Name: 카파 (Vκ)에 대한 항체 결합 특이성 빛 체인 함유 인간 (IgM의) 항체 : Polysialic 산 (PSA) 사례 연구로 NCAM에 첨부 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: 배우세요 IgM 항체의 항원을 면침전 및 웨스턴 블롯팅으로 식별하는 방법을. 뇌 조직을 이용하여 치료적 잠재력이 있는 항체 표적을 발견하고 중추신경계 질환 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 건강 (R01 GM092993, R01 NS048357 및 R21 NS073684)의 국립 연구소에서 보조금에 의해 지원되었다, 국립 과학 재단 (경력 상), 생명 공학의 미네소타 파트너 상 의료 유전체​​학, 국립 다발성 경화증 협회 (CA1060A) 및 임상과 번역 상 과학에 대한 메이요 클리닉 센터 (CCATS). 저자는 알파 밤, 힐튼, 피터슨과 샌포드 재단, 달과 마릴린 공원 이사 기금 (IMF)과 McNeilus 가족의 지원을 인정합니다.

재수초화 및 CNS 복구를 촉진하는 항체에 대한 특허는 Mayo Clinic이 발행하고 소유하고 있습니다. 저자는 잠재적인 이해 상충이 있습니다.

인간의 천연 대한 IgM자가 항체는 면역 요법에 대한 후보를 호소 암 및 CNS 장애 1-7 포함한 각종 질환의 치료에 치료 적 잠재 성을 보여 주었다. 바람직하게는, 이러한 항체는 중화 항체의 생성이 실질적으로 유효 치료 용량 및 효율을 감소 된 면역 반응을 유발하지 않을 것이다. 중요한 것은, 치료 가능성이있는 모든 항체는 IgM의 이소 타입의 왔으며 잡을 레퍼토리 3-5,8,9,37,40,42-45에 속해있다. 대한 IgM 항체의 임상 적 적용 가능성에 대한 주요 장애물은 많은 경우 미확인 그들의 항원의 확인이다. 의 IgG 항체에 이용 표준 기술은 종종 IgM의의 항원을 식별하는 데 적용 할 수 없습니다. 이 프로토콜은 동물 모델에서 효과적인 회생 인간 IgM의 항체 HIgM12위한 항원으로서 PSA-NCAM의 식별을 설명MS 및 ALS 15-18의. 사용되는 방법에 관계없이, 항체의 이소 타입의 VκI 가벼운 사슬과 특이 Vκ 경쇄 VκI, VκIII 및 VκIV 마우스 항체 모두 인간 항체에 주로 적용된다. 이 프로토콜에서 가장 중요한 공정은 친 화성 크로마토 그래피의 응용에 대한 IgM 항체의 용도이다. 구체적으로는, 항체를 성공적으로 분리 또는 복잡한 조직 - 또는 세포 배양 용 해물로부터 항원을 면역 침전에 풍부 풀다운 제로서 작용해야한다. 농축 항원 분획 이소 제어 항체의 면역 침전에 비해 후속 질량 분광기의 차이에 대해 분석 될 수있다. 하나의 필수 요구 사항이나이 단계의 제한은 단백질 L 아가로 오스에 결합하는 항체를 사용하려면 올바른 항체 Vκ 경쇄 및 호스트 (인간, 마우스)의 존재이다. 아가로 오스에 결합 만난 결합 단백질의 사용 (또한 칼레d 개 대신 단백질 L 아가로 오스의) 렉틴을 만노스 결합하면 특정 Vκ 빛 체인없이 IgMs을 면역 침전하는 잠재적 인 대안입니다. 아놀드 등. (35)에 의해 명시된 바와 같이하지만, 항원 - 결합 대한 IgM 항체는 IgM의가 그 항원에 결합되면 대상 글리 칸이 액세스 할 수 없게하는 표시로, 만난 결합 단백질에 결합하지 않는다. 이러한 발견에 기초하여 만난 결합 단백질하는 항원 로딩 IgM의 35 분자 면역 침전하는 결합 매트릭스로서 사용될 수 없다. 다른 잠재적 인 대안이 보조 아가로 오스 바인딩 안티 IgM의 IgG의 항체 46, 47 또는 표면 활성화 자석 구슬 (48)의 사용의 사용 될 수 있습니다. IgMs 대항 대한 IgG 항체는 관심있는 항원과 함께 용출 된 항체의 정도를 감소시키기 위해 또는 G 아가 아가 로스를 화학적으로 가교 결합 될 수있다. 성공적으로 확인 된 항원에 대한 IgM 항체 면역의 다른 변종 사이의 적절한 비교 전대부분의 면역 침전이 분리 또는 항원에 더 관심없이 IgMs을 고갈 수행했기 때문에 어려운이야. 또한 IgMs를 사용하여 면역 침전 주로 정제 된 항원에 대한 항체 (49)의 노출 된 이미 알고 있거나 예상 단일 항원을 확인하는 데 사용 하였다. 출발 물질 (50)에 비해 면역 혈청 IgM의 분자 - (15 % 10), 인간 IgMs 대항 아가 IgG를 결합의 단점은 매우 저수율이다. 대조적으로, 표면 활성화 자성 비드 성공적 스크래피 관련 브릴 48 IgM의 면역 침전하는 등 다양한 이소 타입의 항체를 적용 하였다. 이 방법은 특정 카파 (Vκ) 또는 람다 (λ) 사슬 또는 특정 호스트에 한정되지 않고 실질적으로 면역 침전에 사용 대한 IgM 항체의 스펙트럼을 넓힐 수있다. 프로토콜의 또 다른 중요한 단계는 DET 역할을하는 항체의 능력이다서양 말 또는 다른 심사 플랫폼에서 항체 (차 항체)를 돌출 한 칼라. 성공적인 항체는 항원 비 이온 또는 가능 온성 계면 활성제의 존재 하에서 결합 할 수 있도록 충분히 높은 친화 도로 항원을 표적으로한다. 선호도가 높은 항체 친 화성 - 숙성의 IgG 항체에 공통 있지만, 상대적으로 생화학 적 설정에서 에이전트를 검출 한 적은 시판 대한 IgM 항체가있는 이유 중 하나입니다 IgM의 이소 타입의 항체 중 덜 일반적이다. 항체의 결합 친 화성이 높은 분자 항원의 면역 침전 및 웨스턴 블로 팅을위한 요구 사항입니다. 세제 농도 또는 IP 버퍼 및 용해 버퍼에 세제의 완전한 부재를 낮추면 그 팹 도메인을 통해 낮은 친화 항체에 의해 표적 항원을 할 수 있습니다. 반대로, 그 Fc 부분을 통해 단백질 L 아가를 타겟팅하는 항체의 능력은 상당히 다른 세제 concen의 범위 아이소 타입 컨트롤 간의 영향을받지 않는다trations. 그러나, 용해 완충액 및 IP 버퍼 낮은 세제 농도는 세포막을 파괴하고 특정 분자의 분리를 방지한다. 마찬가지로, 웨스턴 블롯을 세척 버퍼에서 낮은 세제 농도 (예를 들어, PBS-T)는 낮은 친 화성 항체의 항원 결합을 허용하지만, 동시에 비특이적 결합을 증가시키고, 따라서 옵션이 아니다. 항원 단백질 코어의 존재는이 방법에 대한 또 다른 요구 사항이다. 번역 후 변형 (예를 들어, 당 단백질, 지질 단백질)와 수정되지 않은 단백질,하지만 유일한 지질 또는 탄수화물과 단백질, 웨스턴 블롯에서 검출된다. 이 세제의 존재 또는 부재 조직 또는 세포 용 해물로부터 지질 (예, 스핑 고리 피드)을 면역 침전하는 것은 불가능하다. 동시에 세제 방해 필수적하면서 세제 및 지질의 물리 화학적 특성이 선택적 지질 - 항체 상호 작용을 허용하기에 너무 비슷순서 멤브레인은 특정 분자의 선택적 분리를 허용합니다. 단백질 코어의 부재 최선 지식만을 탄수화물로 구성된 면역 침전에, 이전에보고되지 않았다. 대한 IgM 항체가 자주 반드시 단백질 장치에 연결되지 않은 탄수화물과 당지질을 대상으로하기 때문에 특히 관련된다. 다른 크로마토 그래피 기술은 단백질 코어의 부재 지질 및 탄수화물을 분리하고 면역 식별해야한다. 예를 들어, TLC 플레이트 (면역 TLC)의 후속 검출 항체와 세포 지질의 박층 크로마토 그래피 (TLC)는 (51, 52)를 실현할 수있다. 다른 항 PSA 항체는 시판 항 IgM의 PSA뿐만 아니라 HIgM12 비교 결과 이​​전 연구에 기재되어있다 (클론 2-2B). PSA의 분야에서 가장 일반적으로 사용되는 항체는 마우스와 같은 가능한 monoc의 IgG 항체 (클론 735)는lonal 또는 토끼 폴리 클로 날 항체 (53). 이 안티 PSA IgG 항체는 미세 아교 세포 (41)를 포함하여 다른 CNS의 세포 유형에 SynCAM 및 NCAM에 PSA를 감지합니다. 항 PSA IgG 항체는 달리, 인간 IgM의 항체 HIgM12, HIgM42 및 항 PSA 마우스 IgM의 (클론 2-2B)는 마우스에서 다양한 태아 및 초기 출생 후 단계에서 SynCAM에 PSA를 타겟팅 할 수없는 (그러나 NCAM에)있다 15 비 polysialylated SynCAM되는 동안 쉽게 검출. 사용 IgM의 항체는 또한 미세 아교 세포 (그림 + 4 3)에 PSA를 감지 할 수 없습니다. 항체 이소 타입 사이에 관찰 된 차이에 대한 가능한 설명은 안티 PSA의 IgG에 비해 IgM의 항체의 결합을 잠재적으로 낮은 친화력으로 결합 된 PSA-NCAM의 수준에 비해 낮은 PSA-SynCAM 수준 일 수있다. 이 가설을 테스트하기 위해, 우리는 &lt;SynCAM 존재하는 방대한 양의 배아 단계 E17에서 NCAM KO 동물에서 면역 침전을 수행하고, &quot;풀다운 에이전트&quot;로 HIgM12 사용SUP&gt; 15. E17 WT의 한배 새끼에서 HIgM12 용출 항원을 사용하여 이후의 웨스턴 블롯에 농도계에 의해 검출로 IgMs 중쇄에 비해 PSA-NCAM &quot;를 아래로 당겨&quot;비슷한 강도를 보여 주었다 정도로 PSA-NCAM을 면역 제어합니다. 이 결과는 대상 PSA에 HIgM12의 적어도 충분한 친 화성을 제안했다. WT의 한배 새끼는 달리 HIgM12가 NCAM KO 동물에 SynCAM에 부착 된 PSA를 감지하지 않았다 제어합니다. 동일한 결과는 인간 항 IgM의 HIgM42 PSA를 사용하여 면역 침전을 얻었다. HIgM12 및 HIgM42뿐만 아니라, 마우스 항 - PSA IgM의 (복제 2-2B)는 배아 및 출생 후의 발달 단계에서 WT와 NCAM KO 동물 서양 말에 SynCAM에 PSA를 대상으로 할 수 없습니다. 낮은 친화도가 혼자 가능성이 나타납니다 특히 15 CNS 조직 (물론 당 0.1 μg의 CNS 조직)의 소량을 사용하여 웨스턴 블롯에서 NCAM에 부착 된 PSA를 감지 할 필요 HIgM12의 적은 양 (/ ㎖ 0.1 μg의)을 감안할 때세 가지 방법에 HIgM12에 의한 PSA-SynCAM 검출의 완전한 부족에 대한 책임. 우리는 안티 PSA 대한 IgM 항체 자주 출판 항 PSA IgG 항체 (클론 735) 사이에 상당한 차이가 있다고 결론 지었다. 시판 항 PSA 대한 IgM 항체 HIgM12 이미 다양한 질환 모델에서 효능을 입증하기 때문에 특히 흥미 롭다 antiPSA IgG 항체 (735)로 얻어진 결과를 확인하기 이전에 더 자주 사용하지 않은 이유는 분명하지 않다. 다른 안티 PSA 대한 IgM 항체가 유사한 치료 효과가있을 수 있지만 그것은 반 PSA IgG 항체 (클론 735)는 MS 및 ALS의 모델에서 비슷한 치료 결과를 가지고 있는지 확실하지 않다. 요약하면, 여기에 기재된 방법은 MS에 대한 잠재적 인 임상 시험 및 가능한 다른 신경 퇴행성 질환을 지원하는 회생 HIgM12 인간 항체의 항원을 식별하는 데 주로 사용된다. 개미의 동정생물학적 활성을 갖는 항체 igens 행동의 그들의 메커니즘을 이해하는 필수 단계입니다. 이것은 현재 인간 임상 시험의 안전성과 효능에 대해 시험되는 다수의 모노클로 날 항체의 맥락에서 특히 관련된다. 지금까지 임상 시험 대한 IgM 항체의 수가 적은 반면, 상기 항체 클래스 1-10,37,40,42-45의 치료 가능성을 강조 연구의 증가와 함께, 하이 브리 도마 기술의 최근의 진보는 새로운 또는 개발을 촉구 비 단백질 IgM의 항원을 식별 할 수정 된 방법을 적용.

대한 IgM 이소 타입의 항체는 암, CNS 장애 1-7 포함한 각종 질환의 치료에 큰 치료 적 잠재력을 보여준다. Vollmers &#39;그룹은 암 특이 바이오 마커 또는 세포 사멸 경로 4,8,9을 유도하여 악성 세포를 죽일 수있는 활성 치료제 잠재적 인 사용을 위해 암 환자에서 다수의 항체를 확인했다. 흥미롭게도, 치료 가능성을 가진 모든 확인 된 항체는 IgM의 이소 타입의하고 &quot;자연자가 항체&quot;(NABS)의 그룹에 속한다. 마찬가지로, 게스의 그룹은 마우스 및 다발성 경화증 (MS)의 모델에서 만성 척수 탈수 초 병변에서 재유 수화 자극 인간 항체를 확인 하였다. 항암 효과와 항체와 동일, 모든 재유 수화 촉진 항체는 NABS이며, IgM의 이소 타입 1,6,7,10의. 대부분의 식별 IgMs에 대한 정확한 항원은 여전히​​ undetermine 있습니다임상 시험 MS 환자 11 현재 단계에서 인간의 재유 수화 촉진 항체 rHIgM22 포함 라. 학술 설정 및 산업 (11)와 협력하여 모두 지질과 탄수화물의 연구 분야의 전문가에 의해 반복 된 노력에도 불구하고, rHIgM22의 항원이 성공하지 식별을 시도합니다. 대한 IgM 항체와 작업의 IgG 항체의 항원을 식별하는 데 사용되는 표준 기술의 실패는이 항체 가능성이 가장 높은 대상 탄수화물이나 지질 항원에 대한 구체적인 방법을 구체화하는 중요한 필요성을 식별합니다. 이 논문의 초점은 인간 항체 회생 HIgM12 및 항원을 식별하기 위해 사용 된 실험 절차이다. 항체가 HIgM12 발덴 스트롬 마크로 글로불린 혈증 환자에서 확인하고, 시험 관내에서 신경 돌기 12-14 생장을 촉진하고, 신경 세포 부착 분자 (PSA-NCA 부착 polysialic 폰산 (PSA)을 타겟팅M) 15, 16. HIgM12는 ALS (17)의 마우스 모델에서 수명을 연장하고 Theiler의 쥐 뇌척수염 바이러스 (TMEV) -infected 마우스의 기능 결과를 향상시킵니다. 복강의 단일 저용량 항체 (18)를 주입 한 후 특히, HIgM12 중소 직경 척수 축삭 8 주 만성 탈수 초 마우스와 증가 수의 자연 수평 및 수직 모터 활동을 자극한다. 신경 세포 부착 분자 (NCAM)는 수퍼 패밀리 뉴런, 아교 세포, 골격근 및 자연 살해 세포의 19-25 세포 표면에 발현 된 면역 글로불린 (IG)의 당 단백질이다. NCAM180, NCAM140 및 NCAM120라고 세 가지 주요 NCAM 동종 그들의 세포질 도메인 만 다를 차 성적 증명서의 대체 스플 라이스 변종이다. 중추 신경계 내에서 NCAM 길고 음전하 시알 산 호모 폴리머와 주요 polysialylated 분자 (&gt; 95 %)이다. Polysialic a를N&gt; 10 CID는 PSA이라고한다하지만 짧은 올리고머 구조는 생물학적 관련성이 존재한다. 중추 신경계에 표명 polysialylated 단백질 SynCAM1 26 뉴로 필린 -2- (NRP-2) (27, 28)이며, 나트륨 채널 서브 유닛 (25) (검토를 위해 29 참조). 여기에 기술 된 방법에 관계없이, 항체의 이소 타입 (예를 들어, IgG를, IgM의 특정 카파 (Vκ) 경쇄 (인간 항체, 마우스 항체 VκI 경쇄 대 VκI, VκIII 또는 VκIV 경쇄)를 포함하는 인간 및 마우스 면역 글로불린에 대한 항원 인식을 허용 이가, IgD의 또는 IgE 항체). 이 제한은 IgM의 이소 타입의 항체와 면역 침전을위한 단백질 L 아가로 오스의 사용을 기반으로합니다. 대체 전략 INC 더 대한 IgM 항체이 방법의 적용 범위를 확장 할 수있다 만노스 - 결합 렉틴과 공유 비드를 아가로 오스 연결된 보조 IgG 형 대한 IgM 항체를 포함 할 수있다람다 (λ) 빛 체인 사람들을 luding (설명 참조). 1 ~ 30 : 건강한 사람에서 파생 된 IgM의 λ 경쇄에 비해 혈청 IgM의 Vκ 경쇄의 비율은 1.5이다. 분리, 농축 및 면역 특정 분자 (31)를 검출하기 위해 여기에 사용되는 크로마토 그래피 방법에 기초하여, 모든 항원은 적어도 하나의 작은 단백질 도메인을 포함해야한다. 항체의 특이 적 결합 에피토프 내에서 또는 (당 단백질, 지질 단백질의 예) 단백질 도메인 외부 될 수 있습니다. 잠재적 인 후보의 목록을 좁힐 각각, HIgM12의 특정 항원을 식별하는 데 사용 초기 생화학 적 단계는,이 방법에서 가장 중요한 단계입니다. 세포 유형 특이 제제 및 세포 형태 기반 특성화는 신경 교세포에 대해 기재되어 있지만,이 방법은 CNS 내 또는 외부의 다른 세포 유형을 수용하도록 외삽 될 수있다. 긴급한가있다항체 표적은 탄수화물이나 지질 구조입니다 치료 특히 경우에 다른 인간 질환에 대한 잠재적 인 (IgM의 항원의 대부분)에 대한 IgM 항체의 증가에 적용 할 새로운 또는 수정 된 기술을 개발해야합니다.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-10-013-CVRF</td><td>고포도당, 글루타민 포함, 피루브산 나트륨, 500ml</td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td>500ml, L-글루타민, 피루브산 나트륨, 고포도</td></tr>당 <tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>10,000U/ml, 100ml</td></tr><tr><td>N-2 보충제(100x)</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>B-27 보충제 (50x)</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>무혈청, 10 ml</td></tr><tr><td>소 태아 세럼 - Optima</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450</td> 관개용 <td>500 ml</td></tr><tr><td>멸균수</td><td>Baxter Healthcare</td><td>#2F7114</td><td>USP-1,000 ml, 12/CA</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine hydrobromide</td><td>Sigma</td><td>P7886-50MG</td><td>D-Lys-(D-Lys)n-D-Lys &미드닷; xHBr, 분자량 30,000-70,000 g/mol, 50 mg</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 분획 V</td><td>시그마</td><td>A-3294-100G</td><td>열 충격 분획, 프로테아제 무료, pH 7,&nbsp; 순도 98%, 100 g</td></tr><tr><td>D-(+)-글루코스</td><td>시그마</td><td>G5767-500G</td><td>C6H12O6, 분자량: 180.16 g/mol, ACS 시약,</td></tr><tr><td>소 췌장에서 추출한 트립신</td> 500 g <td>Sigma</td><td>T9935-100mg</td><td>본질적으로 무염, 동결 건조 분말, 9,000 BAEE 단위/mg 단백질</td></tr><tr><td>소 췌장에서 추출한 Deoxyribonuclease I</td><td>Sigma</td><td>D5025-150KU</td><td>Type IV, 동결 건조 분말, 2,000 Kunitz 단위/mg 단백질</td></tr><tr><td>재조합 쥐 FGF 기본 단백질</td><td>R& 운반</td>체 단백질로서의 D 시스템 <td>3339-FB-025</td><td>BSA, 25 &#181; g, 동결건조, > 95%, 16.2 kDa</td></tr><tr><td>재조합 쥐 PDGF-AA 단백질</td><td>R& D 시스템</td><td>1055-AA-50</td><td>캐리어 프리, 50 &#181; g, 동결 건조, > 97 %, E. coli 유래, 12.5 kDa</td></tr><tr><td>Neurobasal-A</td><td>Life Technologies</td><td>10888-022</td><td>500 ml, 글루타민 없음, 아스파르트 산 없음, 글루탐산 파라</td></tr><tr><td>포름 알데히드</td><td>없음 시그마</td><td>P6148-1KG</td><td>결정질, 1kg, 시약 등급, 분자량 30.03 g / mol (단량체)</td></tr><tr><td>Tris [hydroxymethyl] aminomethane (Tris bas</td><td>Biorad</td> <td># 1610719</td><td>1 kg, 99.8 % pure, 분말</td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td> <td>Biorad</td> <td># 1610302</td><td>1 kg,</td></tr><tr><td>분말</td><td>Glycine Fisher Scientific</td><td>BP-381-5</td><td>C 2H 5 NO2, 분자량 : 75.07 g / mol, 백색 결정 분말, 5kg</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>시그마</td><td>S7653-5KG</td><td>NaCl, 분자량 : 58.44 g / mol, 5kg</td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기성</td><td>시그마</td><td>S0751-500G</td><td>NaH2PO4, 분자량: 119.98g/mol, 500g</td></tr><tr><td>인산염 완충 용액 1x (PBS)</td><td>Cellgro</td><td>MT-21-040-CV</td><td>칼슘 및 마그네슘 없음, 6 x 500ml</td></tr><tr><td>Falcon 60mm TC 처리 세포 배양 접시</td><td>Corning Life Sciences</td><td>#353002</td><td>60 mm 세포 배양 접시, TC 처리된 폴리스티렌, 20/팩, 멸균</td></tr><tr><td>Falcon 60 mm x 15 mm 페트리 접시</td><td>Corning Life Sciences</td><td>#351007</td><td>Not TC-Treated 세균 페트리 접시, 20/Pack</td></tr><tr><td>6 웰 세포 배양 플레이트</td><td>Corning Costar</td><td>CLS3516</td><td>6 웰, 평평한 바닥 (개별 포장), 감마선 조사, 성장 영역 9.5 c</td></tr><tr><td>75 cm&sup2; 조직 배양 플라스크</td><td>Corning Life Sciences</td><td>430720U</td><td>75cm&sup2; U-형 경사형 목 세포 배양 플라스크와 플러그 씰 캡</td></tr><tr><td>피어스&트레이드; 단백질 L 플러스 아가로스</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#20520</td><td>2 ml, 가교 6% 구슬 아가로스(CL-6B), 결합 용량: 10 - 20 mg IgG</td></tr><tr><td>4 - 20% Mini-PROTEAN TGX 프리캐스트 겔</td><td>Biorad</td><td>456-1094</td><td>10-well, 50 &micro; l, Mini-PROTEAN 전기 영동 세포</td></tr><tr><td>Immobilon-P Membrane</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>PVDF, 0.45 &micro와 함께 사용; m, 26.5 cm x 3.75 m 롤</td></tr><tr><td>Anti-Polysialic Acid-NCAM 항체, 클론</td><td>Millipore</td><td>MAB5324</td><td>50 microliters, 숙주: 마우스, 단클론 IgM</td></tr><tr><td>4x Laemmli 시료 완충액</td><td>Biorad</td><td>#1610747</td><td>10 ml, 4x premixed protein 시료 완충액</td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>Biorad</td><td>#1610710</td><td>25 ml, 98% 순수, 14.2 M</td></tr><tr><td>Endoneuraminidase-N (Endo-N)</td><td>ABC Scientific</td><td>ABC0020</td><td>50 마이크로 리터, 200 & 마이크로; g/ml, 3,500 U/mg</td></tr><tr><td>25 mm 유리 커버슬립</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-102</td><td>서클 번호 1; 두께: 0.13 - 0.17 mm; 크기 : 25mm</td></tr><tr><td>HEPES 완충 용액</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630-080</td><td>100 ml, 1 M</td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution 1x (HBSS)</td><td>Cellgro</td><td>MT-21-022-CV</td><td>500 ml, 칼슘, 마그네슘, 페놀 제외, 레드</td></tr><tr><td>파파인</td><td>Worthington Biochemical Cooperation</td><td>LS003119</td><td>동결건조 분말, 100 mg</td></tr><tr><td>마그네슘황산염</td><td>시그마</td><td>M-2643-500G</td><td>분말, 500 g</td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Gibco</td><td>#25030-081</td><td>100 ml, 200 mM&nbsp;</td></tr></tbody></table>

카파 (vκ)에 대한 항체 결합 특이성 빛 체인 함유 인간 (igm의) 항체 : polysialic 산 (psa) 사례 연구로 ncam에 첨부

Antibody Binding Specificity for Kappa (V&#954;) Light Chain-containing Human (IgM) Antibodies: Polysialic Acid (PSA) Attached to NCAM as a Case Study

IgM 동형의 항체는 인간 실험에서 잠재적인 치료제, 인간 질병의 동물 모델 및 표준 실험실 기술에서 인자를 검출하는 것으로 종종 무시됩니다. 이와는 대조적으로, 여러 인간 IgM은 암 모델 및 다발성 경화증(MS) 및 근위축성 측삭 경화증(ALS)을 포함한 중추신경계 장애 모델에서 효능의 증거를 입증했습니다. IgM 항체의 발현, 정제 및 안정화에 대한 어려움, (비단백질) 항원 식별에 대한 어려움, 낮은 친화성 결합, 탄수화물 및 지질 연구의 기본적인 지식 격차 등이 이에 대한 고려가 부족한 이유입니다. 
이 원고는 HIgM12를 예로 들어 웨스턴 블로팅(western blotting), 면역침전법(immunoprecipitations) 및 면역세포화학(immunocytochemistry)에 의한 항원을 검출하기 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. HIgM12는 신경세포 접착 분자(NCAM)에 부착된 폴리시알산(PSA)을 표적으로 합니다. HIgM12에 결합하기 위한 NCAM의 중요성을 평가하기 위해 3가지 주요 중추신경계(CNS) 스플라이스 변이체인 NCAM180, 140 및 120이 결핍된 야생형(WT) 및 NCAM 녹아웃(KO) 마우스의 출생 후 초기 마우스 뇌 조직을 사용했습니다. 엔도네우라미니다아제를 사용하여 CNS 조직과 배양된 CNS 세포의 추가 효소 분해를 통해 PSA를 HIgM12에 대한 특이적 결합 항원결정기로 식별했습니다.

이 섹션은 CNS 인간 IgM의 특정 PSA 항원을 연구함으로써 얻을 수있는 결과의 예를 도시한다. 생화학 적 설정에서 형광 면역 세포에 의해 특정 Vκ 경쇄를 포함하는 인간 IgM의 항체의 용도가 도시되어있다. HIgM12는 대뇌 뇌 해물로부터 항원을 immunoprecipitates과 서양 말에서 검출 에이전트 (차 항체) 역할을합니다. 어느 이소 타입 대조군 항체 나 아가로 오스 L 비즈 풀다운 (그림 1)의 특이성을 보여 유사한 항원을 면역 침전. WT 및 NCAM KO 마우스의 CNS 용 해물을 사용하여 웨스턴 블롯은 PSA 함유 NCAM을 (그림 2A)에 HIgM12이 결합의 특이성을 보여줍니다. ENDO-NF를 이용하여 WT 마우스에서 CNS 조직의 효소 소화 HIgM12 대한 특이 적 결합 에피토프 (도 2B로 NCAM에 부착 PSA 식별). 본원에 설명 된 방법을 이용하여 고순도의 IBA-1 양성 소교 배양 래트 (도 3)를 얻는다. 시판 방지 PSA 항체 (클론 2-2B)는 고정에서 세포 표면 또는 내부 PSA 풀 라벨 형광 현미경으로 IBA-1 양성 소교 세포 투과성이되지 않습니다. HIgM12는 정제 된 쥐의 미세 아교 세포의 세포 표면 항원에 레이블을하지 않는 미세 아교 세포 16,41에서 PSA-NCAM의 어떤 세포 표면 발현을보고하지 이전에 출판 된 문학과 일치. 흥미롭게도, 특정 세포 기관 (그림 3)에 한정되지 않고 세포 내에서 고정 투과성이 미세 아교 세포 결과, 핵 주변 패턴의 HIgM12 라벨링. 결과는 골지체 (41)의 레벨에서의 미세 아교 PSA-SynCAM 타겟팅 항 PSA IgG 항체 (클론 735) (26)를 이용하여 수득 된 것과 대조적이다. 미세 아교 세포는 달리 HIgM12라이브 셀 조건 (그림 4)에서 매우 풍부한 쥐 OPC의 문화 A2B5 대상 세포 표면 항원. OPC의 문화 소교 세포를 오염 ~ 5 %가 포함되어 있습니다. 5 GFAP 양성 성상 세포에서 HIgM12 및 안티 PSA 단클론 항체 (클론 2-2B) 사이에 거의 동일한 세포 표면 염색 패턴 (그림 5A)를 보여줍니다. 엔도-NF-소화 WT의 성상 세포의 면역 형광 라벨은 HIgM12가 성상 세포 PSA (그림 5B)의 존재를 보여줍니다 사용하여 제어 처리 WT 성상 교세포 버퍼에 비해. 생체 내에서 PSA 양성 성상 세포의 존재는 여전히 확인되어야한다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54139/54139fig1.jpg" /> 그림 1 :. HIgM12는 HIgM12를 사용하여 3 개월 된 생쥐의 총 뇌 해물로부터 면역 침전 면역 침전의 에이전트 &quot;다운 당겨&quot;인간 이소 제어 HIgM 역할전용 &quot;풀다운&quot;에이전트 등 (126) 또는 아가로 오스 L 구슬. 용출 된 단백질은 HIgM12에 대해 프로브 막과 서양 말에서 실행되었다. (- 73 kDa 이상 ~ 65)를 IgMs 중쇄 이외에 200 kDa의 - HIgM12 코팅 비드로부터 용출 된 단백질의 분자량 160의 범위에 있었다. 이 수치는 J.에서 수정되었습니다 Neurochem. (15). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54139/54139fig2.jpg" /> 그림 2 : HIgM12가 Polysialic 산 (PSA) NCAM에 대한 부분을 목표로하고있다. P7, P13, P16와 P27 NCAM에서 A. 뇌 균질는 KO 마우스 및 이형 한배의 새끼 컨트롤 HIgM12, PSA 및 β - 굴지 부하 제어와 같은에 대해 프로브 막과 서양 말에 실행 된 총. <stronPBS에서 1 % NP40 성인 WT 마우스 뇌 해물 g&gt; B. 10 μg의, pH를 6.5으로 처리 하였다 endoneuraminidase N (ENDO-N) (엑소) α2-3 polysialic 산 중합체 특이성 (시알 리다 아제)과 뉴 라미 나 PBS에서 밤새 37 ºC, 서양 오 점에서 이중선으로 실행하고 로딩 제어와 같은 HIgM12, PSA 및 β - 굴지에 대해 프로브. 이 수치는 J.에서 수정되었습니다 Neurochem. (15). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54139/54139fig3.jpg" /> 그림 3 :. 쥐 미세 아교 세포에 PSA의 부재는 쥐의 미세 아교 세포는 폴리 - D - 라이신 코팅 커버 글라스에 48 시간 동안 배양 하였다 HIgM12 라벨의 부족에 의해 미러와 하나 HIgM12 또는 HIgM12 또는 항과 고정 후 얼음에 라이브 표지 -PSA 단클론 항체 (클론 2-2B). 세포는 t이었다젤 중요한 미세 아교 세포 마커 IBA-1 (녹색), HIgM12 / PSA (빨강)과 DAPI (파란색)으로 표시. 이미지는 소교 세포 HIgM12 (위쪽 열)를 이용하여 결합면과 반대 PSA 부족 차 래트 미세 아교 세포 (아래쪽 열)에있는 세포 표면 및 내부에 저장 (복제 2-2B)에 결합 부재를 나타낸다. 양극성 형태와 IBA-1 얼룩의 유무에 기초하여, 소형 PSA 양성 세포 (아래쪽 열)은 OPC 것으로 시사되었다. 고정 된 세포에서 HIgM12 염색 특정 세포 기관으로 제한되지 않은 비 특이 적 결합 (중간 행)으로 간주 된 punctated, 핵 주변 패턴의 결과. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54139/54139fig4.jpg" /> 그림 4 : HIgM12는 쥐 개 OPC에 세포 표면 PSA-NCAM을 대상으로 쥐 개 OPC와 미세 아교 세포가 cultu했다.HIgM12 또는 A2B5 (녹색), 내부 식세포 / 단핵 세포 마커 CD68과 얼음에 라이브 레이블 폴리 D 라이신 코팅 커버 글라스, 트리플에 증식 배지에서 4 일 동안 빨간색 (복제 ED-1) (빨강)과 DAPI (파란색) . 이미지는 OPC 마커 A2B5 (상단 행) 및 몇 CD68 양성 미세 아교 세포와 HIgM12 (하단 행) (~ 5 %)에 대한 세포 인구가 majorly 긍정적 보여줍니다. 위상 콘트라스트와 DAPI 이미지는 각각의 인구 세포 무결성 및 세포 수를 공개 하였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54139/54139fig5.jpg" /> 그림 5 : HIgM12 및 안티 PSA의 단클론 항체는 마우스 혼합 글 리아의 성상 세포 모집단을 공동 레이블을 붙입니다. WT 및 NCAM에서 A. 마우스 혼합 된 아교 세포는 성상 세포, 희소 돌기 아교 세포 - 혈통 세포와 마이크로 그램을 포함 KO 동물 총LIA는 3 일간 배양 및 HIgM12 (녹색), 안티 PSA 단클론 항체 (클론 2-2B) (빨간색)이어서 성상 세포 마커 GFAP (보라색) 및 DAPI (파란색)에 대한 얼음에 라이브 표시. HIgM12 및 안티 PSA는 GFAP 양성 WT 성상 교세포의 가상 동일한 염색 패턴을 공개하지만 NCAM KO 마우스의 배양 성상 세포에 결합이 부족하다. 이 수치는 J.에서 수정되었습니다 A.에서 설명하고 (친절 박사 마르티나 Muehlenhoff에서 제공) endoneuraminidase-NF 또는 PBS 제어와 하룻밤 치료로 Neurochem. 15. B. 혼합 된 아교 세포는 동일하게 배양 하였다. 세포 HIgM12 (녹색)이어서 내부 마커 GFAP (적색) 및 DAPI (파란색)에 대한 스테인드 얼음에 라이브 표시했다. HIgM12는 PBS-제어에 세포 표면 항원이 혼합 된 아교 문화를 처리하지만 endoneuraminidase-NF이 혼합 된 아교 세포를 치료 목표로하고있다. 이 수치는 JNSCI 16에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig5large.jpg" target="_blank">경기 수</a>쉽게이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 모든 이미지는 동일한 장비 설정을 사용하여 60X 배율로 촬영과 동일하게 처리 하였다. <img alt="1 번 테이블" src="/files/ftp_upload/54139/54139table1.jpg" /> 표 1 :. 버퍼 및 솔루션 조리법 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/Table1.xls">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> CNS 조직 </td><td> 엔도-NF / PBS </td><td> 용해 완충액 </td><td> 총 볼륨 </td></tr><tr><td> 1. WT 마우스 </td><td> 67 μg의 (0.45 μL) </td><td> 2 μL (12 μg의) ENDO-NF </td><td> 7.55 μL </td><td> 10 μL </td></tr><tr><td> 2. WT 마우스 </td><td> 67 μg의 (0.45 μL) </td><td> 2 μL PBS </td><td> 7.55 μL </td><td> 10 μL </td></tr><tr><td> 3. WT 마우스 </td><td> 67 μg의 (0.45 μL) </td><td> 아니 PBS 또는 엔도 - NF </td><td> 9.55 μL </td><td> 10 μL </td></tr><tr><td> 4. NCAM KO 마우스 </td><td> 67 μg의 (0.45 μL) </td><td> 2 μL (12 μg의) ENDO-NF </td><td> 7.55 μL </td><td> 10 μL </td></tr><tr><td> 5. NCAM KO 마우스 </td><td> 67 μg의 (0.45 μL) </td><td> 2 μL PBS </td><td> 7.55 μL </td><td> 10 μL </td></tr><tr><td> 6. NCAM KO 마우스 </td><td> 67 μg의 (0.45 μL) </td><td> 아니 PBS 또는 엔도 - NF </td><td> 9.55 μL </td><td> 10 μL </td></tr></tbody></table> 표 2 : P7 WT와 NCAM KO 마우스의 CNS 조직의 ENDO-NF 소화.

우리는 특정 카파(Vκ) 경쇄를 가진 인간 및 마우스 IgM 항체에 대한 항원을 포함하는 단백질 부분을 식별하는 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 IgM 계열 항체에 국한되지 않고 면역침전 중에 충분히 높은 친화력으로 항원을 표적으로 하는 모든 면역글로불린 동형에 적용됩니다.

카파 (Vκ)에 대한 항체 결합 특이성 빛 체인 함유 인간 (IgM의) 항체 : Polysialic 산 (PSA) 사례 연구로 NCAM에 첨부

Antibodies of the IgM isotype are often neglected as potential therapeutics in human trials, animal models of human diseases as well as detecting agents ...

본 절차의 전반적인 목표는 IgM 이소형에 초점을 맞추어 치료 잠재력이 있는 항체의 항원을 식별하는 것입니다. 이 방법은 생의학 분야의 지식 공백을 메우며, 암 연구 및 중추신경계 질환을 위한 새로운 바이오마커와 면역치료제의 식별에 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 치료 잠재력이 매우 높음에도 불구하고 그동안 간과되었던 항체 클래스에 대한 연구 가능성을 열어준다는 점입니다.이 기술의 영향은 항체 기반 치료제의 표적이 될 수 있는 모든 질병의 진단 및 치료로 확장됩니다. 본 연구는 IgM 항체의 항원과 조직 및 하위 배양의 성장에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 모든 종의 다른 항체 이소형(isotype)에도 적용될 수 있습니다.저는 다양한 생화학적 응용 분야에서 IgM 항체의 특이적이고 두드러진 결합을 확인했을 때 처음으로 이 방법에 대한 아이디어를 얻었습니다. 본 절차의 시연은 Robert Kahoud와 Jens Watzlawik이 진행합니다. 이 절차를 시작하려면 귀 높이의 두개골 앞쪽을 절개하고 두개골을 젖혀 냅니다.그런 다음, 뇌를 15 milliliter 튜브에 조심스럽게 넣고 즉시 드라이아이스에 보관합니다. 5분 후, 뇌를 깨끗한 칭량지에 옮기고 깨끗한 면도날을 사용하여 소뇌와 뇌간을 빠르게 제거합니다. 다음으로, 냉동된 대뇌의 무게를 측정한 후 얼음 위에 있는 15 milliliter 튜브로 다시 옮깁니다.최종 농도가 라이시스 버퍼 1 µL당 뇌 조직 150 µg이 되도록 얼음처럼 차가운 라이시스 버퍼를 추가합니다. 그런 다음, 1 mL 피펫 팁을 이용한 분쇄 후 27 gauge 바늘이 장착된 5 mL 주사기를 이용한 분쇄 과정을 통해 라이시스 버퍼 내에서 뇌 조직을 균질화합니다. 이후, 조직의 완전한 용해를 위해 뇌 용해물을 얼음 위에서 30분 동안 추가로 배양합니다.30분 후, 연속 원심분리를 통해 세제, 불용성 물질 및 뇌 지질을 제거합니다. 수초 및 세포 파편이 포함된 펠렛은 버리고, 매 원심분리 단계 후의 상층액은 보관합니다. 뇌 용해물을 소분하여 80 °C에서 보관합니다.이 단계에서는 BSA가 포함된 IP Buffer 200 milliliters와 BSA가 포함되지 않은 IP Buffer 200 milliliters를 준비합니다. 면역침전 반응을 위해, Protein L agarose slurry 100 microliters를 1.5 milliliter microcentrifuge tube에 옮깁니다. 튜브에 BSA가 포함된 IP buffer 1 milliliter를 추가합니다.그런 다음, 도립 혼합 방식으로 수동으로 섞어줍니다. 이어서, 원심분리를 통해 Protein L agarose beads를 4회 세척합니다. 그 후, agarose 펠렛이 손상되지 않도록 주의하며 상층액을 제거하고, 세척 과정을 3회 더 반복합니다.그다음, IP 버퍼가 포함된 신선한 BSA를 Protein L agarose에 추가하고 4°C의 롤러에서 하룻밤 동안 배양합니다. BSA와 용해된 뇌 조직 30 mg이 포함된 800 µL의 IP 버퍼에 실험용 항체, 대조군 항체 또는 PBS 20 µg을 추가합니다. 용해된 뇌 조직 30 mg을 IgM 항체가 포함된 얼음처럼 차가운 IP 버퍼와 함께 1.5 mm 마이크로원심분리관에 넣고 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날, 벤치탑 원심분리기를 사용하여 Protein L agarose 비즈를 원심 분리합니다. agarose 펠릿이 흐트러지지 않도록 주의하며 상층액을 제거합니다. 그다음, 차갑게 식힌 항체 뇌 용해물 솔루션을 Protein L agarose에 첨가합니다.항체 항원, Protein L agarose 현탁액을 4°C의 롤러 위에서 2시간 동안 배양합니다. 2시간 후, 원심분리를 통해 agarose L에 결합된 항체 항원 복합체를 세척합니다. 펠릿이 손상되지 않도록 상층액을 조심스럽게 제거하고, 0.2% BSA가 포함된 얼음처럼 차가운 IP buffer 1 mL를 첨가합니다.0.2% BSA가 포함된 얼음처럼 차가운 IP buffer를 사용하여 세척 단계를 한 번 더 반복하고, BSA가 포함되지 않은 얼음처럼 차가운 IP buffer를 사용하여 두 번 더 반복합니다. 그 후, agarose L에 부착된 항체-항원 복합체를 원심 분리하여 가라앉힙니다. 200 µL 피펫을 사용하여 Protein L agarose 펠렛 위에 용액이 약 50 µL 남을 때까지 상층액을 제거합니다. 그런 다음, 10 µL 피펫을 사용하여 남은 용액을 완전히 제거합니다.모든 샘플을 얼음 위에 보관하십시오. 다음으로, 각 1.5 milliliter 미세원심분리 튜브에 IP 용출 완충액 40 microliters를 첨가합니다. 튜브를 손가락으로 여섯 번 튕겨 섞어준 후, 95 degrees Celsius에서 5분 동안 가열합니다.그 후, 샘플을 얼음 위에 2분 동안 두고 30초 동안 원심 분리합니다. 그런 다음, 펠렛이 섞이지 않도록 주의하며 상층액 35 µL를 새로운 1.5 mm 마이크로원심분리 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 희석된 샘플 소량을 튜브 내벽에 헹구어 Protein L agarose 비드가 없는지 확인합니다.Protein L agarose 비즈가 남아 있는 경우, 샘플을 13,000 ×g에서 30초 동안 추가로 원심 분리하여 상층액을 깨끗한 튜브로 옮깁니다. agarose 비즈가 더 이상 검출되지 않을 때까지 이 단계를 반복합니다. 그 후, 희석된 샘플 10-20 µL를 tris-glycine SDS 버퍼 시스템이 적용된 SDS polyacrylamide 겔의 각 웰에 로딩하고, 별도의 냉각 장치 없이 벤치탑에서 100 V로 약 1시간 동안 전기영동을 수행합니다.이어서, 단백질을 PVDF membrane으로 전이시킵니다. 단백질은 냉장실에서 차가운 전이 버퍼를 사용하여 100 volts로 2시간 30분 동안 전이시킵니다. PBS-T에 10% w/v로 희석한 탈지분유 분말로 membrane을 블로킹하며, 벤치탑 오비탈 쉐이커 위에서 25 °C로 1시간 동안 처리합니다.PBS-T로 10분씩 2회 세척합니다. PBS-T에 5% BSA가 포함된 용액에 희석한 1차 항체로 막을 프로빙합니다. 저온실의 오비탈 쉐이커에서 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날 아침, 25 °C에서 멤브레인을 충분한 양의 PBS-T로 한 번 세척한 후, 오비탈 쉐이커에서 PBS-T로 10분씩 세 번 더 세척합니다. 다음으로, 2차 항체와 5% 무지방 분유가 포함된 PBS-T를 멤브레인에 첨가하고 25 °C의 오비탈 쉐이커에서 1시간 동안 배양합니다. 그 후, 25 °C에서 멤브레인을 충분한 양의 PBS-T로 한 번 세척한 다음, 오비탈 쉐이커에서 PBS-T로 10분씩 세 번 더 세척합니다.냉각된 enhanced chemiluminescence HRP substrate 성분 A 1 mL를 25 °C에서 성분 B 1 mL와 혼합합니다. 멤브레인을 종이 타월 위로 옮겨 과잉 액체를 제거합니다. 그 후, 멤브레인을 다시 옮기기 전에 용기를 종이 타월로 닦아 건조시킵니다.즉시 미리 혼합된 enhanced chemiluminescence HRP 기질 2 mL를 멤브레인에 첨가하고 25 °C에서 2분 동안 배양합니다. 20초마다 용기를 손으로 기울여 멤브레인을 균일하게 적셔 줍니다. 그 후, 멤브레인을 투명한 플라스틱 슬리브로 옮기고 페이퍼 타월을 사용하여 과잉 액체와 공기 방울을 제거합니다.플라스틱 슬리브를 카세트에 테이프로 고정하고 닫습니다. 이 그림은 HigM12가 뇌 용해물로부터 항원을 면역침전시키며, Western blot에서 검출제로 작용함을 보여줍니다. 이소타입 대조군 항체와 agarose L beads 모두 유사한 항원을 면역침전시키지 않았으며, 이는 퓰다운(pull down)의 특이성을 입증합니다.여기에서, 야생형 및 NCAM 녹아웃 마우스의 CNS 용해물을 이용한 Western blot은 PSA를 포함하는 NCAM에 대한 HIgM 결합의 특이성을 입증합니다. ENDO-NF를 사용하여 야생형 마우스의 CNS 조직을 효소 분해하면 NCAM에 부착된 PSA가 HIgM12의 특이적 결합 에피토프임을 확인할 수 있습니다. 본 문서에 설명된 방법을 사용하여 고순도의 IBA-1 양성 쥐 미세아교세포 배양물을 얻습니다. 미세아교세포와 대조적으로, 살아있는 세포 조건의 쥐 OPC 배양물에서는 HIgM12 및 A2B5 표적 세포 표면 항원이 매우 풍부하게 나타났습니다.이 기술을 숙달하면 13 작업 시간 내에 완료할 수 있습니다. 본 절차를 수행한 후, Biacore 또는 표면 플라즈몬 공명 기술과 같은 다른 방법을 사용하여 결합 상수 및 해리 상수에 대한 항체의 결합 친화도를 확인할 수 있습니다. 개발 이후, 이 기술은 암 연구, 면역 요법 및 천연 자가항체 분야의 연구자들이 인간의 치료용 IgM 항체를 위한 항원으로서 단백질 상의 탄수화물 에피토프를 식별할 수 있는 길을 열어주었습니다.이 영상을 시청하고 나면, 인간 IgM 항체를 포함하는 연구 작업에서 당단백질 항원을 식별하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 해당 데이터는 MS 치료를 위한 새로운 표적을 제공합니다. 우리가 개발한 항체 치료제인 PSA ENCAP은 다발성 경화증(Multiple Sclerosis)과 유사한 질환을 평가하는 엄격한 모델의 활동 박스(activity box)에서 기능적 개선을 보여준 최초의 치료제 중 하나입니다.

antibody-binding-specificity-for-kappa-v-light-chain-containing-human

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

본 연구에서 우리는 특정 단백질의 글리코 실화 프로 파일링에서 사용할 수있는 렉틴 검출 방법과 멀티 플렉스 높은 처리량 항체 microarray를위한 향상된 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 새로운 신뢰할 수있는 시약을 갖추고 있으며 훨씬 이전 절차에 비해 시간, 비용, 연구 장비 요구 사항을 줄여줍니다.

단지 샘플의 특정 단백질 글리코 실화의 다중 높은 처리량 프로파일을위한 화학을 차단 항체 Microarray

이 프로토콜은 고래류의 미오글로빈에 강하게 반응하는 두 개의 IgG 클래스 단클론 항체(mAb)의 개발을 설명합니다. 이러한 mAb는 샌드위치 형식을 기반으로 하는 콜로이드 금 면역크로마토그래피 테스트 스트립에 적용되어 고래류의 Mb를 바다표범 및 다른 동물과 구별합니다.

고래 마이오글로빈의 검출을위한 콜로이드 골드 기반 면역 크로마토 그래피 테스트 스트립의 개발

여기에서 저자는 도트-블롯 하이브리드화를 통해 정제된 단클론 항체와 펩타이드 스캐닝을 사용하여 선형 항원 항원결정기를 정의하는 간단하고 효율적인 프로토콜을 제시합니다. 그런 다음 식별된 항원결정기를 치료 및 진단 응용 분야에 사용할 수 있습니다.

펩타이드 모노클로 날 항체 인식 선형 B 세포 에피토프의 확인을 스캔 보조

이 문서는 준비와 다양 한 immunoassays에 사용 하기 위해 천연 제품에 대 한 단일 클론 항 체의 평가 대 한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 이 절차는 면역을, 세포 융합, 간접 경쟁 ELISA, 긍정적인 복제품와 단일 클로 널 hybridoma 준비를 포함 한다. MALDI – TOF-MS와 ELISA 분석을 사용 하 여 항 체 특성에 대 한 사양도 제공 됩니다.

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유전코드 확장은 정의된 부위에서 담체 단백질에 바이오트호고날 기능군을 베어링하는 부자연스러운 아미노산의 도입을 위해 적용된다. 바이오트호고날 기능은 균질성 글리코콘주게이트 백신을 제공하기 위해 탄수화물 항원을 선별적으로 결합하는 데 더 많이 사용된다.

백신 목적을 위해 결합된 부자연스러운 아미노산 통합 및 클릭 화학에 의해 생성된 균일한 글리코콘주게이트

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고정화된항원에 대한 방사성 표지된 항체의 결합 친화도 (KD) 결정

이 프로토콜은 원형질막 단백질의 나노스케일 공간 조직을 해명하기 위한 단일 항체 표지(SAL)를 설명합니다. 단일 분자 수준에서 누적된 항체-에피토프 상호작용을 활용하여 막 SAL(mSAL)은 국소 에피토프 분포를 지도화하는 동시에 천연 세포 환경에서 항체 결합 행동을 포착합니다.

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배우세요 IgM 항체의 항원을 면침전 및 웨스턴 블롯팅으로 식별하는 방법을. 뇌 조직을 이용하여 치료적 잠재력이 있는 항체 표적을 발견하고 중추신경계 질환 연구에 활용할 수 있습니다.

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