ChroP 접근은 염색질의 궤적 특정 프로테오믹스 풍경을 해부하는 칩 및 질량 분석을 결합

이 절차의 전반적인 목표는 서로 다른 원소가 전사 상태를 결정하기 위해 어떻게 시너지 효과를 내는지 이해하기 위해 기능적으로 구별되는 염색질 도메인의 단백질체 구성을 특성화하는 것입니다. 8. 이는 먼저 배양된 세포에서 핵을 준비하고 효소 또는 기계적 수단을 통해 염색질을 최적의 길이의 단편으로 소화함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 히스톤 번역 후 변형 또는 관심 영역을 특이적으로 표시하는 것으로 알려진 단백질에 대한 미끼 항체를 사용하여 면역침전을 통해 벌크 염색질에서 뚜렷한 기능 도메인을 정제

다음으로, 면역 정제된 염색질 단백질은 SDS 페이지와 질량 분석 전에 분해된 잉겔로 분리됩니다. 다음 단계는 고분해능 기기에서 액체 크로마토그래피 질량 분석법을 분석하는 것입니다. 궁극적으로, 질량 분석법 원시 데이터는 임시 소프트웨어에 의해 분석된 후 스펙트럼을 수동으로 검사하여 히스톤 변형 및 코엔 농축 단백질을 각각 식별하고 정량화합니다. 입력 대비 면역 침전 물질의 상대적 풍부도 계산 또는 SLAC 비율 및 미끼에 대한 경쟁자로 가용성 펩타이드를 사용하는 경쟁 실험을 통해 작물을 통해, 우리는 Histo Modification pattern과 variance 사이의 상호 작용에 대한 통찰력을 얻을 수 있으며 특정 염색질 영역과 그에 의해 모집된 핵 interac에 도달할 수 있으며, 이 모든 것이 조화로운 방식으로 작용합니다.

유전자 발현에 대한 조절 효과가 있는 특정 염색질 지형을 정의하기 위해, 용해성 상호 작용 또는 히스토 변형에 대한 시험관 내 스크리닝을 기반으로 하는 기존 방법에 비해 작물의 주요 이점, 예를 들어 엉덩이 풀다운. 히스톤 펩타이드 또는 재구성된 염색질 주형을 사용하면 보다 자연스럽고 덜 인공적인 조건에서 유전자좌 특이적 염색질 구성을 조사할 수 있습니다. 작물의 적용은 다른 모델 시스템 또는 시간 종속 연구로 확장될 수도 있습니다.

예를 들어, 특정 섭동에 반응하는 세포주에서 crop을 사용하여 전체 전사 반응을 유도할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 Monica Sodi입니다. 제 연구실의 박사후 연구원인 N chip 절차를 위한 Nuclei는 비라벨링에서 준비됩니다.

He: A: S3 세포는 실험당 1-2배, 10-8번째 세포를 사용합니다. 세포를 채취하려면 50 밀리리터 튜브에 있는 7개의 세포에 5 곱하기 10의 분취액 4개를 만들고 섭씨 4도에서 10분 동안 340배 G로 원심분리합니다. 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 세척하고 상층액을 버리고 소생시킵니다.

각 세포 펠릿을 8ml에 현탁시키고, 용해하고, 완충액을 15ml의 튜브로 옮깁니다. 섭씨 4도에서 회전하는 바퀴에서 10분 동안 배양합니다. 다음으로, 각 세포 용해물을 자당 쿠션에 조심스럽게 붓고 4°C에서 20분 동안 섭씨 3, 270배 G의 스윙 아웃 로터에 넣어 세포질에서 핵을 분리합니다.

상층액을 버리고 nu 핵 펠릿을 얼음으로 두 번 씻습니다. 두 번째 세탁시 차가운 PBS. 두 번째 세척에서 상등액을 버린 후 하나의 50ml 튜브에 핵을 모읍니다.

핵 펠릿을 1ml의 소화 완충액에 재현탁합니다. 각 샘플을 500마이크로리터의 분취액 2개로 나누고 얼음에 보관합니다. 각 부분 표본에 핵 마이크로리터당 0.005 단위의 효소 0.005 단위에 해당하는 5마이크로리터의 MNA를 추가합니다.

부드럽게 섞어 섭씨 37도에서 60분 동안 배양합니다. 1 밀리몰 EDTA를 첨가하여 반응을 멈추고 얼음 위에 보관하십시오. 분해된 핵을 7, 800배 G에서 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리하여 펠렛

상등액을 두 개의 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 보관합니다. 이것은 단핵자 영역을 포함하는 염색질의 첫 번째 용해성 분획을 포함하는 S 단일 분획으로, 1 밀리리터의 투석에 펠릿을 조심스럽게 재현 탁탁 한 다음 날, 3 리터의 투석 완충액에서 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 투석하고 투석합니다. 투석된 물질과 원심분리기를 7, 800회 G에서 섭씨 4도에서 10분 동안 수집합니다.

슈퍼 나틴을 새 einor 튜브로 옮깁니다. 이것은 S 두 분획으로, Ma a의 소화 정도에 따라 tta 뉴클레오솜으로 염색됩니다. 면역침전 전에 섭씨 4도에서 보관하십시오.

이 예에서 묘사된 바와 같이 aros gel 전기영동 및 뉴클레오솜 사다리의 육안 검사를 통해 MN a의 분해 품질 및 결핍을 확인하며, fraction S 1은 단핵 영역에서 매우 농축되어 있는 반면 fraction S 2는 주로 염색질 면역침전을 위한 뉴클레오솜을 함유하고 있습니다. 먼저 칩 희석 버퍼 1 부피를 분수 S 1에 추가합니다. 그런 다음 히스톤 번역 후 변형 또는 관심 단백질에 대한 항체를 추가하고 다음 날 섭씨 4도의 회전 바퀴에서 밤새 배양합니다.

단백질 G 결합 마그네틱 비드를 사용하여 염색질을 분리합니다. S 1 염색질 샘플에 100마이크로리터의 차단된 비드를 추가하고 섭씨 4도의 회전 휠에서 3시간 동안 배양합니다. 3시간 후.

340배 G에서 1분 동안 원심분리기. einor 튜브를 마그네틱 랙에 넣어 비드를 펠릿으로 만듭니다. 결합되지 않은 뉴클레오솜을 포함하는 흐름인 상등액을 저장합니다.

비드에 세척 버퍼를 추가하고 원심분리 전에 회전 휠에서 섭씨 4도에서 5분 동안 배양합니다. 이런 식으로 소금 농도를 높이면서 비드를 총 4 번 씻으십시오. 75 밀리몰의 염화나트륨으로 두 번 세척한 후 125 밀리몰로 한 번 세척하고 175 밀리몰의 염화나트륨으로 한 번 세척하여 용리시킵니다.

아미노는 염색질을 침전시켰다. 50 millimolar dihi가 보충된 30 마이크로리터의 LDS 샘플 버퍼에서 비드를 배양합니다. 섭씨 70도에서 5분 동안 3에톨.

암시된 단백질은 SDS 페이지에 의해 연속적으로 분리되어 이 절차를 시작하고 세포를 포름알데히드로 가교시킵니다. SLAC 표지 세포에 0.75%포름알데히드를 추가합니다. 짧게 섞어 실온에서 10분 동안 배양합니다.

125 밀리몰 글리신을 첨가하여 포름알데히드를 가리키고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 다음으로, 세포를 분취량당 7개의 세포에 대해 약 5배의 10을 곱한 2-4개의 분취량으로 나눕니다. 마지막 세척 후 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 세 번 헹굽니다.

상등액을 버리고 펠릿을 10ml의 용해 완충액에 각 세포 펠릿을 재현탁탁합니다. 섭씨 4도에서 430배 G의 회전 원심분리기로 10분 동안 배양하고 섭씨 4도에서 5분 동안 배양합니다. 상등액을 버리고 핵 펠릿을 보관하십시오.

세척 완충액 Resus로 핵 펠릿을 세척한 후 각 핵 펠릿을 3ml의 칩 배양 완충액에 현탁시키고 얼음에 보관하여 200와트의 냉각된 바이오 파열에서 염색질 초음파 처리를 단편화합니다. 초음파 염색질 2%를 제거하고 최소 1시간 동안 섭씨 65도에서 배양하여 가교를 역전시킵니다. 칩 배양 완충액에서.

이것이 입력 자료입니다. 그 후, PCR 정제 키트를 사용하여 DNA를 추출하고 가교 염색질을 면역 침전시키기 위해 aros gel electropheresis에 의해 염색질 단편화를 평가합니다. 선택한 항체를 light 및 heavy 표지된 초음파 처리된 염색질에 추가합니다.

광 채널에서 경량 샘플과 무거운 샘플의 항체 분취 성분 외에 용해성 펩타이드의 과도한 폴드를 각각 3개의 마이크로 원심분리 튜브에 추가하고 다음 날 회전 휠에서 섭씨 4도에서 밤새 배양하고, 각 염색질 샘플에 100마이크로리터의 차단된 단백질 G 결합 마그네틱 비드를 추가하고 섭씨 4도에서 3시간 동안 회전 휠에서 배양합니다. 340배 G에서 1분 동안 원심분리기. einor 튜브를 마그네틱 랙에 넣어 비드를 펠릿으로 만듭니다.

상등액은 결합되지 않은 뉴클레오솜을 포함하는 흐름으로, 후속 제어를 위해 저장됩니다. 소금 농도를 증가시키는 세척 버퍼에서 비드를 4번 세척합니다. 150 밀리몰 염화나트륨으로 두 번 세척한 후 300 밀리몰 염화나트륨으로 두 번 세척합니다.

비드를 섭씨 95도에서 25분, SDS 30마이크로리터에서 30분 동안 배양합니다. 시료 완충액을 로딩하여 면역 침전된 단백질을 용출 및 교차 연결합니다. 마지막으로, 질량 분석 전에 EIT를 풀링하고 SDS 페이지별로 단백질을 분리합니다.

NIP에서 농축된 히스톤은 이 절차를 시작하기 위해 소화됩니다. 4 개에서 12 % BIS CITRIS 아크릴 아미드 구배 겔로 염색 된 콜로이드 쿠마시의 코어 히스톤 밴드에 해당하는 겔 슬라이스를 잘라낸 다음 50 % 아세틸 니트릴로 염색하고 탈이온화 된 증류수를 100 % 아세토 니트릴과 교대로 염색하여 겔 조각이 완전히 얼룩이 질 때 겔을 수축시킵니다. 진공 원심 분리기에서 말리십시오.

D 6 아세트산 무수물을 1 몰 중탄산 암모늄과 3 마이크로 리터의 아세트산 나트륨에 부피 당 1-9 부피를 겔 조각에 촉매로 첨가합니다. 섭씨 37도에서 3시간 동안 강하게 흔들어 배양합니다. 젤 조각을 100%acetyl 니트릴에 있는 긴축하고 그 후에 진공 분리기에서 대략 5 분 동안 그(것)들을 탈수하십시오, 다음으로 얼음 감기로 젤 조각을 다시 수화하십시오.

섭씨 37도에서 하룻밤 동안 50 밀리 몰 중탄산 암모늄에 마이크로 리터 당 100 나노 그램의 tryin 용액. deuterated, 아세트산 무수물 및 trypsin 소화를 사용하여 lysines의 화학 수정의 조합은 히스톤의 젤 소화 패턴에서와 같이 RC를 생성하고 새로운 einor 튜브에서 용해성 소화 펩티드를 수집하고 약 1 시간 동안 펩티드를 건조시킵니다. 동결건조된 펩타이드를 0.5%아세트산, 0.1%Tri Fluor, 아세트산, 탈염 및 농축 펩타이드를 역방향 C상 18 탄소 샌드위치에 재현탁하고 수제 마이크로 컬럼에 이온 교환 크로마토그래피를 사용합니다.

C 18 탄소 샌드위치 스테이지 팁에 펩타이드 50%를 로드하고 SCX 스테이지 팁에 50%를 로드합니다.5% 수산화암모늄, 30% 메탄올을 사용하는 SCX 팁과 80% 아세토 니트릴, 0.5% 아세트산을 사용하는 C 18 탄소 팁에서 펩타이드를 용리합니다. 마지막으로, 동결건조, 회피된 펩타이드 및 res는 네이티브 염색질 면역침전 및 작물 접근법에서 0.1% 포름산에 현탁시킵니다. 크로마틴은 벌크 크로마틴과 구별되는 기능적 도메인을 정제하기 위한 첫 번째 단계로 MNA로 분해됩니다.

왼쪽 패널은 서로 다른 시간 경과에서 MNA로 염색질 분해 후 1% aros gel에서 DNA가 분해되는 소규모 MNA 테스트를 보여줍니다. 대규모 MNA 분해가 오른쪽에 표시됩니다. DNA는 MNA 염색질 분해 60분 후 1% aros 겔에서 분해되고 S 단핵 영역을 포함하는 1개 분획과 S에서 폴리 뉴클레오솜을 포함하는 2개 분획을 분리한 후 분해됩니다.

분해된 염색질과 모노 뉴클레오솜이 풍부한 염색질은 특정 히손 번역 후 변형을 인식하는 항체와 함께 배양됩니다. 예를 들어, 히스톤 H 3 K nine ME 3 에 lysine nine의 trimethylation, 침묵 염색질의 마커. 면역 정제 단백질과 염색질 입력은 SDS 페이지와 콜로이드 kumasi 염색에 의해 분리되며, 코어 히스톤 H 3, H 4, H 2 A 및 H 2 B 주위 및 그 이하의 17 킬로달톤 밴드 주위 및 아래를 보여주며, H 3 및 H 2 B co는 플로우 스루 및 입력에 존재하는 H 3 에 trimm 메틸화 글리신 9의 양 사이의 비교를 나타냅니다. 관심 영역은 면역 정제되며, 염색질의 작은 하위 집단의 농축으로 인한 편향의 위험을 제외합니다.

이 히스토그램은 각 변형 질량 분석법에 대한 3개의 독립적인 실험에서 얻은 평균 플러스 - SEM을 나타내며, 그런 다음 MS를 사용하여 농축된 뉴클레오솜 내에서 연관된 번역 후 변형 co를 특성화합니다. 모든 히스톤 번역 후 변형은 CID 단편화를 사용하여 이 대표적인 Ms m Ms 스펙트럼에서 해당 ms ms 스펙트럼의 수동 검사에 의해 검증됩니다. B 이온 및 Y 이온 시리즈는 H 3 9 - 17 펩타이드의 염기서열을 정의할 수 있으며, 먼저 질량 전하 값을 기반으로 모든 변형된 펩타이드에 해당하는 각각에 대해 추출된 이온 크로마토그램 또는 XIC를 구성하고 각 피크에 대한 곡선 아래 면적 또는 UC를 계산하여 라이신 9 잔기 라벨이 없는 트리메틸화의 국소화를 달성할

다음으로, H 3 9 내지 17 펩티드에서 라이신 9에 대한 메틸화의 상이한 정도의 상대적 풍부함은 각 변형 펩티드의 A UC를 해당 펩타이드의 관찰된 모든 변형되지 않고 변형된 형태에 해당하는 면적의 합으로 나누어 추정됩니다. 셋째, chipped 물질에서 각 변형의 상대적 농축은 입력에 대한 chipped peptide의 각 메틸화의 상대적 풍부도 사이의 log 2 비율로 표현됩니다. H 3 9 내지 17 펩티드의 분석은 비변형 및 모노메틸 형태의 고갈과 함께 D 및 TRIMM 메틸화 라이신 9의 농축을 보여줍니다.

이러한 결과를 항체 특이성에 대한 양성 대조군으로 사용하면 다른 모든 변형의 cos association 또는 depletion을 동일한 H 3의 분자 내 수준과 동일한 뉴클레오솜 내의 다른 coen 농축 히스톤의 분자간 수준에서 평가할 수 있습니다. 이 대표적인 히트 맵은 히스톤 H 3, H 4 및 H 2 A에서 확인 된 H ptms를 연관시키는 모든 cos의 농축을 요약합니다. 각 행은 다른 변형에 해당하며 ND는 모든 단백질을 스크리닝하기 위해 검출되지 않은 변형을 나타냅니다. 초음파 처리에 의해 단편화 된 가교 염색질의 이종 염색질 칩 내에서 Co associationating은 세포 배양 또는 lac에서 아미노산에 의한 안정 동위 원소 표지와 함께 사용됩니다.

먼저, 중성 라이신과 중성 아르기닌이 단백질에 혼입되는 정도를 계산하여 표지 효율을 평가합니다. 정확한 단백질 정량화를 위해서는 여기에서 관찰된 바와 같이 두 중아미노산 모두에 대해 95%보다 우수한 통합이 필요하며, 라이신 및 아르기닌 펩타이드 밀도 분포의 중앙값은 각각 0.974 및 0.964입니다. 둘째, 수용성 펩타이드와 항체의 비율을 최적화해야 합니다.

이 그림은 입력 및 chipped octr의 가볍고 무거운 형태 모두에 대해 H 3 9 to 17 펩타이드에서 2 플러스 전하 trimm 메틸화 라이신 9 K 9 ME 3의 해당 질량 전하 값에서 확대 된 질량 스펙트럼을 보여줍니다. 입력하는 동안 무거운 펩타이드와 가벼운 펩타이드의 강도는 순방향 SLAC 칩의 강도에 가깝습니다. 가벼운 펩타이드의 강도는 무거운 펩타이드의 강도보다 훨씬 낮기 때문에 효율적인 경쟁을 나타냅니다.

가벼운 L 및 무거운 H 표지된 염색질 입력 및 co amino 침전된 물질 칩의 SDS 페이지의 대표적인 결과가 여기에 나와 있습니다. 부서진 재료에 해당하는 레인은 10개의 슬라이스로 절단되었으며 2개의 입력 슬라이스만 분석되었습니다. 혼입 테스트 분석을 위해 slac 경쟁 실험은 일반적으로 과잉 용해성 펩타이드와의 경쟁이 무거운 H에서 가벼운 L 염색질 샘플로 전환되는 소위 순방향 및 역방향 형식으로 중복으로 수행됩니다.

이 대표적인 전체 스펙트럼은 HP 1 및 매크로 2 A 단백질의 펩타이드에 해당하는 SLAC 쌍을 보여주며, 1보다 큰 무거운 단백질과 가벼운 단백질의 비율을 보여줍니다. 역 복제에서 1 미만의 비율로 미러링된 순방향 실험에서, 무거운 형태와 가벼운 형태의 강도가 순방향 및 역방향 실험 모두에서 유사한 이종 염색질 단백질에서 이러한 단백질의 특이적 농축을 입증하고 1에 가까운 일정한 비율을 생성하고 배경으로 분류됩니다. 정방향 및 역방향 X chipp 실험의 교차점은 두 실험 모두에 존재하는 635개의 단백질을 식별하고 최소 두 개의 비율 수로 정량화합니다.

무거운 것과 가벼운 비율의 로그 2 플롯은 소위 이종 염색체를 나타냅니다. 이 산점도의 빨간색 점선은 단백질 비율의 상위 40% 및 30%를 나타냅니다. 표시된 바와 같이, 진정한 trimm 메틸화 lysine nine 인터랙터는 단백질 비율 분포의 상위 40% 내에 존재하는 단백질로 명확하게 식별됩니다.

여기에서 입력 정방향 및 역방향 X 작물 실험의 단백질 비율 분포는 각각 검은색, 파란색 및 주황색으로 표시됩니다. 이 동영상을 시청한 후에는 질량 분석 전에 mono precipitated proteins를 처리하기 위해 E 및 말단 작물에 대한 염색질을 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 질량 스펙트럼에서 히스턴 변형을 식별하고 정량화하는 방법과 단백질 비율에 대한 특정 interac을 정의하는 방법.