기능 보완 분석 (FCA) : 설계 및 생화학 적 경로의 교육을 보완하기 위해 구현 된 실험실 운동

Functional Complementation Essay의 전반적인 목표는 해당 유전자의 기능적 사본을 돌연변이 세포에 도입하여 효소 배경에서 야생형 표현형을 복원하는지 확인함으로써 효소의 활성을 밝히는 것입니다. 이 방법은 생화학, 미생물학, 유전학, 식물 생물학, 진화 등과 같은 다양한 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 일반적으로 인공적인 시험관 내 조건과 달리 일반적으로 생리학적인 생체 내 조건에서 효소의 기능, 활성 및/또는 역할을 평가한다는 것입니다.

이 기술의 의미는 특성화되지 않은 효소와 여전히 추정 또는 예측된 기능을 가진 효소의 기능에 대한 식별 및/또는 설명으로 확장됩니다. 이러한 기능적 보완 절차를 보여주는 사람은 생명공학 및 분자 생명과학 전공자인 테일러 하크니스(Taylor Harkness)로, 제 연구실의 학생입니다. 텍스트 프로토콜에 따라 DapL, TarB, MurE 및 RSH 유전자를 클로닝한 후 50ml의 액체 배지에 돌연변이 박테리아 세포의 단일 콜로니를 접종하여 관심 유전자로 형질전환시키고 하룻밤 사이에 성장시킵니다.

둘째 날에는 50ml의 야간 배양을 사용하여 1리터의 적절한 배지를 접종하고 섭씨 30도에서 lock-phase 또는 0.4에서 0.6의 OD600으로 성장시킵니다. 5, 000 시간 G 및 15 분 동안 4 섭씨 온도에 원심 분리에 의하여 세포를 가을걷는다. 그런 다음 상등액을 디캔팅하고 500ml의 멸균, 얼음처럼 차가운 증류수를 사용하여 펠릿을 다시 현탁시킵니다.

세포를 다시 원심분리하고 상등액을 디캔팅한 후 250ml의 멸균 얼음처럼 차가운 10%글리세롤을 사용하여 펠릿을 재현탁합니다. 세포를 마지막으로 회전시킨 후 10% 글리세롤 2밀리리터를 사용하여 세포를 재현탁합니다. 50마이크로리터 분취액을 마이크로 원심분리기 튜브에 옮기고 튜브를 드라이 아이스 에탄올 수조에 넣어 즉시 동결합니다.

전기천공을 위해 세포를 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 전기천공법을 수행하려면 50마이크로리터의 수용 세포 분취액에 1마이크로리터의 재조합 플라스미드를 첨가하고 얼음 위에 5분 동안 놓습니다. 세포를 electroporation 큐벳으로 옮기고 electroporation 기구를 뒤에 오는 조정으로 놓으십시오: 25 화씨 전기 용량, 2.5 킬로볼트 및 200 옴 저항.

그런 다음 장치에 큐벳을 사용하여 펄스를 전달합니다. 큐벳에 1ml의 회수 배지를 추가하고 세포를 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 돌연변이가 요구하는 적절한 온도에서 60분 동안 부드럽게 회전하면서 진탕 인큐베이터에서 배양물을 배양하여 세포가 회복할 수 있도록 합니다.

형질전환체를 선택하려면, 배양액 100마이크로리터를 한천 플레이트가 있는 배지에 피펫팅하고 멸균 스프레더를 사용하여 용액을 펴십시오. 그런 다음 적절한 온도에서 밤새 배양합니다. 자세한 내용은 텍스트 프로토콜을 참조하십시오.

보체 분석을 수행하려면 방금 설명한 것처럼 빈 벡터 pBAD33 또는 전기천공을 사용하여 dapL 발현 벡터로 AOH1을 변환합니다. Dap 밀리리터당 50마이크로그램, 클로람페니콜 밀리리터당 34마이크로그램, 카나마이신 밀리리터당 50마이크로그램을 보충한 LB 한천 배지에 형질전환 혼합물을 플레이트화합니다. 결과를 관찰하기 전에 섭씨 30도에서 24시간 동안 플레이트를 배양합니다.

빈 벡터 pBAD33 또는 murE 발현 벡터를 사용하여 이 비디오의 앞부분에서 설명한 것처럼 전기천공법을 사용하여 TKL-11 돌연변이를 변환합니다. 티아민 밀리리터당 50마이크로그램 및 클로람페니콜 밀리리터당 34마이크로그램을 보충한 LB 한천에 형질전환체를 플레이트화하고, 형질전환체를 확인하기 전에 24시간 동안 섭씨 30도에서 플레이트를 배양합니다. 대조군 및 실험적 변형 모두에서 콜로니를 줄무늬 또는 도금하여 LB 배지 2개, 아라비노스 0.2%, 티아민 밀리리터당 50마이크로그램을 추가하여 보완을 테스트합니다.

한 플레이트는 섭씨 30도에서, 다른 플레이트는 섭씨 42도에서 24시간 동안 배양한 후 성장 표현형을 평가합니다. 이 비디오의 앞부분에서 설명한 바와 같이 pRK290 빈 벡터 또는 각각 두 개의 개별 형질 전환 이벤트에서 네이티브 rshNsp 유전자를 포함하는 벡터를 사용하여 novosphingobium 종의 돌연변이 Hx699 균주와 야생형 Rr217 균주를 변환합니다. 테트라사이클린 밀리리터당 10마이크로그램을 보충한 감자 포도당 또는 PD 한천에 형질전환체를 플레이트화하고 적어도 72시간 동안 또는 형질전환체가 나타날 때까지 배양한다.

그런 다음 테트라사이클린(tetracycline)을 사용하여 새로운 PD 한천 플레이트에 X-패턴으로 형질전환체를 줄무늬로 만듭니다. 섭씨 30도에서 최소 4일 동안 배양한 후 두 플레이트의 성장 표현형을 육안으로 검사합니다. 대장균 이중 돌연변이 AOH1은 DapE 유전자의 돌연변이와 DapD 유전자의 결실을 가지고 있으며, Dap이 제공되지 않는 한 성장하지 않습니다.

여기에서 볼 수 있듯이, DapL을 발현하는 AOH1 돌연변이는 Dap lyse 경로에서 THDP를 LLDap으로 변환하여 LLDap이 없는 배지에서 성장할 수 있습니다. MurE 효소는 그람 음성 박테리아의 펩티도글리칸에 m-DAP를 첨가하는 것을 용이하게 합니다. 대장균 MurE 돌연변이인 TKL-11은 섭씨 42도에서 성장할 수 없습니다.

이 실험에서는 MurE로 형질전환된 TKL-11 세포만 섭씨 42도에서 성장합니다. TyrB 유전자의 돌연변이는 티로신과 페닐알라닌의 합성을 방해합니다. 그러나, 여기에서 볼 수 있듯이, TyrB 돌연변이 DL39 균주가 A.thaliana At5g36160 유전자를 발현할 때, 티로신과 페닐알라닌이 결핍된 M9 배지에서 성장하여 효소가 티로신을 합성할 수 있음을 입증한다.

노보스핑고븀 종의 Hx699 돌연변이는 비기능적 RSH 단백질을 보유하고 있으며 저점액질 표현형을 생성합니다. 그러나 천연 RSH 유전자를 사용한 형질전환은 고점막성인 다세포 X-줄무늬에서 더 많은 용해성 세포외 다당류를 생성합니다. 대조적으로, Hx699 돌연변이가 빈 벡터로 형질전환되면 저점액질 표현형을 생성합니다.

이 기술을 완전히 익히면 약 24시간에서 48시간 안에 완료할 수 있습니다. 적절하게 수행된다면, 사용된 모델 유기체의 성장에 따라 복제, 준비 및 형질전환 단계의 능력을 제외합니다. 이 절차를 시도하는 동안 기능적 보완 분석에 사용된 돌연변이의 성장 조건 요구 사항을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 기질 특이성, 온도 및 pH 최적화, 체세포 속도 등과 같은 추가 질문에 답하기 위해 기존의 체외 공리 특성화와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 생물학 분야 및 미생물학과 같은 많은 세분화 분야의 연구자들이 다양한 유기체에서 효소의 생체 내 기능 또는 역할을 설명할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 전기 기능이 있는 박테리아 세포를 만드는 방법, 전기천공법을 사용하여 박테리아를 형질전환시키는 방법, 기능적 보완을 사용하여 유전자/효소의 기능을 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

병원성 유기체와 함께 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 필요한 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.