카파 (Vκ)에 대한 항체 결합 특이성 빛 체인 함유 인간 (IgM의) 항체 : Polysialic 산 (PSA) 사례 연구로 NCAM에 첨부

이 절차의 전반적인 목표는 IgM isotype에 중점을 두고 치료 가능성이 있는 항체의 항원을 식별하는 것입니다. 이 방법은 생물 의학 분야의 지식 격차를 메우고 암 연구 및 중추 신경계 질환을 위한 새로운 바이오마커 및 면역 치료제를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 큰 치료 잠재력을 가진 무시된 종류의 항체에 대한 문을 열어준다는 것입니다.

이 기술의 의미는 항체 기반 치료제에 의해 표적이 될 수 있는 모든 질병의 진단 및 치료로 확장됩니다. 이 문제는 IgM 항체의 항원과 성장하는 조직 및 하위 배양에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 모든 종의 다른 항체 동형에 골칫거리가 될 수 있습니다.

저는 다양한 생화학적 응용 분야에서 IgM 항체의 특이적이고 두드러진 결합을 깨달았을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 로버트 카후드(Robert Kahoud)와 옌스 바츨라윅(Jens Watzlawik)입니다. 이 절차를 시작하려면 귀 높이에서 앞쪽으로 두개골을 자르고 두개골을 벗겨냅니다.

그런 다음 뇌를 15ml 튜브에 부드럽게 넣고 즉시 드라이아이스에 보관한다. 5분 후, 뇌를 깨끗한 계량지에 옮기고 깨끗한 면도날을 사용하여 소뇌와 뇌간을 빠르게 제거합니다. 다음으로, 얼음 위의 15ml 튜브에 다시 옮기기 전에 얼어붙은 대뇌의 무게를 잰다.

얼음처럼 차가운 용해 완충액을 용해 완충액 마이크로리터당 150마이크로그램의 뇌 조직 최종 농도에 추가합니다. 그런 다음 1ml 피펫 팁을 통해 trituration한 다음 27 게이지 바늘이 장착된 5ml 주사기를 통해 trituration하여 용해 버퍼에서 뇌를 균질화합니다. 그 후, 완전한 조직 용해를 위해 얼음에서 추가로 30분 동안 뇌 용해물을 배양합니다.

30분 후 세제, 불용성 물질 및 뇌 지질을 제거하여 연속 원심분리합니다. 펠릿을 함유한 미엘린과 세포 파편은 버리되, 모든 원심분리 단계 후에 상등액은 유지합니다. 뇌 용해물을 분취하고 섭씨 80도에서 보관하십시오.

이 단계에서는 BSA가 있는 IP 버퍼 200ml와 BSA가 없는 IP 버퍼 200ml를 준비합니다. 면역침전 반응을 위해 100마이크로리터의 단백질 L 아가로스 슬러리를 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. BSA가 포함된 IP 버퍼 1ml를 튜브에 추가합니다.

그런 다음 반전으로 수동으로 혼합합니다. 다음으로, Protein L 아가로스 비드를 원심분리로 4회 세척합니다. 그 후, 아가로스 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 제거하고 세척 절차를 3회 더 반복합니다.

그런 다음 IP 완충액이 포함된 새로운 BSA를 Protein L agarose에 추가하고 섭씨 4도의 롤러에서 밤새 배양합니다. BSA와 30mg의 용해된 뇌 조직을 포함하는 800마이크로리터의 IP 버퍼에 20마이크로그램의 실험용 항체, 대조 항체 또는 PBS를 추가합니다. 용해된 뇌 조직 30mg을 IgM 항체와 함께 얼음처럼 차가운 IP 버퍼에 넣고 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 1.5mm 마이크로 원심분리기 튜브에 배양합니다.

다음 날, 벤치탑 원심분리기에서 Protein L 아가로스 비드를 스핀다운합니다. 아가로스 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 버리십시오. 그런 다음 냉각된 항체 뇌 용해물 용액을 Protein L agarose에 추가합니다.

항체 항원인 Protein L 아가로스 현탁액을 섭씨 4도의 롤러에서 2시간 동안 배양합니다. 2시간 후 아가로스 L에 부착된 항체 항원 복합체를 원심분리를 통해 세척합니다. 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 조심스럽게 버리고 0.2%BSA를 함유한 얼음처럼 차가운 IP 버퍼 1ml를 추가합니다.

0.2%BSA가 포함된 얼음 찬 IP 버퍼를 사용하여 세척 단계를 한 번 더 반복하고 BSA가 없는 얼음 차가운 IP 버퍼를 사용하여 두 번 더 반복합니다. 그 후, 아가로 스 L.에 부착 된 항체 항원 복합체를 스핀 다운합니다.200 마이크로 리터 피펫을 사용하여 약 50 마이크로 리터의 용액이 단백질 L 아가로 스 펠릿 위에 남을 때까지 상층액을 버립니다. 그런 다음 10 마이크로 리터 피펫을 사용하여 완전히 제거하십시오.

모든 샘플을 얼음 위에 보관하십시오. 다음으로, 각 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 40마이크로리터의 IP 용리 버퍼를 추가합니다. 튜브를 손가락으로 여섯 번 튕기고 섭씨 95도에서 5분 동안 가열합니다.

그 후, 샘플을 얼음 위에 2분 동안 놓고 30초 동안 회전시킵니다. 그런 다음 펠릿을 방해하지 않고 35마이크로리터의 상등액을 새로운 1.5mm 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 내부 튜브 벽에서 소량의 희석된 샘플을 헹궈 Protein L 아가로스 비드의 부재를 확인합니다.

Protein L 아가로스 비드가 있는 경우 13, 000회 g에서 30초 더 샘플을 스핀다운하고 상등액을 깨끗한 튜브로 옮깁니다. 아가로스 비드가 검출되지 않을 때까지 이 단계를 반복합니다. 그런 다음 SDS 폴리아크릴아미드 겔과 트리스-글리신 SDS 완충 시스템에 웰당 10-20마이크로리터의 희석된 샘플을 로드하고 추가 냉각 없이 벤치탑에서 100볼트로 약 1시간 동안 겔을 실행합니다.

그 후, 단백질을 PVDF 멤브레인으로 전달합니다. 단백질은 냉간 전달 버퍼를 사용하여 100볼트의 냉장실에서 2시간 30분 동안 전달됩니다. 탁상용 궤도 셰이커에 섭씨 25도에 1 시간 동안 PBS-T에 있는 부피 건조한 분유 당 10%weight를 가진 막을 막으십시오.

PBS-T로 매번 10분씩 두 번 씻으십시오. PBS-T에서 5%BSA의 1차 항체로 멤브레인을 프로브합니다. 차가운 방에서 오비탈 쉐이커로 밤새 배양합니다.

다음날 아침, 섭씨 25도에서 여분의 PBS-T로 멤브레인을 한 번 세척한 다음 안와 쉐이커에서 PBS-T로 각각 10분씩 3회 세척합니다. 다음으로, PBS-T의 2차 항체와 5% 분유를 멤브레인에 첨가하고 궤도 쉐이커에서 섭씨 25도에서 1시간 동안 배양합니다. 그 후, 섭씨 25도에서 여분의 PBS-T로 멤브레인을 한 번 세척한 다음 오비탈 쉐이커에서 PBS-T로 각각 10분씩 3회 세척합니다.

1밀리리터의 냉각 강화 화학발광 HRP 기판 성분 A를 1밀리리터의 성분 B와 섭씨 25도에서 혼합합니다. 여분의 액체를 제거하기 위해 종이 타월에 멤브레인을 옮깁니다. 그런 다음 멤브레인을 다시 옮기기 전에 종이 타월로 용기를 건조시킵니다.

즉시 사전 혼합된 enhanced chemiluminescence HRP 기질 2ml를 멤브레인에 추가하고 섭씨 25도에서 2분 동안 배양합니다. 멤브레인을 균일하게 적시기 위해 20초마다 용기를 손으로 기울이십시오. 그런 다음 멤브레인을 투명한 플라스틱 슬리브에 옮기고 종이 타월로 과도한 액체와 기포를 제거합니다.

플라스틱 슬리브를 카세트에 테이프로 붙이고 닫습니다. 이 그림은 HigM12가 대뇌 용해물에서 항원을 면역침전시키고 서양 블롯에서 검출 인자로 작용한다는 것을 보여줍니다. 동형 대조 항체나 아가로스 L 비드는 풀다운의 특이성을 보여주는 유사한 항원을 면역침전시키지 않습니다.

여기서, 야생형 및 NCAM 녹아웃 마우스의 CNS 용해물을 사용하는 웨스턴 블롯은 NCAM을 포함하는 PSA에 대한 HIgM 결합의 특이성을 입증합니다.'ENDO-NF를 사용하여 야생형 마우스에서 CNS 조직의 효소 분해는 NCAM에 부착된 PSA를 HIgM12에 대한 특이적 결합 아지점프로서 식별합니다. 본 명세서에 기술된 방법을 사용하여, 고순도의 IBA-1 양성 랫트 미세아교세포 배양물을 수득한다. 미세아교세포와 대조적으로, HIgM12 및 A2B5 표적 세포 표면 항원은 살아있는 세포 조건에서 쥐 OPC 배양에서 매우 풍부했습니다.

이 기술을 마스터하면 13시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차에 따라 Biacore 또는 표면 플라즈몬 공명 기술과 같은 다른 방법을 사용하여 연관 및 연관 상수에 대한 친화도를 결합하는 항체를 식별할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 암 연구, 면역 요법 및 천연 자가항체 분야의 연구자들이 인간의 치료용 IgM 항체에 대한 항원으로 유사 단백질의 탄수화물 정점을 식별할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 인간 IgM 항체를 포함하는 연구 작업에서 당단백질 항원을 식별하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 데이터는 다발성 경화증 치료의 새로운 표적을 제시합니다. 우리가 개발한 항체 치료제인 PSA ENCAP은 다발성 경화증과 유사한 질병과 평가 절하하는 질병에 대한 엄격한 모델을 사용하여 활성 상자에서 기능 개선을 보여준 최초의 치료법 중 하나입니다.