKO</td><td>클론 124 (로트 번호 20031561)(RRID-AB578693)</td> <td>1차 항체</td></tr><tr><td>BCL6</td><td>LEICA</td><td>NCL-L-BCL6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429)</td><td>1차 항체</td></tr><tr><td>CD20</td><td>DAKO</td><td>Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055)</td><td>1차 항체</td></tr><tr><td>c-MYC</td><td>ABCAM</td><td>Y 69 클론 ab32072 (Lot No. GR29511133)(RRID-AB731658)</td><td>일차 항체</td></tr><tr><td>Cy 5</td><td>PERKIN</td><td>ELMER FP1171</td><td>적절한 티라미드 기반 형광 시약</td></tr><tr><td>Graphpad Prism 7</td><td>Graph pad</td><td></td><td>Statisitcal software</td></tr><tr><td>HistoClear Clearing Agent</td><td>SIGMA</td><td>H2779-1L</td><td>Histoclear for dewaxing and clearing</td></tr><tr><td>inForm Advanced Image Analysis Software</td><td>Perkin Elmer</td><td>Inform Software 2.2.1</td><td>데이터 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>KI67</td><td>DAKO</td><td>Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699)</td><td>1차 항체</td></tr><tr><td>KOS MILESTONE 다기능 조직 처리기</td><td>Milestone</td><td>Microwave for Heat induced epitope retrieval</td>Microwave <td></td></tr><tr><td></td><td>PANASONIC</td><td>NN-ST651M</td><td>마이크로파 스트리핑</td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>81381 Aldrich Mowiol&reg; 4-88</td><td>장착 매체</td></tr><tr><td>오팔 570</td><td>PERKIN ELMER</td><td>FP1488</td><td>적절한 티라미드 기반 형광 시약</td></tr><tr><td>Opal520</td><td>PERKIN ELMER</td><td>FP1487B21</td><td>적절한 티라미드 기반 형광 시약</td></tr><tr><td>Opal540</td><td>PERKIN ELMER</td><td>FP1494</td><td>적절한 티라미드 기반 형광 시약</td></tr><tr><td>Opal620</td><td>PERKIN</td><td>ELMER FP1495</td><td>적절한 티라미드 기반 형광 시약</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine 코팅 슬라이드</td><td>FISHER SCIENTIFIC</td><td>120-550-15</td><td>일상적인 조직학적 사용에서 조직 단면 접착을 위한 슬라이드</td></tr><tr><td>Spectral DAPI</td><td>PERKIN ELMER</td><td>FP1490</td><td>핵산 염색</td></tr><tr><td>타겟 검색 솔루션, pH9.0(10x)</td><td>DAKO</td><td>S2367</td><td>HIER</td></tr><tr><td>Tris Buffer Saline (TBS)</td><td>1st BASE</td><td>BUF3030 20X4L</td> for <td>buffer 워시</td></tr><tr><td>트윈 20</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>P1379-1 L</td><td>트윈</td></tr></tbody></table>

멀티플렉스 형광 immunohistochemical 얼룩, 이미징, 및 림프 종 조직학 샘플 분석

Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining, Imaging, and Analysis in Histological Samples of Lymphoma

Immunohistochemical (IHC) 방법 가벼운 현미경 검사 법에 의해 단백질 표정에 현장 분석에 대 한 연구와 진단 목적을 위한 강력한 도구입니다. 그러나, 시각화 및 정량화 기존의 비 IHC를 사용 하 여 단일 조직 섹션에서 여러 개의 항 원에의 도전 이다. 멀티플렉스 이미징 관계가 특히 림프 종 연구와 진단, 마커 복잡 한 종양 microenvironment의 맥락에서 해석 될 수 있다. 여기 우리는 멀티플렉스 형광 IHC 림프 종에 대 한 관심의 특정 세포 유형에 여러 대상의 양적 평가 있도록 얼룩에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 방법 측면 커버 유효성 검사 항 체, 항 체 최적화, 림프의 표식이 있는 멀티플렉스 최적화, 데이터 분석, 특정 뒤 조직 microarray (TMA) 슬라이드 및 슬라이드, 스캔의 얼룩 림프 종 참조. 이 메서드를 사용 하 여 모두 관심과 백분율 양성의 감 적의 평균 강도 대 한 점수는 정량 분석을 더 촉진 하기 위하여 생성 됩니다. 멀티플렉싱 샘플 사용률을 최소화 하 고 각 표식에 대 한 관심의 공간 정보를 제공 합니다.

mf IHC BCL2 유전자 재배열 (더블 히트 림프 종)와 C-MYC DLBCL 샘플에 대 한 이미지는 그림 1에 표시 됩니다. 그림 2 에서는 시뮬레이션된 밝은 필드 immunohistochemical 이미지를 보여 줍니다. 그림 3 백분율 데이터의 생성을 나타냅니다. 그림 4 는 숫자 데이터의 생성에 대 한 중간 공식의 세부 정보를 표시합니다. 그림 5 angioimmunoblastic T-세포 림프 종에서 T-셀 패널의 mf IHC의 응용 프로그램을 보여 줍니다. 그림 6 편도 선 컨트롤 샘플 및이 샘플에 대 한 데이터 분석의 최적화 이미지를 보여...

여기 우리는 다중 형광 immunohistochemical 얼룩 및 여러 암 관련 항 림프 종에서의 동시 지역화에 대 한 이미징에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 모든 조직 섹션에서 생체의 colocalization 분석을 확장할 수 있습니다.

멀티플렉스 형광 Immunohistochemical 얼룩, 이미징, 및 림프 종 조직학 샘플 분석

Immunohistochemical (IHC) methods for the in-situ analysis of protein expression by light microscopy are a powerful tool for both research and diagnostic ...

림프종은 조직학적으로 복잡한 종양입니다. 따라서, 다중형형 면역조직화학은 종양세포 및 미세환경에 대한 관심의 마커를 연구하기 위해 종래의 염색체 면역조직화학에 비해 이점을 제공한다. 이 기술은 조직성 림프종 샘플에서 항체 기반 염색의 점수를 표준화할 수 있는 잠재력을 가지고 있으며, 이는 역사적으로 종양 미세 환경의 복잡성으로 인해 어려움을 겪고 있는 과정이다.구체적으로, 멀티플렉스형형 면역조직화학 및 스펙트럼 이미징은 단일 슬라이드 내에서 다중 얼룩의 정량적 측정을 가능하게 하여 임상 물질 내의 항원 공동 발현 및 스페이션 관계의 평가를 가능하게 한다. 먼저 전자레인지에 표준 항원 검색 버퍼에 왁싱 및 수화 된 슬라이드를 침지하여 유리 항아리를 절약하고 적절한 전자 레인지에서 열 유발 에피토프 검색을 수행하십시오. 최종 멀티플렉스 서열에서 항체의 위치를 기준으로 마이크로파 스트리핑을 추가로 수행한다.예를 들어, 제4 항체는 염색하기 전에 마이크로파 스트리핑의 세 가지 추가 라운드가 필요합니다. 스트리핑 공정이 완료된 후, 집게와 내열 장갑을 사용하여 슬라이드를 실온에서 증류수로 이송하여 최소 10분 간 식힙니다. 항원 회수 용액이 냉각되면, 10분 동안 상업용 과록시다제 블록을 통해 조직 과산화증 활성을 차단한 다음 트리스 버퍼링식식염수 또는 TBS, 및 비이온 세제에서 5분간 세척한다.차단 버퍼에서 10분 배양으로 비특이적 염색을 차단한 다음 실온에서 관심 있는 1차 항체를 30분, TBS-D 버퍼로 35분 세척합니다. 다음으로, 적절한 고추냉이 과록시다제가 실온에서 15분 동안 이차 항체를 공주한 다음, TBS-D 완충제에서 3개의 세척을 시연한 후 적절한 고추냉이 과산화증으로 샘플을 배양한다. 마지막 세척 후, 실온에서 5 분 배양 에 대한 슬라이드에 적절한 티라마이드 기반형 형광 시약을 적용한 다음 3 5 분 TBS-D 세척.입증된 바와 같이 신선한 항원 검색 용액에서 1차 및 이차 항체를 제거하기 위해 추가 마이크로파 기반 스트리핑을 수행한다. 검색의 끝에서, 증류수에서 슬라이드를 냉각하고 실험실 물티슈티없이 슬라이드의 영역을 건조. 실온에서 10분 동안 dappy로 슬라이드를 인큐베이션한 다음 3개의 TBS-D 세척이 진행됩니다.그런 다음 조직에 연락하지 않고 실험실 물티슈로 슬라이드를 조심스럽게 건조시키고 이미징에 적합한 마운팅 매체로 샘플을 장착하십시오. 모노플렉스 슬라이드 스캐닝의 경우, 샘플 라벨링에 사용되는 형광류에서 적절한 필터를 선택하고 각 마커와 해당 형광 채널을 검사하여 깨끗한 신호를 얻기 위한 적절한 노출 시간을 식별하고 마커에 대한 가장 강한 신호를 가져야 하는 조직 구성 요소에 초점을 맞춘다. 픽셀 강도의 교차 샘플 비교를 허용하려면 라이브 카메라 설정을 사용하여 라이브 카메라 이미지에 과다 노출된 영역이 없을 때까지 각 개별 채널의 노출 시간을 조정합니다.모든 슬라이드를 스캔한 경우 시뮬레이션된 밝은 필드 이미지를 획득하여 일반 면역히스토케식 패턴과 시각적으로 비교하고 염색 패턴이 올바른지 확인합니다. 조직 마이크로어레이 슬라이드를 스캔하려면 이미징 시스템에서 조직 마이크로어레이 스캐닝 모드와 적절한 자동 초점 알고리즘을 사용합니다. 전체 조직 섹션 슬라이드의 경우, 가장 대표적인 종양 영역에서 최적의 이미지를 선택하기 위해 자격을 갖춘 병리학자가 슬라이드를 검토하십시오.분석을 시작하기 전에 종양 마커를 선택하여 분석에 대한 관심 있는 세포를 식별합니다. 병리학자가 이미지를 검토하고 조직 세분화가 필요한지 여부를 결정하십시오. 필요한 경우 세분화를 위해 적절한 제어 영역을 선택하고 이미지 분석 소프트웨어가 해당 영역을 올바르게 식별할 수 있는지 확인합니다.세포 세분화 후, 병리학자가 세분화 맵을 검토하여 의도된 세분화 접근법의 충실도를 확인하고 개별 이미지를 검토하여 세포 세분화가 적절한지 또는 종양 세포, 스트로마 또는 괴사에 대해 농축된 영역을 선택하기 위해 추가 조직 세분화가 필요한지 여부를 결정하도록 한다. 그런 다음 병리학자와 함께 각 마커에 대한 광학 강도 양성 컷오프 값을 결정하고 적절한 통계 소프트웨어 프로그램에서 히스토그램을 생성하여 세포당 마커 강도의 주파수 분포를 분석한다. 정의된 셀 내에서 관심 있는 특정 마커에 대한 백분율 데이터를 생성하려면 피벗 테이블을 데이터 시트에 삽입하고 합계를 선택하여 단일 관심 마커의 긍정 비율을 계산합니다.총 수로 나눈 마커 양성 세포의 총 수가 계산됩니다. 결과는 하나의 코어, 또는 하나의 연구 번호를 가진 마커 양성 세포 백분율이다. 숫자 데이터를 생성하려면, 각 코어 또는 연구 수의 각 마커에 대한 정규화 수를 추출하기 위해 샘플 내에서 모든 세포 연구에 관심있는 각 마커의 평균 강도를 가져옵니다.여기서, c-MYC 및 BCL2 유전자 재배열을 사용한 확산 대형 B 세포 림프종 시료를 위한 대표적인 멀티플렉스 형광 면역히토화학적 이미지가 도시된다. 시뮬레이션된 밝은 필드 면역히스토케스토케컬 이미지는 유사한 종양 마커 염색 패턴을 보여줍니다. 혈관 면역 모세포 T 세포 림프종에서 T 세포 패널에 멀티플렉스 형광 면역 히토화학 적 이미지를 적용하면 종양 샘플의 세포 이질성을 드러낸다.여기서, 편도선 대조군 샘플의 최적화 및 결과 데이터 분석이 도시된다. 다양한 이미지 분석 소프트웨어 프로그램은 종양 세포 및 종양 미세 환경에서 마커 발현 및 국소화를 양화하기 위해 혼합 해제 단계 후에 사용될 수 있다. 이 기술은 연구원이 림프종의 단 하나 조직 단면도에 있는 특정 세포 모형 내의 다중 마커의 공동 발현을 공부하는 쪽을 포장합니다.마이크로 웨이브 단계 동안 열로 인한 부상을 방지하고 갑판에서 수행되는 스캐닝 단계 중 추락 위험을 인식하십시오.

multiplexed-fluorescent-immunohistochemical-staining-imaging-analysis

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Immunohistochemistry는 조직 내 단백질 국소화 및 발현을 평가하기 위한 강력한 실험실 기술입니다. 현재의 반자동 정량 분석 방법은 주관성을 도입하고 종종 재현성 없는 결과를 생성합니다. 여기에서는 다중 스펙트럼 이미징을 사용하여 multiplexed immunohistochemistry 및 단백질 발현 및 공동 국소화의 객관적인 정량화를 위한 방법을 설명합니다.

멀티 플렉스 면역 조직 화학적 염색 및 멀티 스펙트럼 영상을 사용하여 단백질 발현 및 공동 현지화의 정량

자세한 프로토콜 6-마커 멀티플렉스 면역 형광 패널 최적화 수행 위한 더 일관 된 결과를 짧은 절차 시간 자동된 염색기를 사용. 이 방법은 종양 면역 연구에 대 한 모든 실험실에 의해 직접 적응 될 수 있다.

포 르 말린 고정 암 조직 표본에 면역-종양학 연구를 위한 자동화 된 다중 면역 형광 패널

멀티플렉스 형광 면역 조직 화학은 그대로 포르말린 고정, 파라핀 임베디드 (FFPE) 조직 내에서 여러 세포 유형의 시각화를 가능하게하는 새로운 기술이다. 제시된 7색 멀티플렉스는 항체 및 시약을 최적화하고, 슬라이드를 준비하고, 일반적인 문제를 피하기 위한 설계 및 팁을 준비하기 위한 지침이 제시되어 있습니다.

수동 멀티플렉스 형광 면역성 화학의 최적화, 설계 및 함정 방지

여기에서는, 우리는 포르말린 고정된 파라핀 내장된 종양 조직 단면도에 있는 면역 세포를 구상하고, 정량화하고, 매핑하기 위한 간단하고 접근가능한 전략을 기술합니다. 이 방법론은 기존의 이미징 및 디지털 분석 기법과 이미징 분석의 다중 분석 기능 및 다중 매개 변수 분석을 확장하는 목적으로 결합합니다.

종양 미세 환경에서 면역 세포 집단의 시각화, 정량화 및 매핑

우리는 냉동 된 조직에 다중 스펙트럼 이미징을 수행하는 빠른 염색 방법을 설명합니다.

냉동 조직 섹션의 다스펙트럼 형광 이미징을위한 신속한 방법

다중화 바코드 이미지 분석은 최근 종양 미세 환경의 특성을 개선하여 세포 구성, 기능 상태 및 세포-세포 상호 작용에 대한 포괄적인 연구를 가능하게 했습니다. 본 명세서에서는 올리고뉴클레오티드 접합 항체의 바코딩을 사용하는 염색 및 이미징 프로토콜과 고차원 이미지 분석 기술을 사용할 수 있는 사이클 이미징을 설명합니다.

파라핀 조직 샘플의 단일 세포 분석에서 면역 프로파일링 및 공간 매핑 특성 분석을 위한 멀티플렉스 바코드 이미지 분석

이 기사에서는 이미지 분석 및 공간 분석과 결합된 수동 티라마이드 신호 증폭(TSA) 다중 면역형광(mIF)을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 실험실에서 사용할 수 있는 슬라이드 스캐너에 따라 슬라이드당 2-6개의 항원을 염색하기 위해 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 섹션과 함께 사용할 수 있습니다.

종양 미세 환경의 임상 및 생물학적 평가를 위한 공간 이미지 분석과 결합된 Multiplex Immunofluorescence

이 프로토콜은 다중 면역조직화학을 사용하여 종양 미세환경의 면역 세포 특성 분석을 수행하는 방법을 자세히 설명합니다.

종양 미세환경의 공간 면역 세포 풍경에 대한 다중 면역조직화학적 분석

이 실험 프로토콜은 주로 단일 채널 항체 배양 조건을 최적화하고 항체 및 채널의 설정을 조정하여 임상 기원 폐암 조직의 자가형광 및 채널 누화 문제를 해결함으로써 다중 면역조직화학(IHC) 염색 방법을 설명하고 최적화합니다.

파라핀 포매된 폐암 조직을 위한 다중 면역조직화학 염색

다중 순환 면역조직화학은 반복적인 항원-항체 배양, 이미지 스캐닝, 이미지 정렬 및 통합을 사용하여 여러 마커를 동시에 현장에서 검출할 수 있습니다. 여기에서는 폐암과 쌍을 이루는 뇌 전이 샘플에서 이 기술로 면역 세포 기질을 식별하기 위한 운영 프로토콜을 제시합니다.

Multiplex Cyclic Fluorescent Immunohistochemistry(다중 순환 형광 면역조직화학)

이 보고서는 자동 슬라이드 염색기에서 다중 면역형광(mIF) 분석을 위한 자동 프로토콜에 대해 설명합니다. 이는 표준 고처리량 조직 자동염색기 및 전체 슬라이드 형광 이미저에서 공간 단백질체학의 높은 재현성을 보여주며, 이는 중개 연구에서 많은 수의 조직 슬라이드에 걸친 맞춤형 mIF 분석에 이상적입니다.

중개 연구를 위한 High-Throughput Automated Multiplex Immunofluorescence Assay

배우세요 림프종 조직에서 다중 형광 면역조직화학 염색 및 이미징 기법을 활용한 암 관련 항원 동시 정량 분석 방법을. 이 프로토콜은 항원 공동 발현 및 종양 미세환경 연구에 활용됩니다.

멀티플렉스 형광 Immunohistochemical 얼룩, 이미징, 및 림프 종 조직학 샘플 분석

더 많은 동영상 탐색