고기 인증에 펩티드 응용의 MRM 질량 분석을 사용하여 혼합물에서 종 결정 및 정량

이 방법의 전반적인 목표는 다중 반응 모니터링 질량 분석법을 사용하여 식품 사기 탐지 도구로 사용하기 위해 생고기 혼합물에 존재하는 종을 식별하고 정량화하는 것입니다. 이 방법은 소시지나 햄버거와 같은 제품에 존재하는 종을 확인하는 것과 같은 식품 무결성 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 우리의 접근 방식은 단백질 구성 요소의 질량 분석법을 기반으로 합니다.

이 기술의 주요 장점은 빠르고 정량적인 결과를 제공할 수 있다는 것입니다. 우리는 같은 이름과 다른 종으로 알려진 단백질이 실제로 종을 식별할 수 있을 만큼 충분히 다르지만 정량화를 허용할 만큼 유사하다는 것을 발견했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 갖게 되었습니다. 시료를 섭씨 95도의 뜨거운 블록에서 30분 동안 가열하여 시료를 열적으로 변성시킵니다.

실온에 도달할 때까지 약 15분 동안 샘플을 식힙니다. 그런 다음 소화를 촉진하기 위해 요소 30mg을 넣고 섞습니다. 트립신 용액을 중량 기준으로 효소 대 기질의 1:30 비율로 샘플에 첨가합니다.

그런 다음 부드럽게 와류로 혼합하고 섭씨 37도에서 밤새 단백질 분해되도록 합니다. 다음으로, 먼저 샘플을 물로 1-2 부피로 희석하여 사후 단백질 분해 샘플을 탈염합니다. 1ml의 메탄올을 첨가하여 30mg의 역상 물질로 채워진 고분자 역상 카트리지를 활성화합니다.

그런 다음 1%의 포름산 1ml를 추가하여 카트리지를 평형화합니다. 중력 하에서 카트리지에 샘플을 로드합니다. 이제 1%의 포름산을 함유한 1ml의 5% 메탄올로 세척합니다.

펩타이드를 1ml의 아세토니트릴 물로 용리하여 5마이크로리터의 DMSO가 미리 채워진 2mL 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다. 그런 다음 원심 증발기를 사용하여 섭씨 50도의 진공 상태에서 120분 동안 용매를 제거합니다. 그런 다음 잔류물을 250마이크로리터의 아세토니트릴 물에 다시 용해시킵니다.

용액을 저용량 자동시료주입기 바이알로 옮깁니다. UniProt 데이터베이스에서 서로 다른 만남에 대한 미오글로빈 염기서열을 찾습니다. 미오글로빈 염기서열을 펩타이드 및 전이 예측 소프트웨어의 타겟 박스에 입력합니다.

필요한 경우 펩타이드 위로 마우스를 가져가면 펩타이드 단편 목록이 표시됩니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 기본 설정을 입력한 후 Export(내보내기)를 클릭하고 Transition List(변환 목록)를 선택하여 생성된 MRM 변환 및 매개변수가 포함된 스프레드시트를 만듭니다. MRM 검출과 함께 포지티브 전기분무 모드에서 작동하는 삼중 사중극자 질량분석기에 연결된 C18 코어 쉘 HPLC 컬럼과 자동 시료 주입기를 사용하여 이진 그래디언트의 고성능 액체 크로마토그래피 또는 HPLC 시스템을 설정할 수 있습니다.

액체 크로마토그래피 질량 분석기 데이터 수집 소프트웨어의 edit parameters 섹션에서 스캔 유형을 MRM으로 선택하고 극성을 positive로 선택합니다. 스프레드시트에 생성된 전이에 대한 Q1, Q3, 시간, ID, DP 및 CE 값을 입력하고 획득 방법을 저장합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 분석법 매개변수를 설정한 후 데이터 수집 소프트웨어로 이동하여 Acquire를 클릭하고 Equilibrate를 선택합니다.

열리는 상자에서 기기 평형화를 시작하는 데 필요한 획득 방법을 선택합니다. 그런 다음 샘플 바이알을 오토샘플러의 랙에 넣습니다. File(파일)을 클릭하고 New(새로 만들기)를 선택한 다음 Acquisition Batch(획득 배치)를 선택합니다.

샘플 이름에 분석할 각 샘플의 ID를 삽입합니다. 수집된 데이터를 시각화하는 방법에 대한 자세한 내용은 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. 이전에 얼린 고기를 사용하여 가루로 갈아서 사용하십시오.

15밀리리터 플라스틱 원심분리기 튜브에 각각의 고기 무게를 달아 다양한 고기 혼합물을 준비합니다. 고기 가루에 추출 완충액 4ml를 추가합니다. 30초 동안 볼텍싱한 후 실온의 실험실 셰이커에서 분당 250사이클로 2시간 동안 추출합니다.

추출물의 2 밀리리터를 2 밀리리터 마이크로 분리기 관으로 옮기거든 4 섭씨 및 17, 2개의 밀리리터 분리기 관으로 상등액의 000 G.Transfer 200 마이크로리터 분취수에 5 분 동안 분리기를 옮기십시오. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 샘플의 단백질 농도를 결정하기 전에 원심 증발기를 사용하여 샘플을 건조합니다. 육류 혼합물의 단백질 분해를 수행하려면 건조 된 잔류 물을 25 밀리 몰 중탄산 암모늄 용액 1 밀리리터에 다시 용해시킵니다.

볼텍싱으로 잘 섞어 이전과 같이 프로테올로시스를 수행합니다. 그런 다음 예약된 MRM을 사용하여 유사한 방식으로 LCMS를 설정하고 실행합니다. 데이터 보기 소프트웨어에 전체 크로마토그램을 표시합니다.

각 전이 세트에 대해 추출된 이온을 차례로 표시합니다. 각 클러스터에 예상 머무름 시간에 필요한 수의 종 모양 피크가 포함되어 있는지 육안으로 확인합니다. 이를 통해 선택된 펩타이드의 존재를 확인합니다.

그런 다음 탐색 모음에서 Quantiation Wizard를 두 번 클릭합니다. Select Samples 창에서 단일 데이터 파일을 선택하여 quantitation set을 생성합니다. 그런 다음 사용 가능한 샘플을 하나 이상 선택합니다.

다음을 선택하여 설정 및 쿼리 선택 상자를 표시합니다. 기본 설정을 그대로 두고 다음을 선택하여 Select Method를 표시합니다. Method 드롭다운 상자에서 통합 방법 파일을 선택하고 마지막으로 Finish를 선택합니다.

결과 테이블을 저장하고, 텍스트 파일로 내보내고, 스프레드시트에서 열어 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 데이터를 검토합니다. 이 그림은 쇠고기와 체중 혼합물에 대한 1% 체중에서 얻은 말에 대한 가장 강렬한 MRM 전이를 보여줍니다. 대조적으로, 빨간색 선은 말이 없을 때 쇠고기에서 전환되는 것을 나타냅니다.

이것은 비율로 표현된 쇠고기에서 측정된 말의 양과 준비된 말의 양을 비교한 그래프입니다. 이 플롯은 정량적 측정을 위해 이 방법을 사용하는 방법을 명확하게 보여줍니다. 마스터링되고 배치 처리를 사용할 때 이 방법의 처리량은 24시간당 최대 20개의 샘플에 도달할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 추출 분석에 적합한 단백질을 선택해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 미오글로빈은 풍부하고 수용성이며 열에 안정적이기 때문에 붉은 육류 종을 검사하기에 좋은 후보입니다. 이 절차는 동시에 식별하고 정량화해야 하는 추가 종을 포함하도록 확장될 수 있습니다.

최대 수는 질량 분광 스캔 속도에 의해서만 제한됩니다. 이 기술은 연구자들이 소비자 및 브랜드 보호와 같은 영역에서 펩토 지문을 사용할 수 있는 길을 열어주고 있습니다.