Name: 쥐 Cremaster 근육의 세동맥의 셀이없는 계층의 시각화 및 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: 학습하세요 쥐 Cremaster 근육을 이용한 세동맥 세포없는 층의 시각화 및 정량화 방법을 통해 미세혈관역학 연구를 수행하는 기법입니다. 이 방법은 정확하고 일관된 측정을 가능하게 합니다.

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이 연구는 NMRC(National Medical Research Council)/CBRG(Cooperative Basic Research Grant)/0078/2014의 지원을 받았습니다.

이 연구는 싱가포르 기관 동물 관리 및 사용위원회 (승인 된 프로토콜 없음. R15-0225)의 국립 대학에 따른다. 동물 모델 1. 수술 준비 <ol><li> 선박 삽관 <ol><li> 남성 흰쥐 마취 - 무게 (6 7 주)를 (203 ± 20) 복강을 통해 케타민 (37.5 ㎎ / ㎖) 및 자일 라진 (5 ㎎ / ㎖) 칵테일 g (IP) 주입 (2 ㎖ / kg) . 바늘을 정리해 또는 주입 후 주사기에서 제거하지 마십시오. </li><li> 동물이 마취되면 (핀칭 발가락으로 확인) 37 ℃에서의 체온을 유지하기 위해 가열 패드에 배치. 조심스럽게 견갑골, 전방 경부, 복부, 중간 뒷다리 및 음낭 주머니에 머리를 면도. 조심스럽게 접착 종이 테이프를 사용하여 다리를 억제. </li><li> 미세 절제 가위와 직각 집게를 보는 동안을 사용하여 모든 수술 절차를 수행실체 현미경. 수술하는 동안 부상을 방지하기 위해 구멍 방지 트레이에있는 모든 날카로운 수술 도구를 놓습니다. </li><li> 절개를 수행하기 전에 수술 부위를 교대 요오드, 70 % 에탄올로 3 회 문질러. 30 IU / ml의 헤파린 생리 식염수 용액으로 모든 카테터를 플래시합니다. </li><li> 오른쪽 경정맥을 통해 수술 가위를 사용하여 견갑골에 1.5 cm 중간 선에 피부 절개 - 1을 만듭니다. 경정맥을 노출 무딘 절개하여 밴드를 분리하고,이를 폴리에틸렌 관 (PE-50) 5-0 실크 봉합사를 이용하여 헤파린 염수로 가득 cannulate. 추가 마취를 주입 할 때 필요한 (1/3 초기 용량의 1/2, 정맥 주사 (IV)) 수술과 실험의 과정을 통해. </li><li> 기도 명백을 유지하기 위해 기관 절개술을 수행합니다. 전방 경추 지역에 1.5 cm의 절개 - 1을 만듭니다. 대신에 카테터를 고정 2-0 실크 봉합사로 폴리에틸렌 관 (PE-205)를 이용하여 기관을 Cannulate. </li><li> 혈압 모니터대퇴 동맥에 삽관을 통해. 뒷다리의 왼쪽 내측 표면에서 1.5 cm의 절개 - 1을 만듭니다. 무딘 절개에 의한 대퇴 동맥을 분리합니다. 헤파린 염수 5-0 실크 봉합사를 이용하여 충전 된 폴리에틸렌 관 (PE-10)를 대퇴 동맥 Cannulate. </li></ol></li><li> Cremaster 근육 준비 및 흐름 시각화 <ol><li> 를 확장하기 위해 음낭 주머니의 정점을 5-0 실크 봉합사를 삽입합니다. 음낭 주머니의 복부 표면을 따라 절개를합니다. 노출 된 근육, 정기적으로 따뜻한 등장 성 용액 (pH 7.4의 37 ° C)를 적용합니다. </li><li> 신중하고 철저하게 결합 조직을 둘러싸고있는 면봉을 사용하여 제거합니다. </li><li> cremaster 근육의 꼭대기를 통해 5-0 실크 봉합사를 삽입합니다. 같은 길이의 두 조각으로 봉합사를 잘라 양쪽에 매듭을 묶어. 두 매듭 사이의 근육을 잘라 조심스럽게 봉합을 잡아 당겨 사용자 정의 투명한 플렉시 글라스 플랫폼에 그것을 스트레칭. 고치다블루 압정와 플랫폼 상에 봉합사의 끝. 참고 : 결합 조직을 주변의 철저한 제거는 최적의 이미지 대비를 얻는데 매우 중요하다. </li><li> 5 ~ 6 고착이 이루어 될 때까지 단계를 반복 1.2.3. 조심스럽게 고온 소작을 사용하여 부고환에서 cremaster 근육을 제거합니다. 조직의 탈수를 방지하기 위해 노출 된 근육에 따뜻한 등장 솔루션을 Superfuse. <ol><li> 거즈의 접힌 부분과 cremaster 근육을 둘러싸고 있습니다. 비닐 막을 노광 근육 커버. 영화와 함께 거즈 조각 물 침수 현미경 목표 (그림 1A) 따뜻한 등장 솔루션을 보유 얕은 분지를 형성한다. </li></ol></li><li> 생체 내에 현미경 (그림 1C)의 동물 무대에 동물을 전송합니다. 지속적인 압력 모니터링 (그림 1E)에 대한 생리 학적 데이터 수집 시스템에 동맥 삽관을 연결합니다. </li><li> 근육 temperat 유지동물 플랫폼 (그림 1B) 아래에 부착 된 발열체와 35 ° C에서 URE. 발열체 (도 1D)의 전력 제어기에 네거티브 피드백을 제공하도록 근육 옆에 온도 센서를 배치했다. </li><li> 15 분은 환경과 평형을 무대에 동물을 둡니다. </li><li> 40 배의 물 액침 대물 긴 작동 응축기와 생체 내에 현미경 혈류 시각화. </li><li> 분지 세동맥 적혈구 코어 사이에 명확한 이미지 초점 및 콘트라스트에 기초하여 (&lt;60 μm의)을 선택 CFL 및 용기 벽이 순서 혈관의 직경 평면 현미경을 집중한다. 수직으로 혈관 벽을 정렬하기 위해 현미경에 장착 카메라를 돌립니다. </li><li> 1 초 동안 3000 / 초의 프레임 레이트로 고속 비디오 카메라를 사용하여 혈액의 흐름을 기록한다. 이미지 품질을 보존하기 위해 비 압축 8 비트 그레이 스케일 AVI 형식으로 녹화 된 영상을 저장한다. 노트:<html> / 초 3000 프레임의 최소 기록 프레임 레이트는 CFL 측정 생리 동맥 흐름 조건 하에서 적어도 한번 RBC 당 수행 될 수 있도록 권장한다. </li><li> 적혈구와 플라즈마 사이의 대비를 향상시키기 위해 510 나노 미터 - 310에서 394 nm의 스펙트럼 대역의 파장에서 최대 전송과 푸른 필터를 사용합니다. 참고 : 현미경 광원 (100 W 할로겐 램프)에서 파란색 필터를 통과하는 빛의 스펙트럼이 잠재적 인 조직 손상을 방지하기 위해 낮은 조명 강도의 확인하십시오. </li><li> 실험의 끝에, 펜토 바르 비탈 나트륨의 과량으로 동물을 안락사. </li></ol></li></ol> 2. 이미지 분석 <ol><li> CFL 폭 측정 전처리 <ol><li> MATLAB을 열고 &#39;CFL_pre.m&#39;파일을 실행합니다. (이 다른 MATLAB 파일은 찾을 수 있습니다IP &quot;&gt; 기업 MATLAB 보관.) </li><li> 분석 할 비디오 파일을 선택하려면 &#39;파일 열기&#39;를 클릭하십시오. </li><li> 수직으로 혈관 벽을 정렬하기 위해 &#39;회전&#39;슬라이더를 조정합니다. 주 : 사용자는 &#39;격자에&#39;버튼을 선택하여 용기 정렬 어시스트 그리드 라인을 표시하고, &#39;축소&#39;슬라이더를 밀어 화상의 줌 레벨을 조정할 수있다. </li><li> 용기 정렬을 확인하는 &#39;확인 편집&#39;버튼을 클릭합니다. </li><li> 관심 (ROI)의 영역을 정의하려면 &#39;설정 ROI 작물에 대한&#39;버튼을 클릭합니다. 정렬 된 이미지가 팝업 창에 표시됩니다. 이미지에 직사각형 목표를 조정하고 두 번 투자 수익 (ROI)을 확인합니다. 이미지 자르기가 필요하지 않은 경우이 단계를 건너 뜁니다. 참고 : 전용 용기로부터의 CFL 폭을 분석 할 수있는 ROI에서 하나의 용기를 포함한다. 필요한 경우, 원래의 형태로 이미지를 복원 할 &#39;재설정 이미지&#39;버튼을 클릭합니다. </li><li> 클릭9 &#39;&#39;(BMP &#39;형식 연속 비트 맵 이미지를 8 비트 그레이 스케일)에 모든 편집 된 비디오 프레임을 추출 버튼&#39;이미지의 압축을 풉니 다. 추출 된 이미지는 선택된 비디오 파일과 동일한 이름을 가진 폴더에 있습니다. </li></ol></li><li> CFL 폭 측정 <ol><li> MATLAB을 열고 &#39;CFL_measure.m&#39;파일을 실행합니다. </li><li> 추출 된 이미지가 들어있는 폴더를 선택 &#39;폴더 선택&#39;을 클릭합니다. </li><li> 이미지가 들어있는 폴더를 클릭하고 &#39;폴더 선택&#39;을 클릭합니다. 폴더의 첫 번째 이미지 프레임을로드하고 &#39;이미지 히스토그램&#39;패널에서의 회색 강도 히스토그램과 함께 &#39;그레이 스케일 이미지&#39;패널에 표시됩니다. </li><li> 분석, 그렇지 않으면 제 1 이미지 프레임이 선택 될을 수행하는리스트 박스에서 원하는 영상 프레임을 선택한다. </li><li> 위치에 결정되는 이미지의 내부 용기 벽을 식별하는 &#39;선박 벽 찾기&#39;를 클릭 곳어두운 빛 강도 프로파일 피크 천이 두 픽셀 위에 점등한다. </li><li> &#39;소금과 후추&#39;소음을 줄이기 위해 이미지에 중간 필터를 적용하는 &#39;중간 필터&#39;를 선택합니다. </li><li> 이미지 대비를 강화하기 위해 디지털 이미지의 강도를 조절하는 &#39;자동 명암 조정&#39;을 선택합니다. </li><li> τ 위의 그레이 레벨 (CFL), 그리고 τ 아래의 그레이 레벨 (RBC 코어) 블랙 픽셀 화이트 픽셀 - 두 개의 클래스로 계조를 분할하는 자동 임계 값 (τ)을 결정 목록 상자에서 임계 알고리즘을 선택합니다. 참고 : 자동 - 임계 알고리즘 중 어느 것도 적절한 이미지 임계 값을 제공하지 않는 경우 다른 방법으로, 수동 임계 값을 사용합니다. &#39;수동&#39;라디오 버튼을 클릭하고 수동 임계 값을 정의하는 슬라이더를 조정합니다. </li><li> (해상도는 CFL 폭의 공간 변화를 측정하고 &#39;픽셀 해상도&#39;상자에 픽셀 해상도를 입력하려면이 실험 장치와 0.42 μm의 / 픽셀)이었다. </li><li> CFL 폭의 공간 변화를 얻기 위해 &#39;계산&#39;버튼을 클릭합니다. 표로 형식으로 CFL 폭 데이터를 내보내려면 &#39;내보내기 .CSV&#39;을 클릭합니다. </li><li> 프레임 속도 정보, 선박 따라 특정 분석 라인의 CFL 폭의 시간적 변화를 측정하고 &#39;시간 변화&#39;라디오 버튼을 클릭하고 입력하려면 (이 실험 장치에서 사용되는 프레임 속도를 3000 프레임 / 초였다). </li><li> 각각 &#39;프레임 시작&#39;과 &#39;마지막 프레임&#39;상자의 첫 번째 프레임과 분석을위한 이미지의 마지막 프레임을 입력합니다. </li><li> &#39;분석 선&#39;슬라이드 막대를 밀어 혈관을 따라 분석 라인의 위치를 ​​선택합니다. &#39;그레이 스케일 이미지&#39;와 &#39;바이너리 이미지&#39;에 모두 설명되어 분석 라인의 위치를 ​​확인합니다. </li><li> CFL 폭의 시간적 변화를 얻기 위해 &#39;계산&#39;을 클릭합니다. CLICK &#39;내보내기 .CSV&#39;는 표로 형식으로 CFL 폭 데이터를 내보낼 수 있습니다. </li></ol></li></ol>

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저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.

CFL 폭의 측정은 미세 순환의 혈류 역학의 이해에 필수적이다. 특히, CFL 폭의 측정은 장간막 6에서 수행되어, 24, 25 microcirculations 대뇌를 spinotrapezius. 생체 CFL 폭의 측정은 종래의 녹화 된 비디오 프레임의 수동 검사 추정치로 제한 하였다. 수동 측정은 시각 RBC 코어 및 용기의 벽 (15, 16)의 경계를 식별하기 전에 몇 개의 연속적인 비디오 프레임의 평균화가 필요했다. 또 다른 연구에서, 형광 염료 (FITC)가 적혈구 -labelled 및 로다 B의 isothiocynate은 (RITC) 표지 된 플라즈마는 고양이 대뇌 미세 혈관 (25)의 평균 CFL 폭을 결정하는 데 사용 하였다. 이러한 이전의 측정 방법은 매우 시간 소모적이며, CFL 위스콘신의 공간 및 시간 해상도를 제한하는 형광 표식에 대한 추가 단계가 필요DTH 측정. 대조적으로, 효과적인 이미지 ...

생체 내 동물 연구는 인간의 생리학과 병리학을 이해하기 위한 기초 과학에 중요한 역할을 합니다. 특히, 생체 내 미세혈류역학 연구는 혈액의 비정상적인 유변학적 상태에 의해 변경되는 미세순환 기능의 잠재적 손상을 설명할 수 있습니다. 이전의 많은 미세혈류역학 연구1에서는 미세혈관 혈류를 시각화하기 위해 쥐 크레마스터 근육 모델을 사용했습니다. 크레마스터 근육(cremaster muscle)은 고환을 둘러싸고 있는 줄무늬 근육의 얇은 층입니다. 따라서 근육의 혈류는 외과적 노출을 통해 트랜스 조명 현미경으로 시각화할 수 있습니다. 이를 통해 형광제나 조영제를 사용하지 않고도 생체 내 혈류 이미지를 획득할 수 있습니다. 또한, 복부 대동맥 폐색으로 상류 혈류를 감소시킴으로써 근육 네트워크의 전체 혈액 관류를 조절할 수 있습니다2. 이러한 장점으로 인해 cremaster 근육 모델은 미세혈관1,3에서 무세포층(CFL)의 형성을 조사하는 데 널리 사용되었습니다. 
CFL 폭은 미세순환에서 두드러진 혈역학적 매개변수로, 미세순환 기능을 조절하는 데 중요한 역할을 하기 때문에 큰 관심을 받고 있습니다. CFL은 적혈구(RBC)가 흐름 중심을 향한 전단 유도 횡방향 내향 이동에 의해 형성됩니다4. 결과적으로, 이러한 이동은 혈관 벽 근처의 적혈구를 고갈시켜 결국 cell-free plasma layer를 생성하게 됩니다. 따라서, 두정엽 CFL은 자연적으로 적혈구 코어에서 조직으로의 산소(O2) 전달과 적혈구5,6에 의한 산화질소(NO)의 소거에 대한 확산 장벽이 됩니다. 또한, NO의 생산은 CFL 폭7,8의 동적 변화에 의해 조절될 수도 있습니다. 따라서 미세순환에서 혈류를 더 잘 이해하기 위해서는 가스 수송과 미세순환에서 항상성 조절에서 CFL의 역할을 완전히 확인해야 합니다. 최근 연구는 미세순환9-12에서 CFL의 혈류역학 및 가스 수송 기능을 연결하는 데 중점을 두었습니다. 또한, 별도의 연구 세트에서는 RBC 응집체의 병리학적 상승이 CFL 형성을 조절하는 방법과 조직에서 O2 및 NO 생체 이용률에 미치는 영향을 조사했습니다13,14. 
CFL의 역할은 혈관 직경에 대한 CFL 너비의 상대적 크기가 두드러지는 미세 순환에서 더욱 중요해집니다. 이를 위해서는 생체 내 혈류에서 CFL을 정량화하는 효과적인 접근 방식이 필요합니다. 특히, 이미지 획득과 이미지 분석은 CFL 폭 측정의 정확도를 결정하는 두 가지 핵심 구성 요소입니다. 조직 혈류의 성공적인 시각화는 동물 모델의 적절한 수술 준비가 선행되어야 합니다. 또한, 대부분 인적 오류에 의해 유발되는 기존 수동 측정의 한계를 극복하기 위해 적절한 이미지 분석 기술이 필요합니다15,16. 디지털 이미지 처리를 위한 광학 계측 및 컴퓨팅 성능의 발전으로 이제 CFL 폭17-19를 보다 정확하고 일관되게 측정할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 이미지 기반인 이러한 측정의 정확도는 여전히 궁극적으로 이미지의 품질에 달려 있습니다.
따라서 본 연구에서는 in vivo CFL 폭 측정에 영향을 미치는 요인을 탐구합니다. 우리는 특히 쥐 크레마스터 근육의 세동맥에서 CFL 너비를 측정하기 위한 수술 준비 및 디지털 이미지 분석을 시연하는 데 중점을 두었습니다.

<table><tbody><tr><td>생체 내 현미경</td><td>올림푸스</td><td>BX51WI</td><td>장비</td></tr><tr><td>고속 카메라</td><td>Photron</td><td>1024PCI</td><td>장비</td></tr><tr><td>블루 필터</td><td>HOYA</td><td>B390</td><td>장비</td></tr><tr><td>압력 센서 및 바이오팩 시스템</td><td>Biopac 시스템</td><td>TSD104A, MP100</td><td>장비</td></tr><tr><td>온도 조절기</td><td>Shimaden</td><td>SR 1</td><td>장비</td></tr><tr><td>플라즈마 라이트 A</td><td>Baxter</td><td>NDC : 0338-0221</td><td>37 &deg에서 따뜻하게; 사용 전 C 수조</td></tr><tr><td>식염수 0.9%</td><td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heparin (5,000 IU/ml)</td><td>LEO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE-10 폴리에틸렌 튜브</td><td>Becton Dickinson</td><td>427400.024</td><td>" OD x .011" ID&nbsp;</td></tr><tr><td>PE-50 폴리에틸렌 튜브</td><td>Becton Dickinson</td><td></td> <td>427411.038" OD x .023" ID</td></tr><tr><td>PE-205 폴리에틸렌 튜브</td><td>Becton Dickinson</td><td></td> <td>427446.082" OD x .062" ID</td></tr><tr><td>2-0 비흡수성 실크 봉합사</td><td>Deknatel</td><td>113-S</td><td></td></tr><tr><td>5-0 비흡수성 실크 봉합사</td><td>Deknatel</td><td>106-S</td><td></td></tr><tr><td>물 순환 가열 패드</td><td>Gaymar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>수조</td><td>Fisher Scientific</td><td>Isotemp 205</td><td>장비</td></tr><tr><td>멸균 면 거즈&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-415-468</td><td></td></tr><tr><td>면봉 애플리케이터</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-124</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 집게</td><td>Kent Scientific</td><td>INS14188</td><td>수술 기구</td></tr><tr><td>마이크로 해부 겸자</td><td>Kent Scientific</td><td>INS15915</td><td>수술 기구</td></tr><tr><td>아이리스 집게 1 x 2 치아</td><td>Kent Scientific</td><td>INS15917</td><td>수술 악기</td></tr><tr><td>혈관 캐뉼레이션 겸자</td><td>Kent Scientific</td><td>INS500377</td><td>수술 기구</td></tr><tr><td>마이크로 가위</td><td>Kent Scientific</td><td>INS14177</td><td>수술 기구</td></tr><tr><td>아이리스 가위 Kent</td><td>Scientific</td><td></td><td>INS14225 수술 기구</td></tr><tr><td>혈관 클립</td><td>Kent Scientific</td><td>INS14120</td><td>수술 기구</td></tr><tr><td>쌍둥이 자리 소작 시스템</td><td>Braintree Scientific</td><td>GEM 5917</td><td>수술 기구</td></tr></tbody></table>

쥐 cremaster 근육의 세동맥의 셀이없는 계층의 시각화 및 정량화

Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle

cell-free layer는 적혈구가 없는 미세혈관 흐름의 두정엽장층으로 정의됩니다. in vivo cell-free 층 너비와 시공간 변화의 측정은 미세순환의 혈류역학에 대한 포괄적인 이해를 제공할 수 있습니다. 이 연구에서는 고속 비디오 카메라와 결합된 생체 내 현미경 시스템을 사용하여 생체 내 세동맥의 cell-free 층 너비를 정량화했습니다. Sprague-Dawley 쥐의 크레마스터 근육은 혈류를 시각화하기 위해 외과적으로 외부화되었습니다. cell-free layer width의 이미지 처리 및 분석을 자동화하기 위해 맞춤형 이미징 스크립트도 개발되었습니다. 이 접근 방식을 사용하면 이전의 수동 측정보다 더 일관되게 시공간 변화를 정량화할 수 있습니다. 그러나 측정의 정확도는 부분적으로 파란색 필터의 사용과 적절한 임계값 알고리즘의 선택에 따라 달라집니다. 구체적으로, 블루 필터를 사용하거나 사용하지 않고 획득한 이미지의 대비와 품질을 평가했습니다. 또한 5가지 이미지 히스토그램 기반 임계값 적용 알고리즘(Otsu, 최소값, intermode, 반복 선택 및 퍼지 엔트로피 임계값 적용)을 비교하고 cell-free 레이어 너비 결정의 차이점을 설명했습니다.

생체 내에서 CFL의 시각화 동물의 수술 준비에 크게 의존한다. 과도한 혈액 손실 또는 확장 수술 시간은 충격과 혈류 수차 동물 대상이된다. 가열 패드뿐만 아니라 수술 실험 기간 동안 맞춤형 플랫폼을 사용하는 조직의 유지 온도는 래트의 생리적 조건을 유지하기위한 중요하다. 현미경 시스템에서, 100 W 할로겐 램프를 사용하여 식별 할 수있는 조직 손상도 실험의 끝에서 관찰되지 않았다. 도 2a는 CFL의 RBC 코어와 내부 용기 벽 (도 2c) 사이에 관찰 될 수 래트 cremaster 근육에서 분지 세동맥을 통한 전형적인 RBC 흐름을 나타낸다. 실험 기간 동안 이들 구성 요소 사이의 적절한 콘트라스트 CFL 폭 측정의 정확성을 보장하기위한 중요하다. 이미지 분석의 초기 단계가 포함내부 용기 벽의 검출. 용기에 수직 분석 라인을 따라 광 강도 프로파일을 취득하여, 위치는 다크 행 천이 개의 화소 <...

이 연구는 in vivo cell-free layer의 시각화를 위한 rat cremaster muscle의 외과적 준비를 보여줍니다. 이 연구에서는 cell-free layer width 측정의 정확도에 영향을 미치는 상당한 요인에 대해 논의합니다.

쥐 Cremaster 근육의 세동맥의 셀이없는 계층의 시각화 및 정량화

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo ...

이 절차의 전반적인 목표는 생체 내 cell-free layer 너비의 시공간적 변화를 정량화하는 것입니다. 이 방법은 미세 혈역학 분야의 핵심 질문에 답하고, 미세 순환에서 cell-philia의 역할을 더 잘 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 생체 내 cell-philia 너비를 기존의 매우 시간이 많이 소요되었던 수동 측정 기술보다 더 일관되고 편리하게 정량화할 수 있다는 점입니다.세포 제거 층(cell-free layer)의 너비 측정을 시작하기 전에, 세포 제거 층 pre-MatLab 스크립트 파일을 실행하십시오. 그다음 파일 열기를 클릭하여 분석할 비디오 파일을 선택하고, 회전 슬라이더를 조정하여 단일 용기의 벽면을 수직으로 맞추십시오. 이때 줌 슬라이더를 사용하여 필요에 따라 확대 수준을 조정하십시오. 용기가 적절한 위치에 오면 편집 확인을 클릭한 후, ROI 설정(set ROI)을 클릭하여 관심 영역을 정의하기 위해 이미지를 크롭하십시오.정렬된 이미지가 팝업 창에 표시됩니다. 이미지 상의 직사각형 대상 영역을 필요에 따라 조정하고, 해당 영역을 더블 클릭하여 관심 영역(region of interest)을 확정하십시오. 그런 다음 Extract Images를 클릭하여 편집된 모든 비디오 프레임을 연속적인 비트맵 이미지로 추출하십시오. 추출된 이미지는 선택한 비디오 파일과 동일한 이름의 폴더에서 확인할 수 있습니다.무세포층(cell-free layer)의 너비를 측정하려면 [폴더 선택]을 클릭하고 이미지 폴더를 선택하십시오. 첫 번째 이미지 프레임이 그레이스케일 이미지 패널에 표시되며, 이에 해당하는 회색 강도 히스토그램이 이미지 히스토그램 패널에 함께 나타납니다. 목록 상자에서 분석하고자 하는 이미지 프레임을 선택한 다음, [혈관벽 찾기]를 클릭하여 이미지 내의 내부 혈관벽을 식별하십시오. 내부 혈관벽은 광강도 프로파일 피크가 2픽셀에 걸쳐 어두운 영역에서 밝은 영역으로 전환되는 지점으로 결정됩니다.솔트 앤 페퍼 노이즈(salt and pepper noise)를 줄이기 위해 이미지에 중간값 필터를 적용하려면 median filter를 체크하십시오. 이미지 대비를 높이기 위해 이미지 강도를 디지털로 조정하려면 auto-contrast를 체크하십시오. 그런 다음 리스트 박스에서 임계값 처리 알고리즘을 선택하여, 회색조 수준을 임계값 이상의 흰색 픽셀과 임계값 미만의 검은색 픽셀의 두 클래스로 나누는 임계값을 자동으로 결정하십시오.세포 제거 층(cell-free layer) 너비의 공간적 변동을 측정하려면, 픽셀 해상도 입력란에 픽셀 해상도를 입력하십시오. 그런 다음 Calculate를 클릭하여 세포 제거 층 너비의 공간적 변동을 구하고, Export. csv를 클릭하여 세포 제거 층 너비 데이터를 표 형식으로 내보내십시오.혈관을 따라 특정 분석선에서의 세포-제거층(cell-free layer) 너비의 시간적 변화를 측정하려면, Temporal Variation을 클릭하고 프레임 레이트 정보를 입력하십시오. 분석에 사용할 이미지의 첫 번째 및 마지막 프레임을 각각 start frame과 last frame 상자에 입력하십시오. 분석선 슬라이드바를 조절하여 혈관을 따라 분석선의 위치를 선택하고, 그레이스케일 및 이진 이미지 모두에 표시된 분석선의 위치를 확인하십시오.그런 다음 Calculate를 클릭하여 세포-free 층 너비의 시간적 변화를 구하고, Export. csv를 클릭하여 세포-free 층 너비 데이터를 표 형식으로 내보냅니다. 여기서는 RBC 코어와 혈관 내벽 사이에서 세포-free 층이 관찰되는 쥐의 흉골근 내 비분지 동맥을 통해 적혈구가 흐르는 전형적인 모습이 나타나 있습니다.이들 구성 요소 간의 충분한 대비는 무세포층 너비 측정의 정확도를 보장하는 데 매우 중요합니다. 이미지 분석의 초기 단계에서는 혈관 내벽을 검출하였습니다. 혈관에 수직인 분석선을 따라 빛의 강도 프로파일을 획득함으로써, 2픽셀에 걸쳐 어두운 영역에서 밝은 영역으로 전이되는 정점에서 위치를 추정하였습니다.그 후, 이미지 임계값 설정(thresholding) 알고리즘을 사용하여 RBC 코어 경계를 검출하고 CFL 너비를 계산할 수 있습니다. 세포-free 층의 적혈구들은 서로 다른 빛 투과율을 가지므로, 회색조 레벨의 차이를 두 개의 클래스로 세분화할 수 있습니다. 그러나 이미지 히스토그램의 두 피크 사이에서 정확한 임계값을 식별하는 것은 낮은 이미지 품질과 대비로 인해 제한될 수 있습니다.적혈구와 무세포층(cell-free layer) 사이의 대비를 높이기 위해 청색 필터를 사용할 수 있습니다. 이는 적혈구 중심부의 경계가 청색 필터를 사용했을 때 더 정확하게 식별된 이 이미지들에서 더욱 분명하게 나타납니다. 임계값 설정 알고리즘 또한 무세포층 너비 측정에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 서로 다른 임계값 설정 알고리즘으로 인해 적혈구 중심부 경계가 다르게 식별되어 결과적으로 무세포층 너비가 다르게 측정된 이 이미지들에서 확인할 수 있습니다.생체 내 세포-제거층(cell-free layer) 너비 측정은 이미지 품질에 매우 민감합니다. 따라서 수술을 신중하게 수행하고 적절한 광학 보조 장치를 사용하여 양질의 이미지를 얻어야 합니다. 또한, 정확하고 일관된 세포-제거층 너비 측정을 위해서는 적절한 이미지 임계값 설정(thresholding) 알고리즘을 선택하는 것이 필수적입니다.

visualization-quantification-cell-free-layer-arterioles-rat-cremaster

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

조직 준비는 시각화와 생활 엑기스의 실험 조작에 대해 설명합니다. anesthetized 남성 생쥐에서 얇고 높은 vascularized cremaster 근육이 arterioles, 모세 혈관 및 venules 포함한 microvascular 네트워크를 공부 intravital 현미경을위한 준비가되어 있습니다. 이 준비는 즉시 쥐와 햄스터에 대한 적응이다.

엑기스의 Intravital 이미징을위한 마우스 Cremaster 근육 준비

이 문서의 목적은 디지털 immunofluorescent 현미경을 사용하여 쥐 pial 동맥 조각에 에스 트로겐 수용체 - α의 immunofluorescent 감지 (ERα)를 최적화하는 방법을 설명하는 것입니다.

디지털 Immunofluorescent 현미경을 사용하여 쥐 Pial Arterioles에서 에스 트로겐 수용체 - α의 영상

cremasteric microcirculation의 postcapillary venules 디지털 intravital epifluorescence 현미경은 백혈구 - 내피 상호 작용에 대한 통찰력을 얻을 수있는 편리한...

쥐 Cremaster 근육의 국소 빈혈 reperfusion의 - 상해에서 백혈구 - 내피 상호 작용의 실시간 디지털 이미징 (IRI)

우리는 단계별 절차와 필요한 장비에 대한 설명을 포함 손쥐 spinotrapezius 근육의 소설 동맥 결합 모델을 보여줍니다. 우리는 수술과 intravital 및 공 촛점 현미경을 사용하여 혈관 네트워크 리모델링 및 기능 vasodilation에 관한 관련 결과 측정을 설명합니다.

Microvascular 기능 및 리모델링에 Arteriolar 결합의 영향을 평가하기 위해 손쥐 Spinotrapezius 모델

여기 혈관 염증 및 라이브 쥐 혈전 형성되는 동안 활성화 내피에 heterotypic 혈소판 호중구 상호 작용을 시각화하는 형광 intravital 현미경의 실험 기술을보고합니다. 이 현미경 기술은 혈관 질환의 분자 메커니즘을 연구 할 수 있고 pathophysiological 조건에 따라 pharmacologic 요원을 테스트 할 가치가 있습니다.

라이브 마우스의 혈관 염증과 혈전 형성하는 동안 활성화 내피에 Heterotypic 혈소판 - 호중구 상호 작용의 실시간 영상

마우스 M.의 cremaster 미소 순환의 intravital 현미경은 독특하고 주변 골수 줄기 세포 이동의 분석을위한 생체 모델에서 잘 표준화을 제공합니다.

주변 줄기 세포 이주의 분석을위한 마우스 Cremaster 근육에있는 미세 혈관의의 intravital 현미경

이 원고는 쥐 대뇌 저항 동맥 혈관 기능을 평가 하기 위한 비디오 현미경 검사 법 프로토콜을 체 외에 설명 합니다. 원고는 또한 레이저 도플러 Flowmetry를 사용 하 여 붙일 레이블된 lectin과 조직 관류와 microvessel 밀도 평가 하기 위한 기법을 설명 합니다.

쥐의 고립 된 저항 동맥의 비디오 현미경을 이용 하 여 혈관 제어 메커니즘의 평가

이 원고는 arterioles, electrophysiological 칼슘 이미징 및 압력 myography 연구에 사용 될 수 있는 쥐 망막에서의 격리에 대 한 간단한 프로토콜을 설명 합니다.

Ex Vivo 세포 생리학 연구에 대 한 망막 Arterioles의 절연

여기에서, 우리는 마우스 cremaster 근육의 포스트 모세관 정맥에 intravital 현미경 검사법을 수행하는 방법을 보여줍니다. 일반적으로 염증과 패혈증의 다른 모델, 특히 케모카인과 사이토 카인에 의해 유도 된 모델에 적용, 우리는 과장 된 근육 백혈구 침투를 포함하는 muscolopathies의 연구에서 그 관련성을 강조.

Intravital 현미경 검사법에 의해 평가된 마우스에 있는 Cremaster 근육의 백혈구 침투

여기에 제시된 것은 혈관 동맥이 수납 및 가압되기 때문에, 모세관 침대 및 백혈구를 포함하는 혈관 나무 구성 요소뿐만 아니라 압력을 유지하는 동맥 관류 압력 및 흐름의 전 생체 모니터링에 의해 살아있는 뮤린 심장 조직에서 관상 동맥 미세 순환을 연구하는 프로토콜이다.

마우스 심장의 모세혈관, 동맥 및 페리사이클의 동적 측정 및 이미징

대뇌 실질 세동맥으로부터의 무손상 마우스 대뇌 내피 "튜브"의 집중적 인 준비는 뇌 혈류 조절을 연구하기 위해 예시된다. 또한, 우리는 세포 내 [Ca2+] 및 막 전위의 변화를 포함한 주요 세포 신호 전달 경로의 형광 이미징 및 전기 생리학 측정을위한 내피 연구 모델의 실험 강점을 입증합니다.

마우스 뇌 실질의 동맥 내피의 분리 및 기능 분석

학습하세요 쥐 Cremaster 근육을 이용한 세동맥 세포없는 층의 시각화 및 정량화 방법을 통해 미세혈관역학 연구를 수행하는 기법입니다. 이 방법은 정확하고 일관된 측정을 가능하게 합니다.

쥐 Cremaster 근육의 세동맥의 셀이없는 계층의 시각화 및 정량화

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