Name: 엘리사에 의해 네이티브 손상 Nucleosomes에 포스트 translational 수정의 감지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: 배우세요 NU-ELISA를 이용하여 핵소체의 번역 후 수정을 정량적으로 분석하는 방법을. 포유류 세포에서 염색질 상태를 전역적으로 평가하여 줄기세포 및 후성유전학 연구에 활용할 수 있습니다.

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NU - 엘리사 방법의 개발은 NIH 부여 RO1AG023687에 의해 지원되었다.

1. 포유 동물 세포 배양 NU - 엘리사는 문화의 성장 수있는 모든 포유 동물 세포 종류에 수행할 수 있습니다. 우리는 따라서 여러 가지 항체 (ABS)와 assays를 허용, nucleosomes가 몇 가지 동일하게 로드된 엘리사 접시를 준비하는 충분한 수량에 격리 수 있도록 세포의 대규모 배치에 중간 준비하는 것을 선호합니다. 다음 문화 비늘은 충분한 자료를 제공합니다 마우스 embyronic의 줄기 세포에 대한, 피더 세포없이 세포 중 하나 또는 두 개의 15cm 번호판을 성장. 섬유아 세포의 경우, 합류로 5-10 15cm 번호판을 성장. 2. 핵의 분리 참고 :로 표시를 제외한 모든 단계, 사전 차게 버퍼와 얼음에 있습니다. <ol><li> 접시 당 3 ML의 트립신과 세포를 Trypsinize, 결합, 그리고 얼음처럼 차가운 PBS / butyrate 20 ML를 추가합니다. 5 분 1,000 rpm으로 원심 분리기. </li><li> 10 ML PBS / butyrate의 세포를 Resuspend 5 분 1,000 rpm으로 원심 분리기. </li><li> 단백 분해 효소 억제제 (시그마 - 알드리치 P - 8340) 4 개 ML의 용해 버퍼에 Resuspend. 얼음 타입 B의 유봉 20 스트로크를 균질 다운스. </li><li> 4 10 분 2천g에서 원심 분리기 ° C. (뜨는이 프로토콜에 대한 필요하지 세포질을 포함하지만, 원하는 경우는 다른 용도로 저장할 수 있습니다.) </li><li> 2 ML 얼음 차가운 씻어 버퍼 C에서 펠렛을 (프로 테아제 억제제와 함께) Resuspend. </li><li> 레이어 5 ML 30 % 자당 쿠션 통해 resuspended 자료는 다음, 스윙 버킷 로터 5 분 2,400그램에서 원심 분리기. 핵은 쿠션을 통해 마이 그 레이션되며, 파편이 인터페이스에 남아 있습니다. </li><li> 신중하게 모든 액체 볼륨을 제거하고 250 μl 얼음 차가운 세척 버퍼 C + 프로 테아제 억제제의 핵 resuspend. </li></ol> 3. 현장 Micrococcal Nuclease (MNase) 소화에 의해 Nucleosomes의 분리 우리는 염색질이 뜨는로 무료 그대로 nucleosomes 운전 hypotonic 치료 다음, MNase 그들을 일으키는 핵 이내에 현장에서 소화되는 프로 시저를 사용하십시오. <ol><li> 샘플 3 μl 0.1 M CaCl 2를 추가합니다. 37 ° C 열 블록에 넣어. 37 ° C 온도를 가정하도록 허용합니다. </li><li> 2 대에게 MNase을 (MNase 버퍼 2 units/10μl에 용해 Micrococcal Nuclease, 시그마 - 알드리치) 추가 후, 37에 대한 품어 ° pipet 팁을 사용하여 자주 혼합 12 분, 대한​​ C. </li><li> 반응을 중지 0.5 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 나 -, 산도 8.0 6 μl를 추가합니다. 얼음 입어. </li><li> 뜨는 폐기, 4 분 2천그램에서 원심 분리기. 300 μl 0.2 MM 나 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)에서 펠렛을 Resuspend. 가끔 부드러운 pipeting 1 H 위해 얼음에 보관하십시오. (이 hypotonic 조건이 핵에서 무료 nucleosomes을 해방). </li><li> 4 4 분에 대한 3,000그램에서 원심 분리기 ° C. 얼음, 무료 nucleosomes를 포함 뜨는을 저장합니다. </li><li> 300 μl 0.2 MM 나 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 함께 다시 펠렛을 Resuspend. 가끔 부드러운 pipeting 1 H 위해 얼음에 보관하십시오. </li><li> 4 4min에 대한 3천그램에서 원심 분리기 ° C. 뜨는을 유지하고 5 단계에서 첫 번째 뜨는와 결합. 그 결과 mononucleosome 준비는 -80 ° C.에 aliquoted하고 저장할 수 있습니다 </li></ol> 참고 : 염색질의 금액 crudely 10 μl 샘플 260 nm의 흡광도에서 측정하여 quantitated 수있는 것은 물이 990 μl에 추가됩니다. 260 = 10 (1백분의 1 희석에 대한 조정 후) 염색질의 약 1mg/ml에 해당합니다. 주로 길이 146 BP의 DNA를 포함해야 MNase digestions의 품질과 범위를 모니터링하기 위해 DNA 내용에 대한 또한, 위의 절차를 수행하는 동안, 작은 샘플이 유지 수 있으며 나중에 분석했다. Laddering 불완전 MNase의 소화 나타내는 것입니다. 참고 : Fig.1은 핵 분리 및 MNase의 digestions 단계의 diagrammed 요약이 포함되어 있습니다. 4. Nucleosome - 엘리사 (NU - 엘리사) 우리는 96 잘 엘리사 microtiter 접시에 고정되었습니다 원시 그대로 nuclesosomes를 포함한 분수에 PTMS를 감지. 각 샘플의 경우, 우리는 2 배 dilutions 일련의를하고, 이러한 세중의에 우물에 코팅됩니다. <ol><li> 4 명이 50 μl / 음의 코팅 버퍼에 희석 nucleosomes와 C.에서 하룻밤 코트 MaxiSorp 플레이트 nucleosomes의 제안 시리얼 이중의 dilutions는 바닥에서만 코팅 버퍼 (0 μg의 염색질)와 0.1 μg, 0.05 μg, 0.025 μg, 0.0125 μg, 0.00625 μg, 0.00313 μg, 0.00156 μg을 추가하여 아래 행 맨 앞줄에서 준비가되어 행. (참고 : 판 표지이 단계가 필요합니다.) </li><li> 아침에 접시 세척기 10 분 결합된 총 실온 (RT) 200 μl / 잘 PBS/0.5 % 트윈 - 20와 함께 접시 4 번 씻으십시오. </li><li> 100 μl / 잘 PBS/0.05 % 트윈 - 5분의 20 %의 BSA와 RT에서 블록 1 시간. </li><li> 여전히 쌩쌩하게 거꾸로 판을 흔들어하여 차단 버퍼를 제거싱크대에. 커버 및 -20 ° C에서 접시를 저장하거나, 다음 단계로 바로 진행합니다. </li><li> PBS/0.05 % 회전에서 1 시간 동안 RT에서 품어 트윈 - 20 / 5% BSA, 50 잘 희석 / μl 1:1000의 볼륨 (또는 필요에 따라)에 1 ° 애비를 추가합니다. </li><li> RT 200 μl / 잘 PBS/0.5 % 트윈 - 20과 접시 세척기 10 분 결합된 총 접시 4 번 씻으십시오. </li><li> 기다려봐 퍼옥시데이즈 (HRP) 복합 2 · 애비, PBS/0.05 % 회전에 시간 RT에서 트윈 - 20 / 5% BSA에서 (또는 필요한) 1:5000 희석을 추가합니다. </li><li> 200 μl / 잘 PBS/0.5 % 트윈 - 20와 함께 접시 4 번 씻으십시오. 각 세차 플레이트 와셔와 RT에서 10 분 총입니다. </li><li> RT 10 분 각 잘하는 TMB 기판의 50 μl를 추가하여 번호판을 개발할 수 있습니다. 50 μl / 잘 SO 4 H 2 2N의를 추가하여 반응을 중지하고 접시 450 nm의를 참조하십시오. (팁 : 이전 읽는 absorbances에 우물에 기포를 분산하기 위해 플레이트 로터를 사용하여 2 분 1,500 rpm으로 원심 분리기). </li><li> 양적 및 통계 분석을위한 스프레드 시트 파일에 수치를 내보냅니다. </li></ol> 시약 <table border="1"><tbody><tr><td> PBS / butyrate </td></tr><tr><td> 135 MM NaCl </td></tr><tr><td> 2.5 MM KCl </td></tr><tr><td> 8 MM 나 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> 1.5 MM KH 2 PO 4 </td></tr><tr><td> 10 MM 나 - butyrate </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> 용해 완충액 </td></tr><tr><td> 250 MM의 자당 </td></tr><tr><td> 10 MM 트리스 - HCL, pH를 7.4 </td></tr><tr><td> 10 MM 나 - butyrate </td></tr><tr><td> 4 MM MgCl 2 </td></tr><tr><td> 0.1 % 트리톤 X - 100 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> 와시 버퍼 C </td></tr><tr><td> 250 MM의 자당 </td></tr><tr><td> 10 MM 트리스 - HCL, pH를 7.4 </td></tr><tr><td> 10 MM 나 - butyrate </td></tr><tr><td> 4 MM MgCl 2 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> 자당 쿠션 </td></tr><tr><td> 30 % (W / V) 씻어 버퍼 C에서 자당 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Microccocal Nuclease 버퍼 </td></tr><tr><td> 5 MM 나포 4 버퍼, pH를 7.0 </td></tr><tr><td> 0.025 MM CaCl 2 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> 코팅 버퍼 </td></tr><tr><td> 80ml 솔루션 170ml + 솔루션 B + 250ml DH 2 O </td></tr><tr><td> 솔루션 : 0.2 M 나 2 CO 3 </td></tr><tr><td> 솔루션 B : 0.2 M NaHCO 3 </td></tr></tbody></table> 5. 대표 결과 NU - 엘리사 방법, 염색질은 mononucleosomes의 형태로 준비로 로드할 수있는 준비가되어 몇 가지 동일한 접시 일련의 사용. 우리는 일반적으로 각각 다른 안티 - PTM 특정 항체 (ABS)로 탐색할 수 있도록 동일하게 - 로드된 접시의 시리즈를 준비합니다. 우리는 또한 항상 수정 상태 전체 염색질 로딩 컨트롤에 관계없이 histones을 감지 AB와 함께 탐색할 수있는 접시를 준비합니다. 이 컨트롤은 나중에 양적 다른 샘플에서 준비 nucleosomes의 PTM 내용을 비교하기 위해서는 필수적입니다. 우리가이 접근법을 사용하여 원시 흡광도 값을 수정 주어진 염색질 샘플 내에서 PTMS의 수준을 quantitate하려면 다음과 같이 첫째, 우리는 염색질을 (배경 일반적으로 무시할 수)가 포함된없는 컨트롤 우물에서 얻은 값을 사용하는 백그라운드 신호를 뺍니다. 우리는 그들의 수정 상태의 독립 nucleosomes을 감지 AB와 함께 assayed되었습니다 동일하게 읽어 접시에서 얻은 NU - 엘리사 결과에 PTM 특정 신호를 표준화. (우리는이 목적을 위해 histones H2A H2B 또는 특정 polyclonal 애비를 사용했습니다.) 그러면 염색질 각각의 희석에 대한 의미와 차이를 결정하고, 엘리사 분석의 선형 부분에서 얻은 데이터를 사용합니다. NU - 엘리사 수학 및 통계 분석의 상세한 예제는 이전에 다음 ID로 사보고되었습니다 <img src="/files/ftp_upload/2593/2593fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. NU - 엘리사 단계의 개략도 diagam. A. 포유 동물 세포 수확되며 B.의 핵은 다운스 H로 세포의 분리omogenization, C.는 세포 원심 분리 후 30 % W / V 자당 쿠션, D. 위에 로드된 중단, 핵은 펠릿로 입금되며 E, F. 염색질은 MNase에 의해 주로 mononucleomes로 현장에서 소화되며 G, H 전. 가용성식이 mononucleosomes는 hypotonic 치료 및 잔류 핵 물질의 반복 원심 분리에 의해 압축이 풀립니다. J.의 Mononucleosomes는 여러 샘플에서 (표시 샘프.이 경우에는 1, 2)는 동일하게 - 로드된 접시의 일련의 microtiter 우물에 코팅과 함께 심문 아르 총 염색질 로딩을 결정 PTM 특정 애비 및 PTM 독립 애비. 자신의 PTM 내용에 차이가 샘플 두개의 차동 신호 검출 수준의 K.의 묘사는 아직 같은 안티 H2B immunoreactivity로 판단, 유사한 전체 염색질의 콘텐츠를합니다.

<ol><li>Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 389, 251-260 (1997).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293, 1074-1080 (2001).</li>
<li>Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetylation+and+an+epigenetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Histone acetylation and an epigenetic code.</a> Bioessays. 22, 836-845 (2000).</li>
<li>Dai, B., Rasmussen, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+epiproteomic+signatures+distinguish+embryonic+stem+cells+from+differentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Global epiproteomic signatures distinguish embryonic stem cells from differentiated cells.</a> Stem Cells. 25, 2567-2574 (2007).</li>
<li>Tanasijevic, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+accumulation+of+epigen+etic+heterogeneity+during+human+ES+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Progressive accumulation of epigen etic heterogeneity during human ES cell culture.</a> Epigenetics. 4, 330-338 (2009).</li>
<li>Thomas, J. O. Isolation and fractionation of chromatin and linker histones. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThomas%2C+JO+%22Chromatin%3A+a+practical+approach%22">Chromatin: a practical approach</a>. Gould, H. , Oxford University Press. Oxford. 12-14 (1998).</li>
<li>Thorne, A. W., Cary, P. D., Crane-Robinson, C. Extraction and separation of core histones and non-histone chromosomal proteins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThorne%2C+AW+%22Chromatin%3A+a+practical+approach%22">Chromatin: a practical approach</a>. Gould, H. , Oxford University Press. Oxford. 38-39 (1998).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

NU - 엘리사는 특정 세포 유형 내에서 현재 nucleosome PTMS의 글로벌 상태를 확인할 수있는 방법을 제공합니다. NU - 엘리사 연구는 글로벌 nucleosome 수정 상태가 분기하는 세포 유형 4 비교에서 다르다 것으로 나타났습니다. 세포가 같은 epigenetic modulatory 에이전트에 노출되면 또한, NU - 엘리사 PTM 프로필은 변경 trichostatin - A 때 또는 마우스 embyronic의 줄기 세포가 4 차별하고 있습니다. 방법은 또한 인간의 ES 세포 5 염색질 연구를 성공적으로 적용되었습니다. NU - 엘리사가 현재의 형태로, 세포 epigenome의 합계 내에서 현재 PTMS만을 합성 서명을 검색할 수 있습니다하는 것이 중요합니다. 이것은 특정 유전 loci에 걸쳐 특정 PTM의 분포를 확인할 수 있습니다 게놈 전체 염색질의 immunoprecipitation에서 현저하게 다릅니다. NU - 엘리사 절차의 ​​초기 단계는 포유류의 핵 6,7에서 mononucleosomes을 분리하기 위해 이전 방법에서 조정됩니다. 이러한 적응 방법은 포유 동물 세포에서 고품질 그대로 mononucleosomes을 얻기 위해 편법 방법을 제공하고, 그 결과 분수들은 염색질 콘텐츠에 포괄하지만, 추가 핵 물질의 큰 거래를 포함하고 있습니다. 특정 애비가 사용되므로, 비 nucleosomal 자료를 오염하는 것은 큰 순결을 요구 대량 사양 접근법과는 달리, NU - 엘리사 분석에 잘 용납입니다. 그러나, NU - 엘리사는 서쪽이 서부와 nucleosomal PTMS의 검출을위한 질량 분석기 좋은 대안을 제공함으로써, 4 모래 바닥보다 더 민감하고 양적입니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> Micrococcal Nucleae </td><td> 시그마 </td><td> N3755 </td><td> -20 ° C에 저장이 U/10μl 버퍼의 aliquots를 확인 </td></tr><tr><td> Nunc MaxiSorp Microtiter 플레이트 </td><td> 어부 </td><td> 12-565-135 </td><td> 접착제 플레이트 커버도 피셔를 통해 주문할 수 </td></tr><tr><td> 자동 플레이트 와셔 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 단계 TMB - 엘리사 기판 </td><td> 찌르다 </td><td> 34,028 </td><td> 4 스토어 ° C 사용하기 전에 RT 미리 따뜻하게 또는 사양서에 대한 감독 </td></tr><tr><td> Microtiter 플레이트 리더 </td><td> 바이오 래드 microplate 리더 (모델 : 680) </td><td></td><td> 대부분의 colorimetric 플레이트 판독기 모델 적합 </td></tr></tbody></table>

엘리사에 의해 네이티브 손상 nucleosomes에 포스트 translational 수정의 감지

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

eukaryotes의 게놈은 DNA와 단백질 모두를 포함 염색질로 존재합니다. 염색질의 기본 단위는 두 histones H2A, H2B, H3, H4 1 및 각과 관련된 DNA의 146 기본 쌍을 포함하는 nucleosome입니다. histones의 N - 터미널 꼬리는 리신과 아르기닌이 풍부하고 아세틸화, methylation 및 기타 사후 translational 수정 (PTMS)에 의해 게시 - transcriptionally 수정됩니다. nucleosomes의 PTM 구성함으로써 자연 2,3에서 epigenetic는 유전자 규정의 모드를 제공하고, 관련된 DNA의 transcriptional 활동에 영향을 줄 수 있습니다. 우리는 nucleosome 엘리사 (NU - 엘리사)가 양적 세포에서 추출한 nucleosomes의 글로벌 PTM 서명을 확인하기라는 방법을 개발했습니다. NU - 엘리사는 모래 바닥 서양보다 더 민감하고 양적이며, 특정 세포 유형의 epiproteomic 상태를 심문하는 데 유용합니다. 이 비디오 저널 기사는 NU - 엘리사 분석을 수행하는 자세한 절차를 보여줍니다.

Nucleosome 엘리사 (NU - 엘리사)는 기본, 손상 nucleosomes의 준비에서 사후 translational 수정의 글로벌 패턴을 감지하는 민감한과 양적 방법입니다. 이러한 수정 methylations, acetylations 및 특정 히스톤 아미노산 잔류물에 phosphorylations를 포함하고, 따라서 NU - 엘리사는 특정 세포 유형의 전반적인 염색질 수정 상태의 글로벌 proteomic 분석을 제공합니다.

엘리사에 의해 네이티브 손상 Nucleosomes에 포스트 translational 수정의 감지

진핵생물의 게놈은 DNA와 단백질을 모두 포함하는 염색질 형태로 존재합니다. 염색질의 기본 단위는 뉴클레오솜이며, 여기에는 146...

본 실험 절차의 전반적인 목표는 백만 개의 세포로부터 얻은 전체 세포 뉴클레오솜 준비물 내에서 번역 후 변형의 상대적 수준을 정확하게 측정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 고품질의 균질한 포유류 세포 배양물을 준비합니다. 그 다음, Dounce 균질기와 원심 분리기를 이용한 기계적 파쇄를 통해 세포로부터 핵을 분리합니다.다음 단계는 핵 내에 존재하는 염색질을 소화시키고 일련의 저장액 추출을 수행하여 온전한 뉴클레오솜을 얻는 것입니다. 마지막으로, 적절한 대조군을 이용한 ELISA 분석을 통해 뉴클레오솜을 조사하여 특정 번역 후 수식화를 식별합니다. 결과적으로 뉴클레오솜 샘플 내에 존재하는 특정 수식화의 상대적 수준을 나타내는 결과를 얻을 수 있습니다.웨스턴 블로팅 및 크로마틴 면역침강법과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 다수의 뉴클레오솜 수정 상태에 대한 전반적인 양상을 쉽게 파악할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 웨스턴 블로팅보다 훨씬 민감하고 정확하며, 일반적인 분자생물학 실험 설비를 갖춘 대부분의 실험실에서 수행할 수 있습니다. 이 방법은 주요 분화 및 리프로그래밍 사건이 발생할 때 어떤 일이 일어나는지와 같이 줄기세포 및 후성유전학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.절차를 시작하려면, 먼저 15 cm 플레이트당 3 mL의 trypsin을 사용하여 세포를 trypsin 처리합니다. 얼음처럼 차가운 PBS butyrate 20 mL를 첨가합니다. 세포를 50 mL 원뿔형 튜브로 옮기고 1000 RPM에서 5분 동안 원심 분리하여 세포를 수집한 후, 상층액을 흡입 제거하고 얼음처럼 차가운 PBS butyrate 10 mL를 첨가하여 세척합니다. 세포 현탁액을 1000 RPM에서 5분 동안 다시 원심 분리합니다.상층액을 제거하고 서면 프로토콜에 기술된 대로 단백질 분해 효소 억제제가 포함된 용해 버퍼 4 mL에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 다음으로, 세포를 얼음 위에서 A type B pestle down homogenizer로 파이펫팅하여 20회 스트로크로 균질화합니다. 그 후, 균질물을 얼음 위에 놓인 원심분리 튜브로 옮깁니다.샘플을 4°C에서 2000 G로 10분 동안 원심분리하십시오. 세포질 물질이 포함된 상층액을 제거하고 재현탁하십시오.프로테아제 억제제가 포함된 얼음처럼 차가운 세척 버퍼 C 2 mL에 펠릿을 현탁시킨 후, 현탁액을 차가운 원심분리 튜브에 담긴 5 mL의 30% sucrose cushion 위에 부드럽게 층을 이뤄 쌓습니다. 핵을 분리하기 위해 스윙 버킷 로터를 사용하여 2,400 G에서 5분 동안 원심분리하면, 핵은 쿠션을 통과해 이동하고 세포 파편은 계면에 남게 됩니다. 원심분리 후 모든 액체를 조심스럽게 제거하고, 프로테아제 억제제가 포함된 얼음처럼 차가운 세척 버퍼 C 250 µL에 핵을 다시 현탁시킨 뒤, 핵을 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.뉴클레오솜 분리를 시작하려면, 핵에 0.1 molar 염화칼슘 3 µL를 첨가하고 온도가 평형을 이룰 때까지 37 °C 가열 블록에 둡니다. 그다음 10 µL의 마이크로코컬 뉴클레아제 버퍼에 희석된 마이크로코컬 뉴클레아제 2 unit을 첨가하고 37 °C에서 12분 동안 배양합니다. 피펫 팁으로 자주 혼합해 줍니다.배양 후, 0.5 M sodium EDTA pH 8 6 µL를 첨가하여 반응을 중단시키고 얼음에 놓아 냉각합니다. 다음으로 시료를 2000 ×g에서 4분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 제거하고 펠렛을 재부유시킵니다. 0.2 mM sodium EDTA 300 µL에 시료를 넣고, 가끔 부드럽게 피펫팅하여 섞어주면서 얼음 위에서 1시간 동안 배양합니다.4 °C에서 3000 G로 4분간 원심분리한 후, 유리 뉴클레오솜이 포함된 상층액을 새 원심분리 튜브에 수집하여 얼음 위에 보관함으로써 뉴클레오솜의 추가적인 재결합을 방지합니다. 펠렛을 이전과 같이 300 µL의 0.2 mM sodium EDTA에 현탁시키고, 가끔씩 부드럽게 혼합하며 얼음 위에서 1시간 동안 배양합니다.배양 후, 샘플을 원심 분리합니다. 다시, 결과물인 상층액을 얼음 위에 있는 마이크로 원심분리 튜브 내의 나머지 샘플과 혼합합니다. 뉴클레오솜 ELISA 분석을 시작하려면, 96-웰 ELISA 플레이트에 뉴클레오솜과 코팅 버퍼를 사용하여 첫 번째 웰의 50 µL당 0.1 µg부터 시작하는 5단계의 2배 연속 희석 시리즈를 로딩합니다. 모든 희석 시리즈는 3반복으로 로딩해야 합니다.코팅 버퍼만 포함된 웰을 대조군으로 포함하는 것을 잊지 마십시오. 플레이트를 4 °C에서 하룻밤 동안 배양한 후 다음 날 사용하십시오. 플레이트 워셔를 사용하여 상온에서 웰당 200 µL의 0.5% Tween 20 PBS로 플레이트를 4회 세척하며, 총 세척 시간은 10분으로 합니다.이제 웰당 100 µL의 블로킹 용액을 넣고 회전 혼합기(rotator)를 사용하여 상온에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후, 플레이트를 뒤집어 싱크대 위에서 빠르게 흔들어 블로킹 버퍼를 제거합니다. 다음으로, PBS 내 0.05% Tween 20 및 5% PSA 용액에 희석한 1차 항체를 웰당 50 µL씩 넣고, 회전 혼합기를 사용하여 상온에서 1시간 동안 배양합니다.1차 항체 배양 후, 플레이트 세척기를 사용하여 이전과 동일하게 플레이트를 세척합니다. 세척 과정이 완료되면, 5% BS, A 및 0.5%20이 포함된 PBS에 희석된 horseradish peroxidase 접합 2차 항체를 웰당 50 microliters씩 첨가하고, 로테이터 위에서 실온으로 1시간 동안 배양합니다. 2차 항체 배양 후, 이전과 동일하게 플레이트를 세척합니다.플레이트 워셔를 사용하여 플레이트를 현상합니다. 각 웰에 50 µL의 TMB Eliza 기질을 첨가하고 10분 동안 배양합니다. 실온에서 ELIZA 플레이트의 웰이 파란색으로 변하며, 그 강도는 각 웰에 존재하는 뉴클레오솜 수정의 양에 비례합니다.이제 반응을 정지시킵니다. 웰당 50 µL의 2N 황산을 첨가하십시오. 색상이 갈색으로 변할 것입니다. 플레이트를 1500 RPM에서 2분 동안 원심분리하여 기포를 제거하십시오.이제 플레이트를 컬러메트릭 플레이트 리더기로 정량 분석할 준비가 되었습니다. 마지막으로, 450 nanometers에서 플레이트를 판독하고 분석을 위해 결과를 내보내십시오. 이 기술을 숙달하고 적절히 개발하면, 이틀 안에 완료할 수 있습니다.이 기술은 줄기세포 연구 분야의 연구자들이 전체 에피프로테옴 수준에서 분화 및 리프로그래밍 사건에 대한 후성유전학적 반응을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

detection-post-translational-modifications-on-native-intact

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Ubiquitination 세 효소의 집합으로 실시하는 핵심 posttranslational 수정합니다. 이 수정에 관여 유전자의 돌연변이가 여러 가지 인간의 질병와 관련된 있습니다. 여기, 우리는 교양 세포에 단백질 ubiquitination을 감지 프로토콜...

단백질 Ubiquitination의 감지

기본 결합 및 고해상도 질량 분석과 크로 마틴 면역 가교으로 ChroP 접근 방식은 히스톤 수정, 변형 및 기능적으로 구별 염색질 영역에서 시너지 효과가 아닌 histonic 단백질의 복합 단백체 구조를 해부 할 수 있습니다.

ChroP 접근은 염색질의 궤적 특정 프로테오믹스 풍경을 해부하는 칩 및 질량 분석을 결합

여기에서는 ATP 의존성 염색질 리모델링 효소의 능력을 특성화하는 데 사용할 수 있는 생화학적 분석법을 설명합니다. 1) ATP 의존성 뉴클레오솜 슬라이딩을 촉매하고, 2) 뉴클레오솜 기질과 결합하고, 3) 뉴클레오솜 또는 DNA 의존성 방식으로 ATP를 가수분해합니다.

ATP에 의존 염색질 리모델링 효소의 활동을 분석하는 생화학 분석 실험

이 프로토콜은 질량 분석기 (MS)를 사용하여 히스톤 번역 후 변형을 특성화하기위한 완벽하게 통합 된 워크 플로우를 설명합니다. 워크 플로는 나노 흐름 액체 크로마토 그래피 및 데이터 분석을위한 지침을 사용하여 세포 배양 또는 조직, 히스톤 유도체 및 소화, MS 분석에서 히스톤 정화를 포함한다. 삼일 -이 프로토콜은 2 내에 완성을 위해 설계되었습니다.

히스톤 추출에서 데이터 분석에 : 상향식 질량 분석 사용 히스톤 번역 후 변형 분석을위한 완벽한 워크 플로우

이 프로토콜은 차등 동위 원소 표지 자매 히스톤를 포함하는 뉴 클레오의 재구성에 대해 설명합니다. 동시에, 비대칭 번역 후 개질은 뉴 클레오 히스톤 premodified 복사를 사용한 후 발생 될 수있다. 이러한 제제는 즉시 고해상도 NMR 분광법을 이용하여 두 자매 히스톤 동시에, 수정 누화 메커니즘을 연구하는데 사용될 수있다.

된 유의 동위 원소 표지 자매 히스톤과 뉴 클레오의 재구성

우리 신경 조상 세포의 히스톤 3 리 79 dimethylation (H3K79me2)-내에 있는 히스톤 마크 chromatin immunoprecipitation (칩)에 대 한 미 발달 및 출생 후 뇌 조직에서 문화를 격리 하는 효과적이 고 재현 가능한 방법을 제시는 히스톤 3의 구형 도메인입니다.

절연 및 신경 창시자 Chromatin-Immunoprecipitation 히스톤 3 리 79 Dimethylation 마크의 뒤의 재배

여러 조사, 생 포스트 번역 상 수정 대상 단백질에 대 한 매우 도전 수 있습니다. 여기에 설명 된 기술 개발 특정 PTM 타겟팅, 선호도 행렬 acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3, 및 티로신 인 산화 수정 대상에 대 한 검색에 최적화 된 세포의 용 해 버퍼 및 필터 시스템 활용 간소화 된 단일 시스템을 사용 하 여 단백질입니다.

대상 단백질에 대 한 내 생 포스트 번역 상 수정 프로필을 식별 하는 포괄적인 Immunoprecipitation 농축 시스템을 활용 하 여

유비퀴틴화는 세포 과정에서 중요한 역할을 하는 번역 후 수정이며, 듀비퀴틴화에 의해 긴밀하게 조정됩니다. 두 반응의 결함은 인간의 병리를 뒷받침합니다. 우리는 정제 된 구성 요소를 사용하여 시험관 내에서 유비퀴틴화 및 듀비퀴틴화 반응을 수행하기위한 프로토콜을 제공합니다.

체외 유비퀴틴화 및 뉴클레오소말 히스톤의 이중화 율법의 비퀴틴화 어설션

본 프로토콜은 토포이소머라제 억제제 및 포름알데히드에 의해 유도된 유비퀴틸화, SUMOylation 및 ADP-리보실화를 포함하여 DNA-단백질 가교결합(DPC) 및 번역 후 변형(PTM)을 검출하고 정량화하는 변형된 방법을 강조하여 DPC 및 그 PTM의 형성 및 복구에 대한 연구를 허용합니다.

DNA-단백질 가교 및 번역 후 변형의 정량적 검출

액체 크로마토그래피, 포획 이온 이동도 분광법 및 비행 시간 질량 분석법(LC-TIMS-ToF MS/MS)을 기반으로 하는 분석 워크플로우는 주요 매개변수(머무름 시간[RT], 충돌 단면[CCS] 및 정확한 질량 대 전하[m/z] 비율)를 기반으로 히스톤 변형 및 식별에 대한 높은 신뢰도와 재현성 있는 "상향식" 분석을 제공합니다.

액체 크로마토그래피, Trapped Ion Mobility Spectrometry 및 Time-Of-Flight Mass Spectrometry를 사용한 Histone Modification Screening

최근 인간 스핀들린 가족 구성원 4(SPIN4)에서 유전적 변이가 발견되었으며, 이는 새로운 발달 장애인 골 과다증식 환자들입니다. 뉴클레오좀 내에서 SPIN4 결합 기질로서 변형된 히스톤을 생화학적 동정하는 프로토콜과 새로운 결과가 제시되었습니다.

펩타이드 배열과 천연 뉴클레오좀 풀다운을 통해 인간 스핀들린 가족 4(SPIN4)의 결합 기질로서 변형된 히스톤의 식별

배우세요 NU-ELISA를 이용하여 핵소체의 번역 후 수정을 정량적으로 분석하는 방법을. 포유류 세포에서 염색질 상태를 전역적으로 평가하여 줄기세포 및 후성유전학 연구에 활용할 수 있습니다.

엘리사에 의해 네이티브 손상 Nucleosomes에 포스트 translational 수정의 감지

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