April 26th, 2011
Nucleosome 엘리사 (NU - 엘리사)는 기본, 손상 nucleosomes의 준비에서 사후 translational 수정의 글로벌 패턴을 감지하는 민감한과 양적 방법입니다. 이러한 수정 methylations, acetylations 및 특정 히스톤 아미노산 잔류물에 phosphorylations를 포함하고, 따라서 NU - 엘리사는 특정 세포 유형의 전반적인 염색질 수정 상태의 글로벌 proteomic 분석을 제공합니다.
이 절차의 전반적인 목표는 100만 개의 세포에서 얻은 총 세포 뉴클레오솜 제제 내에서 번역 후 변형의 상대적 수준을 정확하게 결정하는 것입니다. 이는 먼저 포유류 세포의 고품질 균질한 배양액을 준비함으로써 달성됩니다. 그런 다음 핵은 다운스(downs), 균질화기(homogenizer) 및 원심분리(centrifugation)를 통한 기계적 파괴를 통해 세포에서 분리됩니다.
다음 단계는 핵 내에 존재하는 염색질을 소화하고 일련의 저장성 추출을 수행하여 온전한 뉴클레오솜을 얻는 것입니다. 마지막으로, 뉴클레오솜은 특정 번역 후 변형을 식별하기 위해 적절한 대조군과 함께 ELIZA 분석을 사용하여 조사합니다. 궁극적으로, 뉴클레오솜 샘플 내에 존재하는 특정 변형의 상대적 수준을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.
웨스턴 블로팅(western blotting) 및 염색질 면역침전법(chromatin immunoprecite)과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 여러 뉴클레오솜 변형 상태에 대한 전반적인 그림을 쉽게 결정할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 웨스턴 블로팅보다 훨씬 더 민감하고 정확하며 일반 분자 생물학 실험을 위한 장비를 갖춘 대부분의 실험실에서 수행할 수 있습니다. 이 방법은 줄기 세포 및 후성유전학 분야의 주요 질문(예: 주요 분화 및 재프로그래밍 이벤트가 발생할 때 발생하는 일)에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.
절차를 시작하려면 먼저 트립이 15cm 플레이트당 3밀리리터의 트립신으로 세포를 마개하여 새로 트립된 세포를 트립합니다. 얼음처럼 차가운 PBS 부티레이트 20ml를 추가합니다. 세포를 50 밀리리터 원뿔형 튜브로 옮기고 튜브를 원심 분리하여 5 분 동안 1000 RPM에서 세포를 수집 한 다음 상층액을 흡인하고 10 밀리리터의 얼음처럼 차가운 PBS 부티레이트를 첨가하여 5 분 동안 1000 RPM에서 세포 현탁액을 다시 원심분리합니다.
상층액을 제거하고 서면 프로토콜에 설명된 대로 단백질 분해 효소 억제제가 포함된 4ml의 용해 완충액에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 다음으로, 세포를 피펫으로 B형 유봉 아래로 얼음 위에서 균질화하고 20번의 스트로크로 균질화합니다. 그런 다음 균질액을 얼음 위의 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
샘플을 2000G에서 10분 동안 원심분리합니다. 섭씨 4도에서. 세포질 물질과 resus를 포함하는 슈퍼 이름을 제거합니다.
펠릿을 2ml의 얼음 냉수 세척 완충액 C에 현탁시킵니다.프로테아제 억제제를 사용하여 차가운 원심분리기 튜브의 5ml, 30% 자당 쿠션에 재현탁 물질을 부드럽게 층을 이룹니다. 스윙 버킷에서 2, 400G에서 5분 동안 핵 원심분리기를 분리하기 위해 로터 핵은 쿠션을 통해 이동하고 세포 파편은 계면에 남아 있습니다. 원심분리 후 모든 액체 부피를 조심스럽게 제거하고 프로테아제 억제제로 250마이크로리터의 얼음 냉세척 완충액 C에 핵을 다시 현탁시키고 핵을 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
뉴클레오솜 분리를 시작하려면 0.1몰 염화칼슘 3마이크로리터를 핵에 추가하고 온도가 평형이 될 때까지 섭씨 37도의 열 블록에 놓습니다. 그런 다음 10마이크로리터의 마이크로 코칼 뉴클레아제에 2단위의 마이크로 코칼 뉴클레아제를 추가하고 완충액을 주입한 다음 섭씨 37도에서 12분 동안 배양합니다. 피펫 팁으로 자주 혼합하십시오.
배양 후, 0.5 몰 나트륨 E-D-T-A-P-H 8 6 마이크로 리터로 반응을 중지하고 얼음에 올려 식힌다. 다음으로 원심분리 후 4분 동안 2000G에서 샘플을 원심분리하고 스내트를 버리고 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 300 마이크로리터의 0.2 밀리몰 또는 나트륨 EDTA를 넣고 얼음 위에서 1시간 동안 샘플을 배양하고 가끔 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다.
3000G에서 4분 동안 원심분리 후. 섭씨 4도에서 새로운 Fuge 튜브에 유리 뉴클레오솜을 포함하는 상등액을 수집하고 의도적으로 추가 뉴클레오솜을 얼음 위에 저장합니다. 펠릿을 이전과 같이 0.2 밀리몰 또는 나트륨 EDT 300 마이크로 리터에 현탁시키고 가끔 부드럽게 혼합하여 얼음에서 1 시간 동안 배양합니다.
배양 후 샘플을 원심 분리하십시오. 다시, 생성된 스내트를 얼음 위의 마이크로 퍼그 튜브에 있는 나머지 샘플과 결합합니다. 뉴클레오솜 Eliza 분석을 시작하려면 뉴클레오솜 및 코팅 완충액의 5회 2배 연속 희석의 내림차순 시리즈가 있는 96웰 Eliza 플레이트를 상단 웰에서 50마이크로리터당 0.1마이크로그램으로 시작하여 모든 희석 시리즈를 3회 로드해야 합니다.
코팅 버퍼가 있는 우물은 대조군으로만 포함하는 것을 잊지 마십시오. 다음날 섭씨 4도에서 밤새 접시를 배양하십시오. 플레이트 세척기를 사용하여 웰당 200마이크로리터의 0.5마이크로리터로 플레이트를 실온에서 PBS 20인치 사이에 4회 총 10분 동안 세척합니다.
이제 블로킹 용액 웰당 100마이크로리터를 추가하고 로테이터에서 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후 싱크대 위에서 거꾸로 된 플레이트를 세게 흔들어 차단 버퍼를 제거합니다. 다음으로, 0.05%의 5% PSA 용액에 웰당 50마이크로리터의 부피로 희석된 1차 항체를 첨가하고, PBS에서 20% 사이에 용액을 실온의 회전기에서 1시간 동안 배양합니다.
1차 항체 배양 후 플레이트 세척기를 사용하기 전과 같이 플레이트를 세척합니다. 세척 절차가 완료되면 PBS에 희석된 양고추냉이 과산화효소 접합 2차 항체를 5%BS, A, 0.5%20으로 웰당 50마이크로리터씩 2차 항체 배양 후 회전체에서 1시간 동안 실온에서 배양합니다. 이전과 같이 접시를 씻으십시오.
플레이트 와셔를 사용하여 플레이트를 개발합니다. 각 웰에 50마이크로리터의 TMB Eliza 기질을 추가하고 10분 동안 배양합니다. 실온에서 ELIZA 플레이트의 웰은 파란색으로 변하고 강도는 각 내부에 존재하는 뉴클레오솜 변형의 양에 비례합니다.
그렇다면 반응을 멈추십시오. 2개의 일반 황산을 웰당 50마이크로리터를 첨가합니다. 색상이 갈색으로 바뀌면 1500RPM에서 플레이트를 2분 동안 원심분리하여 기포를 제거합니다.
이제 플레이트를 컬러 미터법 플레이트 리더에서 정량화할 준비가 되었습니다. 마지막으로 450나노미터에서 플레이트를 판독하고 분석을 위해 결과를 내보냅니다. 이 기술은 일단 숙달되면 개발 후 제대로 수행되면 이틀 안에 완료할 수 있습니다.
이 기술은 줄기세포 연구 분야의 연구자들이 전체 에피 단백질체 수준에서 분화 및 재프로그래밍 이벤트에 대한 후성유전학적 반응을 탐구할 수 있는 문을 열었습니다.
뉴클레오솜 ELISA (NU-ELISA)는 뉴클레오솜의 번역 후 수식을 검출하는 민감한 방법입니다. 이 기술을 통해 연구자들은 다양한 세포 유형에서 전체 염색질 수식 상태를 평가할 수 있습니다.
Accurate quantification of post-translational modifications on native nucleosomes enables mechanistic de-risking of epigenetic targets in early discovery. NU-ELISA provides a sensitive, global readout of chromatin states that supports target validation and assay development for epigenetics-focused drug discovery. This method enhances predictive confidence by linking modification patterns to functional outcomes in stem cell differentiation and reprogramming models.
NU-ELISA fits within the epigenetics discovery workflow from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by providing quantitative chromatin state data.