멀티 모달 이미징 및 비 침습적에 대한 분광학 섬유 다발 Microendoscopy 플랫폼,

이 절차의 전반적인 목표는 고해상도 구조 정보와 정량적 스펙트럼 데이터를 결합하여 인비보(in vivo) 조직의 기능적 특성을 규명하는 것입니다. 이 방법은 치료가 조직의 미세구조 및 관류에 미치는 영향을 정량화하는 것과 같이 암 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 활용될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단일 프로브를 사용하여 동일한 위치에서 이미지와 분광 데이터 모두를 수집할 수 있다는 점입니다.

이 프로브는 기존의 내시경 기술과 호환되므로, 본 기술의 응용 가능성은 위장관암 치료까지 확장됩니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사용자는 프로브 배치 시의 작은 불규칙성이 데이터 정확도에 상당한 영향을 미칠 수 있기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 저희는 고해상도 이미징 기술과 정량적 분광법을 결합하는 것의 중요성을 깨달았을 때 처음으로 이 방법의 아이디어를 얻었습니다.

구성 및 보정 과정의 복잡성으로 인해 준비 단계를 익히기가 어렵기 때문에, 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 다중 모드 마이크로 내시경의 고해상도 형광 현미경 모달리티 조립을 시작하려면, 30 millimeter 케이지 큐브에 470 nanometer 다이크로익 미러를 장착하십시오. 케이지 큐브의 전면, 우측 및 좌측에 케이지 조립 로드를 부착하십시오.

나사산이 있는 케이지 플레이트에 응력 제거 리테이닝 링을 부착하고, 리테이닝 링에 렌즈 튜브를 나사로 고정합니다. 첫 번째 케이지 플레이트와 정렬하여 렌즈 튜브에 또 다른 케이지 플레이트를 부착합니다. 다음으로, 직각 거울 마운트에 UV 강화 알루미늄 거울을 고정합니다.

거울 마운트 전면에 로드 4개를 부착하고, 마운트 우측면에 로드 2개를 대각선으로 부착합니다. 케이지 큐브의 좌측면에 렌즈 튜브 어셈블리를 밀어 넣습니다. 거울 마운트 어셈블리의 우측면을 렌즈 튜브 어셈블리에 연결합니다.

Z축 이동 마운트를 어셈블리의 오른쪽에 밀어 넣습니다. 10x 색수차 보정 대물렌즈를 이동 마운트에 부착합니다. 다음으로, XY축 이동 렌즈 마운트에 파이버 어댑터 플레이트를 고정합니다.

대물렌즈 앞의 어셈블리에 마운트를 밀어 넣습니다. 고정 링을 사용하여 적절한 여기 필터와 방출 필터를 렌즈 튜브에 고정합니다. 여기 필터 렌즈 튜브를 케이지 큐브 전면에 나사로 조여 고정합니다.

그리고 방출 필터 렌즈 튜브를 직각 거울 마운트 앞부분에 끼웁니다. 에폭시를 사용하여 455 nanometer LED를 들뜸 필터 앞의 케이지 플레이트에 부착합니다. 각 필터 렌즈 튜브 앞에 케이지 플레이트를 밀어 넣습니다.

리테이닝 링을 사용하여 색지움 이중트렛 튜브 렌즈를 다른 렌즈 튜브에 고정하며, 이때 렌즈 외측의 화살표가 렌즈 튜브의 외측 나사산 방향을 향하도록 합니다. 튜브 렌즈를 왼쪽 케이지 플레이트에 부착하고, 튜브 렌즈 앞에 또 다른 케이지 플레이트를 배치합니다. 응력 제거 리테이닝 링을 사용하여 USB 단색 카메라를 케이지 플레이트에 부착합니다.

하위 확산 반사 분광법 모달리티 조립을 시작하려면, 에폭시를 사용하여 나사산 케이지 플레이트를 텅스텐 할로겐 광원 전면에 부착하십시오. 케이지 플레이트에 4개의 케이지 조립 로드를 삽입하고 Z축 이동 마운트를 로드에 밀어 넣습니다. Z축 이동 마운트에 20x 색수차 보정 대물렌즈를 나사로 고정하십시오.

파이버 어댑터 플레이트를 XY축 이동 마운트에 연결하고, 대물렌즈 앞의 어셈블리에 마운트를 밀어 넣습니다. 마지막으로, 적절한 장착 장치를 사용하여 두 어셈블리를 광학 테이블 위에 서로 가깝게 고정합니다. 광원-검출기 간격 전환 장치를 제작하려면, 외부 나사산이 있는 SMA 파이버 어댑터 플레이트를 알루미늄 모터 암에 나사로 고정하십시오.

모터 암 어댑터를 모터 암 뒷면에 부착합니다. 그 다음, 스테퍼 모터를 알루미늄 모터 하우징에 나사로 고정합니다. 모터 암 어셈블리를 모터 로드에 끼운 후 고정 나사를 조입니다.

다음으로, 광스위치에 파이버 어댑터 플레이트 3개를 나사로 고정하고, 그 위에 페이스 플레이트를 나사로 고정합니다. 스텝 모터 로드를 광스위치의 중앙 구멍에 통과시켜 끼웁니다. 무납땜 빨간색 브레드보드의 중심선을 가로질러 스텝 모터 드라이버를 배치합니다.

드라이버를 적절한 전원 공급 장치 및 스테퍼 모터에 연결합니다. 광스위치를 광학 테이블에 고정합니다. 550 µm 0.22 NA 패치 케이블을 모터 암에 부착합니다.

다른 쪽 끝을 USB 분광계에 연결합니다. 광섬유 프로브를 연결하려면, 중앙의 1 millimeter 이미지 광섬유 케이블을 고해상도 형광 현미경 모달리티 어셈블리에 부착하십시오. 왼쪽의 200 micrometer 멀티모드 케이블을 하부 확산 반사 분광법 모달리티 어셈블리에 부착하십시오.

왼쪽부터 계속하여, 나머지 멀티모드 케이블을 광 스위칭 장치의 왼쪽, 중간, 오른쪽 어댑터에 순서대로 연결합니다. 실험을 위한 보정을 시작하려면 모든 USB 주변 기기를 컴퓨터에 연결하십시오. 모든 기기의 전원을 켜고 텅스텐 할로겐 램프 셔터가 열려 있는지 확인하십시오.

그 다음, 실내 조명을 끄고 다른 주변 광원을 차단하십시오. 데이터 수집 소프트웨어를 실행합니다. 보정 단계로 넘어가기 전, 장비를 30분 동안 가동하십시오.

20% 확산 반사 표준물을 교정 장치의 하단 섹션에 배치합니다. 광섬유 프로브를 장치의 왼쪽 슬롯에 삽입하고, 모터 구동 광학 스위치를 왼쪽으로 설정하여 374 micrometer DS 설정을 선택합니다. 소프트웨어에서 적분 시간을 500 milliseconds로 설정합니다.

그 후, 'acquire spectrum'을 클릭하여 해당 SDS에 대한 RMAX 획득을 시작합니다. RMAX 획득이 완료되면 스펙트럼을 지정된 폴더에 저장하십시오. 텅스텐 할로겐 램프 셔터를 닫고 해당 SDS에 대한 R dark 스펙트럼을 획득합니다.

셔터를 열고, 프로브를 보정 장치의 오른쪽 슬롯으로 이동시킨 후, 모터 구동 광학 스위치를 730 µm SDS 설정의 중간 위치로 맞춥니다. 보정을 완료하기 위해 해당 SDS에 대한 RMAX 및 RDARK를 획득합니다. 먼저, 데이터 수집에 적합한 피부 영역을 결정하십시오.

Pyranine 광원으로 노란색 형광펜을 사용하여 선택한 부위를 가볍게 염색합니다. 고해상도 형광 현미경 관찰을 시작하려면 455 nanometer LED를 켜고 텅스텐 할로겐 램프의 셔터를 닫습니다. 광섬유 프로브를 피부에 가볍게 접촉시킵니다.

Pyranine으로 염색된 조직 전체에 걸쳐 프로브를 이동시켜 정단 전류의 내부 구조를 표시합니다. 소프트웨어에서 이미지 포화가 발생하지 않도록 적절한 노출 시간과 게인을 설정하십시오. 그런 다음, 이미지 획득(acquire image)을 클릭하여 정지 영상을 얻습니다.

하위 확산 반사 분광법을 위해 프로브를 제자리에 유지하십시오. 455 nm LED를 끄고 텅스텐 할로겐 램프 셔터를 여십시오. 그런 다음, 왼쪽의 374 µm SDS 설정으로 전환하십시오.

spectra 획득을 클릭하여 이 SDS에 대한 R-tissue 스펙트럼을 획득하십시오. 그런 다음, 중간 위치로 전환하여 730 µm SDS R-tissue 스펙트럼을 획득하십시오. 후처리 소프트웨어를 열고 실행을 클릭하십시오.

프롬프트가 나타나면 보정 스펙트럼, in vivo 스펙트럼 및 고해상도 형광 이미지를 선택하여 조직 이미지를 얻습니다. 고해상도 형광 현미경 모달리티는 조직 부위의 초점이 맞은 고해상도 이미지를 제공합니다. Pyranine 염색은 개별 각질형성세포의 윤곽을 보여줍니다.

후처리 소프트웨어는 하위 확산 반사 분광법 데이터를 사용하여 헤모글로빈 농도, 멜라닌 농도 및 조직 산소 포화도를 계산합니다. 이 다모드 마이크로 내시경을 사용하여 양성 멜라닌 세포 모반을 인접한 정상 피부 조직과 비교하였습니다. 멜라닌 세포 모반은 정상 조직에 비해 헤모글로빈 농도는 약간 낮고 멜라닌 농도는 약간 높은 것으로 나타났습니다.

이 기술을 완전히 익히면 적절히 수행했을 때 1시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 텅스텐 할로겐 램프를 15분 동안 예열하고, 데이터 수집 전에 반사 표준물질을 사용하여 기기를 교정하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에는 공초점 현미경이나 다광자 현미경과 같은 다른 기술을 사용하여 단백질 구조나 대사의 세포 내 변화를 탐색할 수 있습니다.

이 기술의 개발 이후, 연구자들은 화학요법에 반응하는 조직 관류와 미세구조 사이의 관계를 탐구할 수 있는 길을 열게 되었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 하이브리드 미세 내시경 영상 및 분광 장치를 구축하고 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.