전체 마운트하여 제브라 피쉬 배아 시편 스테인드 관찰 및 분석을위한 평면 마운트 준비 현장에서 하이브리드

이 절차의 전반적인 목표는 초기 발달 시점에서 염색된 고정 얼룩말 물고기 배아를 더 잘 시각화하는 것입니다. 이것은 먼저 C 2 교잡에서 홈 마운트를 사용하여 얼룩말 물고기 배아를 염색함으로써 수행됩니다. 다음으로, 배아를 편평하게 장착하도록 선택하고 한 쌍의 가는 집게로 난황을 중앙 절개한 다음 속눈썹 도구를 사용하여 남은 난황 알갱이를 부드럽게 긁어내고 제거합니다.

마지막으로, 배아는 슬라이드의 글리세롤에 장착되어 표본의 적절한 이미징을 가능하게 합니다. 궁극적으로, 평평하게 장착하면 난황을 제거하고 배아를 2차원 준비물에 배치하여 등쪽 관점에서 염색된 배아를 더 잘 시각화할 수 있습니다. 더 어린 발달 단계에서 온전한 배아를 이미징하는 것과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 평평한 장착으로 난황 자루를 제거하여 전체 배아를 볼 수 있다는 것입니다.

이 방법은 배아에서 신장 전 성별 영역의 영역을 특성화하는 것과 같은 발달 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 사람들은 이 기술이 배아를 섬세하게 다루어야 하고 난황 자루를 제거하는 데 필요한 적절한 압력의 양을 배우는 데 시간이 걸릴 수 있기 때문에 어려움을 겪습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 윙어 실험실의 대학원생인 저와 조이, 그리고 아만다가 맡을 것입니다.

배아를 수집, 고정 및 염색한 후 텍스트 프로토콜에 따라 하나의 X-P-B-S-T로 편평하게 장착할 배아를 선택합니다. 배아를 플라스틱 또는 유리 페트리 접시에 옮깁니다. 그런 다음 접시를 실체 현미경으로 관찰한 상태에서 미세한 집게를 사용하여 배아를 굴려서 머리와 꼬리 끝이 보이는 측면 보기를 얻습니다.

다음으로, 가는 집게를 사용하여 배아를 단단히 고정하고 두 번째 세트를 사용하여 배아의 머리와 꼬리 사이 중앙에 위치한 위치에서 난황을 절개합니다. 그런 다음 가는 집게로 참나무 세포강에서 노른자를 퍼냅니다. X-P-B-S-T 1개를 사용하여 XPBS 1-2방울을 사용하여 배아에서 흩어진 난황을 헹굽니다.

배아를 평평한 유리 슬라이드로 옮깁니다. 배아를 버퍼의 가장자리로 드래그하여 유리 슬라이드에 대해 평평한 위치에 유지되도록 합니다. 배아를 고정하는 동안 속눈썹 도구를 사용하여 배쪽 표면을 부드럽게 긁어 난황 알갱이를 제거합니다.

PBST 용액이 과도한 노른자로 어수선해지거나 증발하기 시작하면 1-2방울의 새로운 방울을 추가하고 배아를 이 새로운 완충액으로 끌어다 놓습니다. 노른자가 만족스럽게 제거된 후 최종 헹굼을 위해 배아를 PBST의 페트리 접시에 부드럽게 다시 옮깁니다. 그런 다음 배아를 100% 글리세롤이 함유된 페트리 접시에 옮기고 5분 동안 배양합니다.

배아를 유리 슬라이드에 장착하려면 깨끗한 유리잔에 옮겨 넣으십시오. 100% 글리세롤 1-2방울을 밀어 넣고 복부 노른자 쪽이 유리 슬라이드를 향하도록 놓습니다. 속눈썹 도구를 사용하여 배아를 글리세롤 방울의 가장자리로 드래그하여 슬라이드에 대해 평평한 위치를 유지합니다.

배아 축이 구부러져 있는 경우 가는 집게를 사용하여 남은 노른자를 부드럽게 작게 절개하여 긴장을 완화하고 평평하게 배치할 수 있도록 합니다. 슬라이드에서. 18 x 18 유리 커버 슬립의 네 모서리에 모델링 점토의 작은 디봇을 놓습니다.

커버 슬립을 배아에 천천히 놓고 글리세롤의 기포를 최소화하기 위해 커버 슬립을 비스듬히 기울입니다. 마지막으로, 커버 슬립 측면에 100% 글리세롤을 한 방울 더 떨어뜨려 유리 사이의 공간을 채우고 드리프트를 제거하려면 스테레오 또는 복합 현미경을 사용하여 여기에 표시된 이미지를 만듭니다. 신장을 생성하는 발달 중인 신장 전구 세포를 라벨링하기 위해 두 가지 색상의 소원과 함께 프로브의 조합이 사용되었으며 배아는 초기에 평평하게 장착되었습니다.

따라서 진드기 단계, 신장 전구 세포는 빨간색으로 표시된 델타 C를 동시에 발현하는 두엽 중배엽을 둘러싼 PAX 2 A 전사체의 발현에 의해 U자형 패턴으로 구분됩니다. 델타 C를 C crox 20과 공동 표지했을 때, PAX 2 a, SLC 4 A 4, SLC 12 A 3 및 S-M-Y-H-C 1의 발현을 분석하는 델타 C를 발현하는 신장 전구 세포의 A rostral subdomain이 밝혀졌습니다. 따라서 진드기 단계는 PAX 2 A로 전체 신장 전구 도메인의 매핑을 가능하게 하고, 상부 하위 도메인에 있는 세포의 하위 집합이 SLC 4 A 4를 발현하는 것을 밝혔습니다.

이는 SLC 12 A 3을 발현하는 신장 전구세포의 coddle subdomain과 겹치지 않았다. 이 그림에서 레틴의 레티노산의 생합성에 필요한 두 유전자인 레틴레티알데히드 탈수소효소에 돌연변이가 있는 배아 또는 DEAB 및 ALD H 억제제로 처리된 배아가 각각 WT 1 A의 발현이 감소하거나 폐지되어 플랫 마운트 제제를 사용한 두 가지 색상 소원이 기관 형성 중 세포 도메인 연구에 유용하다는 것을 보여줍니다. 유전적 돌연변이가 있거나 작은 분자에 화학적으로 노출된 제브라피시의 경우 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 10-15분이 걸릴 수 있습니다.

이 절차에 따라 이미징과 같은 다른 방법을 수행하여 신장 분절의 경계가 어디에 있는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 비디오를 시청한 후에는 노른자를 제거하여 원하는 구조를 더 잘 시각화하기 위해 염색된 제브라피시 배아를 평평하게 장착하는 방법을 잘 이해해야 합니다.