쥐 Cremaster 근육의 세동맥의 셀이없는 계층의 시각화 및 정량화

이 절차의 전반적인 목표는 생체 내 cell-free layer 너비의 시공간적 변화를 정량화하는 것입니다. 이 방법은 미세 혈역학 분야의 핵심 질문에 답하고, 미세 순환에서 cell-philia의 역할을 더 잘 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 생체 내 cell-philia 너비를 기존의 매우 시간이 많이 소요되었던 수동 측정 기술보다 더 일관되고 편리하게 정량화할 수 있다는 점입니다.

세포 제거 층(cell-free layer)의 너비 측정을 시작하기 전에, 세포 제거 층 pre-MatLab 스크립트 파일을 실행하십시오. 그다음 파일 열기를 클릭하여 분석할 비디오 파일을 선택하고, 회전 슬라이더를 조정하여 단일 용기의 벽면을 수직으로 맞추십시오. 이때 줌 슬라이더를 사용하여 필요에 따라 확대 수준을 조정하십시오. 용기가 적절한 위치에 오면 편집 확인을 클릭한 후, ROI 설정(set ROI)을 클릭하여 관심 영역을 정의하기 위해 이미지를 크롭하십시오.

정렬된 이미지가 팝업 창에 표시됩니다. 이미지 상의 직사각형 대상 영역을 필요에 따라 조정하고, 해당 영역을 더블 클릭하여 관심 영역(region of interest)을 확정하십시오. 그런 다음 Extract Images를 클릭하여 편집된 모든 비디오 프레임을 연속적인 비트맵 이미지로 추출하십시오. 추출된 이미지는 선택한 비디오 파일과 동일한 이름의 폴더에서 확인할 수 있습니다.

무세포층(cell-free layer)의 너비를 측정하려면 [폴더 선택]을 클릭하고 이미지 폴더를 선택하십시오. 첫 번째 이미지 프레임이 그레이스케일 이미지 패널에 표시되며, 이에 해당하는 회색 강도 히스토그램이 이미지 히스토그램 패널에 함께 나타납니다. 목록 상자에서 분석하고자 하는 이미지 프레임을 선택한 다음, [혈관벽 찾기]를 클릭하여 이미지 내의 내부 혈관벽을 식별하십시오. 내부 혈관벽은 광강도 프로파일 피크가 2픽셀에 걸쳐 어두운 영역에서 밝은 영역으로 전환되는 지점으로 결정됩니다.

솔트 앤 페퍼 노이즈(salt and pepper noise)를 줄이기 위해 이미지에 중간값 필터를 적용하려면 median filter를 체크하십시오. 이미지 대비를 높이기 위해 이미지 강도를 디지털로 조정하려면 auto-contrast를 체크하십시오. 그런 다음 리스트 박스에서 임계값 처리 알고리즘을 선택하여, 회색조 수준을 임계값 이상의 흰색 픽셀과 임계값 미만의 검은색 픽셀의 두 클래스로 나누는 임계값을 자동으로 결정하십시오.

세포 제거 층(cell-free layer) 너비의 공간적 변동을 측정하려면, 픽셀 해상도 입력란에 픽셀 해상도를 입력하십시오. 그런 다음 Calculate를 클릭하여 세포 제거 층 너비의 공간적 변동을 구하고, Export. csv를 클릭하여 세포 제거 층 너비 데이터를 표 형식으로 내보내십시오.

혈관을 따라 특정 분석선에서의 세포-제거층(cell-free layer) 너비의 시간적 변화를 측정하려면, Temporal Variation을 클릭하고 프레임 레이트 정보를 입력하십시오. 분석에 사용할 이미지의 첫 번째 및 마지막 프레임을 각각 start frame과 last frame 상자에 입력하십시오. 분석선 슬라이드바를 조절하여 혈관을 따라 분석선의 위치를 선택하고, 그레이스케일 및 이진 이미지 모두에 표시된 분석선의 위치를 확인하십시오.

그런 다음 Calculate를 클릭하여 세포-free 층 너비의 시간적 변화를 구하고, Export. csv를 클릭하여 세포-free 층 너비 데이터를 표 형식으로 내보냅니다. 여기서는 RBC 코어와 혈관 내벽 사이에서 세포-free 층이 관찰되는 쥐의 흉골근 내 비분지 동맥을 통해 적혈구가 흐르는 전형적인 모습이 나타나 있습니다.

이들 구성 요소 간의 충분한 대비는 무세포층 너비 측정의 정확도를 보장하는 데 매우 중요합니다. 이미지 분석의 초기 단계에서는 혈관 내벽을 검출하였습니다. 혈관에 수직인 분석선을 따라 빛의 강도 프로파일을 획득함으로써, 2픽셀에 걸쳐 어두운 영역에서 밝은 영역으로 전이되는 정점에서 위치를 추정하였습니다.

그 후, 이미지 임계값 설정(thresholding) 알고리즘을 사용하여 RBC 코어 경계를 검출하고 CFL 너비를 계산할 수 있습니다. 세포-free 층의 적혈구들은 서로 다른 빛 투과율을 가지므로, 회색조 레벨의 차이를 두 개의 클래스로 세분화할 수 있습니다. 그러나 이미지 히스토그램의 두 피크 사이에서 정확한 임계값을 식별하는 것은 낮은 이미지 품질과 대비로 인해 제한될 수 있습니다.

적혈구와 무세포층(cell-free layer) 사이의 대비를 높이기 위해 청색 필터를 사용할 수 있습니다. 이는 적혈구 중심부의 경계가 청색 필터를 사용했을 때 더 정확하게 식별된 이 이미지들에서 더욱 분명하게 나타납니다. 임계값 설정 알고리즘 또한 무세포층 너비 측정에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 서로 다른 임계값 설정 알고리즘으로 인해 적혈구 중심부 경계가 다르게 식별되어 결과적으로 무세포층 너비가 다르게 측정된 이 이미지들에서 확인할 수 있습니다.

생체 내 세포-제거층(cell-free layer) 너비 측정은 이미지 품질에 매우 민감합니다. 따라서 수술을 신중하게 수행하고 적절한 광학 보조 장치를 사용하여 양질의 이미지를 얻어야 합니다. 또한, 정확하고 일관된 세포-제거층 너비 측정을 위해서는 적절한 이미지 임계값 설정(thresholding) 알고리즘을 선택하는 것이 필수적입니다.