Name: ChroP 접근은 염색질의 궤적 특정 프로테오믹스 풍경을 해부하는 칩 및 질량 분석을 결합 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-11T21:00:00.000+00:00
Duration: 24 min 2 s
Description: 학습하세요 ChroP 접근법을 통해 염색질 면역침전과 고분해능 질량분석을 결합하여 기능적으로 구분되는 염색질 영역의 프로테오믹 구성을 특성화하는 방법을. 이 기술은 유전자 발현 조절 메커니즘 이해에 기여합니다.

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이 연구는 원래 몰 세포 단백질 체학 (Proteomics)에 출판되었다​​. SOLDI M. 및 염색질 기능 영역의 Bonaldi T. 프로테오믹스 조사는 고유 이질 염색질 구성 요소 MCP 사이 소설 상승 작용을 보여준다. 2013; 64-80 : 12. © 생화학 및 분자 생물학을위한 미국 사회. 우리는 원고의 비판적 읽기 로베르타 Noberini (기술 및 IEO 이탈리아 연구소, 이탈리아) 감사합니다. TB의 작품은 지오반니 Armenise ​​하버드 재단 경력 개발 프로그램, 암 연구 및 건강의 이탈리아 정부에 대한 이탈리아 협회에서 교부금에 의해 지원됩니다. MS의 작업은 FIRC 친교에 의해 지원되었다.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 최근 ChroP, 염색질의 단백질 성분의 대규모 특성화 양적 전략을 설명 하였다. ChroP는 성적인 분야에서 사용되는 두 개의 보완적인 접근 방식, 칩과 MS, 자신의 강점에서 이익과 각각의 한계를 극복을 결합한다. 깊은 시퀀싱 (칩 - 시퀀서)에 결합 된 칩은 몇 가지 뉴 클레오 솜 (35)의 해상도에서 히스톤 수정의 게놈 전체의 매핑을 할 수 있습니다. 자신의 감성에 유리하지만, 항체 기반의 분석은 유사한 수정을 구분하기 위해 자신의 능력과 히스톤 코드 (36)의 조합 측면을 해부 제한됩니다. MS가 hPTMs, 단독 및 조합으로 15에서의 종합적이고 공정한 분석을 제공하면서 한편, 지금까지의 궤적 특정 PTMS 재잘 정보의 필연적 부족 벌크 염색질의 분석에 적용되었다. 우리는 기능적으로 분리 칩의 수정 된 버전을 사용히스톤 PTM 패턴 및 비​​ histonic 단백질의 특성을 구별 염색질 도메인 및 질량 분석은 특히 공동 충실. <p class=...

염색질은 모든 DNA가 중재 프로세스에 대한 기본 템플릿으로 관여하는 매우 역동적 인 핵 단백질 복합체이다. 뉴 클레오 솜은 염색질의 기본 반복 단위이며, DNA의 147 BP는 1, 2를 포장하는 주위에 각 표준 히스톤 H2A, H2B, H3 및 H4, 두 분자를 포함하는 단백질 octameric 코어로 구성되어 있습니다. 모든 핵심 히스톤은 구형 도메인과 뉴 클레오 외부에 돌출 유연한 N-말단 &quot;꼬리&quot;로 구성되어있다. 염색질 구조와 역학을 조절하기위한 중요한 메커니즘 중 하나는 주로 3,4 히스톤의 N-말단에 공유 결합이 발생 번역 후 변형 (PTMS)에 기초한다. 히스톤 변형이 히스톤-DNA 사이 또는 뉴 클레오 간의 접점을 변경함으로써, 고차 염색질 구조를 변경하고, 따라서 DNA 결합 단백질 (시스 메카니즘)의 액세스 가능성을 제어함으로써 어느 작동하거나 dockin 역할을하여규제 단백질, 하나 하나의 단위 또는 다중 체 복합체에 포함 된 같은 G 사이트. 이러한 조절 단백질이 다른 방법으로 그 기능을 발휘할 수있다 : 직접 유전자 발현 (즉, TAF 단백질)을 변조하여, 또는 뉴 클레오 솜 위치 (즉, 염색질 단지를 리모델링)을 변경하거나 다른 히스톤의 잔류 물 (메틸 트랜스퍼 나있는, 즉 단백질의 아세틸을 수정하여 전이 활성) (트랜스 메커니즘) 5. 특정 염색질의 유전자 좌에서 별개의 PTM 패턴 클러스터는 별개의 사이트에서 다른 수정이 기본이되는 DNA의 기능 상태를 중재하는 분자 코드를 생성하는 시너지 효과를 수 있다는 가설의 고심을 주도하는 관찰. &quot;히스톤 코드의 가설은&quot;몇 년 동안 큰 공감대를 얻고있다하지만 실험적인 검증은 기술적 인 한계 6,7에 의해 다시 개최되었습니다. 질량 분석 (MS) 기반 프로테오믹스는로 떠오르고있다강력한 도구 히스톤 변형 패턴을 매핑하고, 염색질 결합 단백질 8의 특징을. MS는 펩티드의 이론 및 실험 질량 사이의 특정 Δmass로 변경을 감지합니다. 개별 히스톤의 수준에서, MS는 그 9-14 사이에서 새로운 수정과 계시 interplays의 검출을 허용, PTMS를 매핑하는 공정한하고 포괄적 인 방법을 제공한다. 최근, 전략의 숫자는 그대로 유사 분열 염색체 15, 수용성 hPTM 결합 단백질 16-18의 식별과 특정한 염색질 영역의 분리 및 분석의 특성을 포함하여 염색질의 프로테오믹스 조성물을 해부 개발되었다 (즉 말단 소립) 19, 20. 그러나, 히스톤 PTMS, 변형, 염색질 관련 단백질의 궤적 별 시너지 효과의 조사는 아직 불완전하다. 여기, 우리는 (ChroP라는 새로운 접근 방식을 설명우리는 효율적으로 기능 별개의 염색질 도메인의 특성을 개발하는 것이 색도 MATIN의 P의 roteomics) 21. 이 방법은 풍부한 샘플의 효율적인 MS 기반 단백체 분석을위한 크로 마틴 면역 침전 (칩), 후생 유전 학적 연구에 사용되는 잘 확립 된 프로토콜을 적응시킨다. 우리는 입력 및 MS에 의해 어드레싱 된 질문으로서 사용 염색질의 종류에 따라 두 가지 프로토콜을 개발 하였다; 특히 : MNase로 소화 고정되지 않은 기본 염색질의 1) 칩 모노 뉴 클레오을 정화하고 공동 연관 hPTMs (N-ChroP)를 해부하기 위해 사용된다; 2) 초음파에 의해 조각난 가교 염색질의 칩은 단백질 (X-ChroP)를 결합 모든 공동 농축 염색질의 특성을 SILAC 기반 interactomics 전략과 함께 사용됩니다. 우리는 여기에 면역 침전 단계에 대한 미끼로 H3K9me3를 사용하여, 이질 염색질을 풍부하게 공부에 대한 N-및 X-ChroP의 조합을 보여줍니다. ChroP의 사용은 연장 될 수있다따라서 후성 유전학의 다양한 응용 프로그램에 방법을 포장, 별개의 염색질에 지역, 또는 다른 기능 상태로 전환하는 동안 같은 지역 내에서 염색질 구성의 변화 중 하나를 공부합니다.

<table><tbody><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>BE12-614F</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>SILAC DMEM</td><td>M-Medical</td><td>FA30E15086</td><td></td></tr><tr><td>투석 FBS</td><td>Invitrogen</td><td>26400-044</td><td></td></tr><tr><td>Lysine 0 (12C6 14N2 L-lysine)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L8662</td><td></td></tr><tr><td>Arginine 0 (12C6 14N4 L-arginine)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6969</td><td></td></tr><tr><td>라이신 8 (13C6 15N2 L-라이신)</td><td>시그마 알드리치</td><td>68041</td><td></td></tr><tr><td>아르기닌 10 (13C6 15N4 L-아르기닌)</td><td>시그마 알드리치</td><td>608033</td><td></td></tr><tr><td>소세포 뉴클레아제</td><td>Roche</td><td>10 107 921 001</td><td></td></tr><tr><td>완전한, EDTA 무함유 프로테아제 억제제 칵테일 정제</td><td>Roche</td><td>04 693 132 001</td><td></td></tr><tr><td>Spectra/Por 3 투석 튜브, 3.5K MWCO, 18mm 평면 너비, 50피트 길이</td><td>Spectrumlabs</td><td>132720</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 정제 키트</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Histone H3 tri-methylated K9-ChIP grade</td><td>Abcam</td><td>ab8898</td><td></td></tr><tr><td>Histone H3 peptide tri-methyl K9&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab1773</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Invitrogen</td><td>100.04D</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4-12%&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 비스-트리스 젤&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>NP0335BOX</td><td></td></tr><tr><td>콜로이드 블루 염색 키트</td><td>Invitrogen</td><td>LC6025</td><td></td></tr><tr><td>LDS 샘플 버퍼</td><td>Invitrogen</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>Formaldheyde</td><td>시그마 Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Aceti 무수물 -d6</td><td>시그마 Aldrich</td><td>175641-1G</td><td></td></tr><tr><td colspan = "4"> [헤더]</td></tr> <tr><td>포름산</td><td>시그마 알드리치</td><td>94318-50ML-F</td><td></td></tr><tr><td>요오드 아세트아미드 &ge; 99% (HPLC), 결정질</td><td>시그마 Aldrich</td><td>I6125</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>시그마 Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>시퀀싱 등급 수정 트립신, 냉동 100 &mu; g (5 &times; 20 &mu; g)</td> <td>Promega</td><td>V5113</td><td></td></tr><tr><td>나노 스프레이 OD 360&mu; m x ID 75&mu; m, 팁 ID 8 &mu; m 코팅되지 않은 Pk 5</td><td>마이크로컬럼 Srl</td><td>FS360-75-8-N-5-C15</td><td></td></tr><tr><td>ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 &마이크로; 엠&nbsp; &nbsp; 15% C</td><td>Dr. Maisch GmbH</td><td>r13.aq.</td><td></td></tr><tr><td>탄소 추출 디스크, 47mm</td><td>Agilent Technologies</td><td>12145040</td><td></td></tr><tr><td>양이온 추출 디스크</td><td>Agilent Technologies</td><td>66889-U</td><td></td></tr></tbody></table>

chrop 접근은 염색질의 궤적 특정 프로테오믹스 풍경을 해부하는 칩 및 질량 분석을 결합

The ChroP Approach Combines ChIP and Mass Spectrometry to Dissect Locus-specific Proteomic Landscapes of Chromatin

염색질은 다양한 DNA에 의존하는 프로세스를 제어하는​​ DNA와 단백질로 이루어진 매우 역동적 인 핵 단백질 복합체이다. 특정 지역에서 염색질의 구조와 기능은 전사 인자 및 DNA 메틸화를 포함 히스톤 번역 후 변형 (hPTMs) 및 변종, 크로 마틴 결합 단백질의 지역 농축에 의해 조절된다. 서로 다른 기능 영역에서 크로 마틴 조성물의 프로테오믹스 특성은 지금까지 질량 분석 (MS)에 의해 후속 심층 분석에 적합한 순도와 양에 같은 도메인을 풍부하게하는 효율적인 프로토콜의 부족에 의해 방해되었다. 우리는 여기에 예비 크로 마틴 면역이 그 기능 hPTMs의 측면에서, 변종 공동 관련된 비 histonic 단백질 별개의 염색질 영역을 분리하는 데 사용된다 ChroP (색도 MATIN의 P의 roteomics)라는 이름의 새롭게 디자인 된 염색질 단백질 체학 전략을, 설명 MS에 의해 분석 하였다. 우리는 그가를 설명히스톤 H3상의 라이신 9의 트라이 메틸화의 존재에 의해 표시 전사적으로 침묵 염색질 영역의 농축 및 분석을위한 ChroP의 설정까지 재. 달성 된 결과는 완전히 이질 염색질 프로테옴의 특징과 염색질의 고유 한 단백질 결정의 상호 작용 및 현장 별 구조 및 기능 구성을 설정하는 시너지 효과 방법을 이해하기위한 강력한 분석 전략으로 그것을 증명에 ChroP의 가능성을 보여줍니다.

크로 마틴 면역 게놈 따라 단백질이나 히스톤 변형의 현지화를 프로파일 링하는 데 사용하는 강력한 기술이다. 프로테오믹스 동등한에서, 칩, 관심의 수정이나 단백질과 함께 면역 침강 &quot;미끼&quot;로 사용되는 정 성적 및 정량적으로 hPTMs, 히스톤 변형 및 염색질 결합 단백질을 식별하는 MS 기반 프로테오믹스옵니다. N-ChroP 접근 방식에서, 염색질이 MNase (그림 1B)로 분해되는 그림 1A, 기본 칩에 설명 된, 별개의 기능 도메인을 염색질 대량의 정화 입력으로 사용됩니다. 모노 뉴 클레오 풍부한 소화 염색질은 특정 항체와 함께 배양하고 immunopurified 단백질은 SDS-PAGE에 의해 분리된다. 예시 된 예에서, H3K9me3, 침묵 염색질 (32, 33)의 마커는 방법을 설정하는 데 사용됩니다. 선택은 사실에 근거 것과 모두 기능적 역할그 단백질 인터랙의 일부가 잘 설명되어 있습니다뿐만 아니라. 또한 본래의 뉴 클...

기본 결합 및 고해상도 질량 분석과 크로 마틴 면역 가교으로 ChroP 접근 방식은 히스톤 수정, 변형 및 기능적으로 구별 염색질 영역에서 시너지 효과가 아닌 histonic 단백질의 복합 단백체 구조를 해부 할 수 있습니다.

ChroP 접근은 염색질의 궤적 특정 프로테오믹스 풍경을 해부하는 칩 및 질량 분석을 결합

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and ...

본 절차의 전반적인 목표는 기능적으로 구별되는 염색질 도메인의 단백질 구성 성분을 분석하여, 다양한 요소들이 어떻게 상호작용하여 전사 상태를 결정하는지 이해하는 것입니다. 이를 위해 먼저 배양된 세포로부터 핵을 준비하고, 효소적 또는 기계적 방법을 통해 염색질을 최적의 길이의 조각으로 분해합니다. 두 번째 단계는 히스톤 번역 후 조절 또는 관심 영역을 특이적으로 표시하는 것으로 알려진 단백질에 대한 미끼 항체를 이용한 면역침강법을 통해, 전체 염색질로부터 특정 기능적 도메인을 정제하는 것입니다.다음으로, 면역 정제된 크로마틴 단백질을 SDS page로 분리하고 질량 분석 전 인겔(in-gel) 소화를 진행합니다. 다음 단계는 고해상도 분석 기기를 이용한 액체 크로마토그래피 질량 분석입니다. 최종적으로, 질량 분석 로데이터(raw data)를 전용 소프트웨어로 분석한 후, 스펙트럼을 수동으로 검토하여 히스톤 수정 및 공동 농축 단백질을 식별하고 정량화합니다. 이는 입력 시료 대비 면역 침전물 내의 상대적 풍부도 계산 또는 가용성 펩타이드를 경쟁자로 사용한 SLAC 비율 및 경쟁 실험을 기반으로 각각 수행됩니다. 이를 통해 히스톤 수정 패턴의 상호작용과 변이, 그리고 특정 크로마틴 영역과 그로 인해 보충된 핵 상호작용 인자들 사이의 관계에 대한 통찰을 얻을 수 있으며, 이 모든 요소는 조화롭게 작용합니다.유전자 발현에 조절 효과를 갖는 특정 염색질 경관(chromatin landscape)을 정의함에 있어, Crop 방식이 풀다운(pull down)과 같이 가용성 상호작용 인자나 히스톤 수식에 기반한 기존의 in vitro 스크리닝 방법보다 갖는 주요 장점은 다음과 같습니다. 히스톤 펩타이드 또는 재구성된 염색질 템플릿을 사용함으로써, 보다 천연에 가깝고 인위적이지 않은 조건에서 로커스 특이적(locus specific) 염색질 조성을 조사할 수 있다는 점입니다. Crop의 적용은 다른 모델 시스템이나 시간 의존적 연구로도 확장될 수 있습니다.예를 들어, 전역적 전사 반응을 유도하는 특정 섭동에 반응하는 세포주에 crop을 사용할 수 있습니다. 이 절차는 Monica Sodi가 시연하겠습니다. N chip 절차를 위한 핵은 라벨링되지 않은 상태로 준비됩니다.He A S3 세포는 실험당 1~2×10⁸개의 세포를 사용합니다. 세포를 수확하려면 50mL 튜브에 5×10⁷개의 세포가 들어있는 분注액 4개를 만들고, 4°C

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Research

연구

JoVE Journal

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생물학

이점 엔드 태그 장면 (ChIA-PET)에 의한 염색질 상호 작용 분석을위한...

염색질 상호 작용을 매핑 및 전사 규정을 이해하는 데 이점 엔드 태그 장면 (ChIA-PET)과 염색질의 상호 작용 분석

질량 분광법의 발전은 조직의 호스트에 단백질 표현 및 수정의 높은 처리량 분석을 허용하고 있습니다. subcellular 분류 및 질병 모델, 분광 및 생물 정보학은 생물 시스템에 새로운 속성을 표시 할 수 있습니다 양적 질량과 결합. 여기에 설명 된 방법은 심장 질환의 설정에 염색질 - 관련 단백질을 분석하고 다른 사람에게 쉽게 적용 할 수...

질병의 염색질 Proteomes의 정량 분석

관심 있는 특정 게놈 영역과 관련된 분자의 식별은 이러한 영역의 기능 조절 메커니즘을 이해하는 데 필요합니다. 이 프로토콜은 특정 게놈 영역과 관련된 단백질 및 RNA를 식별하기 위해 엔지니어링된 DNA 결합 분자 매개 염색질 면역침전(enChIP)을 수행하는 절차를 설명합니다.

특정 게놈 지역과 enChIP으로 관련 분자의 식별의 분리

여기, 우리는 최적화 된 높은 처리량 칩 시퀀싱 프로토콜 및 냉동된 종양 조직 및 세포에서 게놈 넓은 chromatin 상태 패턴의 결정에 대 한 전산 분석 파이프라인을 설명합니다.

종양 조직에 높은 처리량 칩 시퀀스를 사용 하 여 Chromatin의 게놈 넓은 매핑 위한 통합된 플랫폼

이것은 후속 proteomic 분석에 대 한 가교 된 chromatin의 순서 특정 캡처에 의존 하는 특정 대상 loci에 새로운 상호 작용 하는 DNA 단백질을 식별 하는 방법. 잠재적인 바인딩 단백질도 세포 수정에 대 한 사전 지식이 요구 된다. 처음에 효 모에 대 한 개발, 기술은 지금 되었습니다 포유류 세포에 대 한 적응.

교 잡의 적응 포유류 세포 단백질 Chromatin 관련 단백질의 캡처

탠덤 chromatin 위한 단계별 프로토콜 설명 immunoprecipitation 시퀀싱 (tChIP-Seq) 셀 형식 관련 게놈 넓은 히스톤 수정의 분석을 가능 하 게.

TChIP-Seq: 셀 형식 관련 Epigenome 프로 파일링

CUT&amp;RUN 및 그 변이체는 크로마틴에 대한 단백질 점유율을 결정하는 데 사용될 수 있다. 이 프로토콜은 단일 세포 uliCUT&amp;RUN을 사용하여 크로마틴에 대한 단백질 국소화를 결정하는 방법을 설명합니다.

표적 하에서 초저 입력 절단을 이용한 크로마틴에 대한 단일 세포 인자 국소화 및 뉴클레아제를 이용한 방출

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밀집된 핵 환경에서 크로마틴 연구를 위한 다중 표지 단일 분자 위치 현미경 프로토콜

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ChroP 접근은 염색질의 궤적 특정 프로테오믹스 풍경을 해부하는 칩 및 질량 분석을 결합

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