Name: 조직 진단을 위한 마우스 뇌의 실시간 두 가지 색상 자극 라만 산란 영상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-01T14:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: 학습하세요 실시간 조직 진단을 위한 두 가지 색상 자극 라만 산란 현미경법으로 마우스 뇌 조직을 영상화하는 방법을. 이 기술은 조직 처리 없이 신속한 병리 분석이 가능합니다.

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본 연구는 NIH R35 GM133435 내지 D.F.에 의해 지원되었다.

<ol><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).</li>
<li>Cui, M., Zhang, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+intelligence+and+computational+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Artificial intelligence and computational pathology.</a> Laboratory Investigation. 101 (4), 412-422 (2021).</li>
<li>Freudiger, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+biomedical+imaging+with+high+sensitivity+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).</li>
<li>Orringer, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+intraoperative+histology+of+unprocessed+surgical+specimens+via+fibre-laser-based+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Rapid intraoperative histology of unprocessed surgical specimens via fibre-laser-based stimulated Raman scattering microscopy.</a> Nature Biomedical Engineering. 1, 0027(2017).</li>
<li>Ji, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((label-free+detection+of+brain+tumors+with+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy.</a> Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).</li>
<li>Hollon, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+real-time+intraoperative+brain+tumor+diagnosis+using+stimulated+Raman+histology+and+deep+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Near real-time intraoperative brain tumor diagnosis using stimulated Raman histology and deep neural networks.</a> Nature Medicine. 26 (1), 52-58 (2020).</li>
<li>Shin, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraoperative+assessment+of+skull+base+tumors+using+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Intraoperative assessment of skull base tumors using stimulated Raman scattering microscopy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 20392(2019).</li>
<li>Lu, F. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+neurosurgical+pathology+with+stimulated+Raman+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Label-free neurosurgical pathology with stimulated Raman imaging.</a> Cancer Research. 76 (12), 3451-3462 (2016).</li>
<li>Shin, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+chemical+imaging+of+breast+calcifications+in+association+with+neoplastic+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Quantitative chemical imaging of breast calcifications in association with neoplastic processes.</a> Theranostics. 10 (13), 5865-5878 (2020).</li>
<li>Fu, D., Holtom, G., Freudiger, C., Zhang, X., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperspectral+imaging+with+stimulated+Raman+scattering+by+chirped+femtosecond+lasers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Hyperspectral imaging with stimulated Raman scattering by chirped femtosecond lasers.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 117 (16), 4634-4640 (2013).</li>
<li>Figueroa, B., Hu, R., Rayner, S. G., Zheng, Y., Fu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+microscale+temperature+imaging+by+stimulated+Raman+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Real-time microscale temperature imaging by stimulated Raman scattering.</a> The Journal of Physical Chemistry Letters. 11 (17), 7083-7089 (2020).</li>
<li>Saar, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video-rate+molecular+imaging+in+vivo+with+stimulated+Raman+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering.</a> Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).</li>
<li>Hill, A. H., Hill, A. H., Manifold, B., Manifold, B., Fu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+imaging+depth+limit+of+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Tissue imaging depth limit of stimulated Raman scattering microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 11 (2), 762-774 (2020).</li>
<li>Fu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+intracellular+distribution+of+tyrosine+kinase+inhibitors+in+living+cells+with+quantitative+hyperspectral+stimulated+Raman+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Imaging the intracellular distribution of tyrosine kinase inhibitors in living cells with quantitative hyperspectral stimulated Raman scattering.</a> Nature Chemistry. 6 (7), 614-622 (2014).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+tracing+of+deuterium+for+imaging+glucose+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).</li>
<li>Tsai, P. S., et al. Principles, design, and construction of a two-photon laser-scanning microscope for in vitro and in vivo brain imaging. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTsai%2C+PS+%22In+Vivo+Optical+Imaging+of+Brain%22">In Vivo Optical Imaging of Brain</a>. Frostig, R. D., et al. , CRC Press. 113-171 (2002).</li>
<li>Francis, A., Berry, K., Chen, Y., Figueroa, B., Fu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+pathology+by+spectrally+sliced+femtosecond+stimulated+Raman+scattering+%28SRS%29+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Label-free pathology by spectrally sliced femtosecond stimulated Raman scattering (SRS) microscopy.</a> PLoS One. 12 (5), 0178750(2017).</li>
<li>Figueroa, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadband+hyperspectral+stimulated+Raman+scattering+microscopy+with+a+parabolic+fiber+amplifier+source%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Broadband hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy with a parabolic fiber amplifier source.</a> Biomedical Optics Express. 9 (12), 6116-6131 (2018).</li>
<li>Kong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+stimulated+Raman+scattering+microscopy+with+a+rapidly+tunable+optical+parametric+oscillator%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Multicolor stimulated Raman scattering microscopy with a rapidly tunable optical parametric oscillator.</a> Optics Letters. 38, 145-147 (2013).</li>
<li>He, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-phase+stimulated+Raman+scattering+microscopy+for+real-time+two-color+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Optica%22%5BJournal%5D)">Dual-phase stimulated Raman scattering microscopy for real-time two-color imaging.</a> Optica. 4 (1), 44-47 (2017).</li>
<li>Pence, I. J., Kuzma, B. A., Brinkmann, M., Hellwig, T., Evans, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-window+sparse+spectral+sampling+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Multi-window sparse spectral sampling stimulated Raman scattering microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 12 (10), 6095-6114 (2021).</li>
<li>Wei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volumetric+chemical+imaging+by+clearing-enhanced+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Volumetric chemical imaging by clearing-enhanced stimulated Raman scattering microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (14), 6608-6617 (2019).</li>
<li>Wright, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+optics+for+enhanced+signal+in+CARS+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Adaptive optics for enhanced signal in CARS microscopy.</a> Optics Express. 15 (26), 18209-18219 (2007).</li>
</ol>

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

이 프로토콜에 제시된 두 가지 색상 SRS 이미징 체계는 단색 SRS 이미징의 적절한 구현에 달려 있습니다. 단색 SRS 이미징에서 중요한 단계는 공간 정렬, 시간 정렬, 변조 깊이 및 위상 이동입니다. 두 빔을 공간적으로 결합하는 것은 이색성 거울에 의해 달성된다. 여러 스티어링 미러는 빔을 이색성 거울로 보낼 때 미세 조정에 사용됩니다. 빔이 이색성 미러와 결합되면 결합 된 빔이 IR 카드와 겹치는지 확인하는 동안 >1m 떨어진 벽쪽으로 보내기 위해 거울과 결합 된 빔 경로를 선택하여 공간 정렬을 확인할 수 있습니다. 현미경을 통한 공간 정렬에 따라, 시간적 중첩은 역반사기 기반 지연 단계로 경로 길이를 조정함으로써 수행되며, 이는 공간 정렬을 보존하는 이점이 있다. 1,040nm 암은 이 프로토콜에서 지연된 빔입니다. 지연 스테이지가 두 빔이 일시적으로 겹치도록 하는 범위를 갖지 않는 경우 시간적 중첩은 불가능합니다. 이 경우, 시간적 중첩이 지연 스캔 범위의 중간에가까운지 확인하기 위해 전체 지연 스테이지를 다른 위치로 ...

전통적인 조직 진단은 염색 프로토콜에 의존하고 광학 현미경으로 검사합니다. 병리학자가 사용하는 일반적인 염색 방법 중 하나는 H & E 염색입니다 : 헤마톡실린은 세포 핵을 자줏빛 파란색으로 염색하고 에오신 염색은 세포외 매트릭스와 세포질 분홍색을 염색합니다. 이 간단한 염색은 많은 조직 진단 작업, 특히 암 진단을위한 병리학의 황금 표준으로 남아 있습니다. 그러나 H&E 조직병리학, 특히 수술내 환경에서 사용되는 냉동 절편술은 여전히 한계가 있다. 염색 절차는 조직 매립, 절개, 고정 및 염색1과 관련된 힘든 과정입니다. 일반적인 처리 시간은 20분 이상입니다. 동결 단면화 중에 H&E를 수행하는 것은 마진 평가를 위해 3D에서 세포 특징이나 성장 패턴을 평가해야 하기 때문에 여러 섹션을 한 번에 처리할 때 더욱 어려워질 수 있습니다. 또한, 수술 내 조직학 기술은 숙련 된 기술자와 임상의가 필요합니다. 많은 병원에서 보드 인증 병리학자 수의 제한은 많은 경우에 수술 내 상담의 제약입니다. 이러한 한계는 디지털 병리학 및 인공 지능 기반 진단에 대한 빠른 개발 관심으로 완화 될 수 있습니다2. 그러나 H&E 염색 결과는 기술자의 경험에 따라 가변적이어서 컴퓨터 기반 진단2에 추가적인 과제가 있습니다.
이러한 과제는 라벨이 없는 광학 이미징 기술로 잠재적으로 해결할 수 있습니다. 이러한 기술 중 하나는 SRS 현미경 검사입니다. SRS는 동기화된 펄스 레이저(펌프 및 스토크스)를 사용하여 고효율로 분자 진동을 자극합니다3. 최근 보고서에 따르면 단백질과 지질의 SRS 이미징은 손상되지 않은 신선한 조직으로 H & E 등가 이미지 (자극 된 라만 조직학 또는 SRH라고도 함)를 생성 할 수 있으며, 이는 조직 처리의 필요성을 우회하고 진단에 필요한 시간을 크게 단축하며 수술 중 적응되었습니다4. 또한, SRS 이미징은 3D 이미지를 제공할 수 있으며, 이는 2D 이미지가 불충분할 때 진단을 위한 추가 정보를 제공한다5. SRH는 편향되지 않으며 컴퓨터 기반 진단에 쉽게 사용할 수 있는 디지털 이미지를 생성합니다. 그것은 수술 중 암 진단 및 종양 마진 분석, 특히 뇌암 6,7,8에서 가능한 해결책으로 빠르게 등장합니다. 보다 최근에, 조직의 화학적 변화에 대한 SRS 영상화는 임상의가 상이한 암 유형 또는단계 9를 계층화하는 것을 추가로 도울 수 있는 유용한 진단 정보를 제공하기 위해 제안되었다.
조직 진단 응용 분야에서 엄청난 잠재력에도 불구하고 SRS 이미징은 초고속 레이저, 레이저 스캐닝 현미경 및 정교한 검출 전자 장치를 포함하는 이미징 플랫폼과 관련된 복잡성으로 인해 광학 전문 학술 실험실로 대부분 제한됩니다. 이 프로토콜은 실시간 두 가지 색상 SRS 이미징을 위한 일반적인 펨토초 레이저 소스의 사용과 마우스 뇌 조직에서 의사 H&E 이미지의 생성을 입증하기 위한 상세한 워크플로우를 제공합니다. 프로토콜은 다음 절차를 다룹니다.
정렬 및 처프 최적화 대부분의 SRS 이미징 체계는 피코초 또는 펨토초 레이저를 여기 소스로 사용합니다. 펨토초 레이저를 사용하면 레이저의 대역폭이 라만 선폭보다 훨씬 큽니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 스펙트럼 포커싱 접근법은 펨토초 레이저를 피코초 타임 스케일로 처핑하여 좁은 스펙트럼 분해능(10)을 달성하기 위해 사용된다. 최적의 스펙트럼 분해능은 시간적 처프(그룹 지연 분산 또는 단지 분산이라고도 함)가 펌프와 스토크스 레이저에 대해 적절하게 정합될 때만 달성됩니다. 고도로 분산된 유리 막대를 사용하여 레이저 빔의 분산을 최적화하는 데 필요한 정렬 절차 및 단계가 여기에서 시연됩니다.
주파수 보정 스펙트럼 포커싱 SRS의 장점은 펌프와 스토크스 레이저 사이의 시간 지연을 변경하여 라만 여기를 신속하게 조정할 수 있다는 것입니다. 이러한 튜닝은 레이저 파장 튜닝에 비해 빠른 이미징과 신뢰할 수 있는 스펙트럼 수집을 제공합니다. 그러나 여기 주파수와 시간 지연 사이의 선형 관계에는 외부 교정이 필요합니다. 알려진 라만 피크를 갖는 유기 용매는 스펙트럼 포커싱 SRS를 위해 라만 주파수를 교정하는데 사용된다.
실시간 두 가지 색상 이미징 조직 진단 응용 프로그램에서 이미징 속도를 높여 대형 조직 표본을 분석하는 데 필요한 시간을 단축하는 것이 중요합니다. 지질과 단백질의 동시 이색 SRS 이미징은 레이저 또는 시간 지연을 조정할 필요성을 없애고, 이는 이미징 속도를 두 배 이상 증가시킨다. 이것은 새로운 직교 변조 기법 및 록인 증폭기(11)를 이용한 이중 채널 복조를 사용함으로써 달성된다. 이 백서에서는 직교 변조 및 이중 채널 이미지 획득을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.
에피 모드 SRS 이미징 현재까지 보여진 SRS 이미징의 대부분은 전송 모드에서 수행된다. 에피모드 영상화는 조직(12)으로부터 후방 산란된 광자를 검출한다. 병리학 적 적용의 경우, 수술 표본은 상당히 클 수 있습니다. 전송 모드 이미징의 경우, 조직 절편화가 종종 필요하며, 이는 바람직하지 않게 추가 시간이 필요합니다. 대조적으로, epi-mode 이미징은 손상되지 않은 수술 표본과 함께 작동 할 수 있습니다. 동일한 목적이 후방 산란광을 수집하는 데 사용되기 때문에 전송 이미징에 필요한 높은 수치 조리개 응축기를 정렬할 필요도 없습니다. Epi-mode는 또한 뼈와 같이 조직 절편이 어려울 때 유일한 옵션입니다. 이전에 우리는 뇌 조직의 경우 에피 모드 이미징이 2mm13의 조직 두께에 대해 우수한 이미징 품질을 제공한다는 것> 입증했습니다. 이 프로토콜은 편광 빔 스플리터 (PBS)를 사용하여 조직에 의해 탈분극 된 산란 광자를 수집합니다. 맞춤형 검출기 어셈블리(12)의 복잡성을 희생시키면서 환형 검출기로 더 많은 광자를 수집할 수 있다. PBS 접근 방식은 구현이 더 간단하며 (형광과 유사), 표준 광 다이오드는 이미 전송 모드 감지에 사용되고 있습니다.
의사 H&E 이미지 생성 두 가지 색상의 SRS 이미지가 수집되면 H&E 염색을 시뮬레이션하기 위해 다시 채색할 수 있습니다. 이 논문은 병리학 적용을 위해 지질 및 단백질 SRS 이미지를 의사 H & E SRS 이미지로 변환하는 절차를 보여줍니다. 실험 프로토콜은 고품질 SRS 이미지를 생성하는 데 필요한 중요한 단계를 자세히 설명합니다. 여기에 표시된 절차는 조직 진단에 적용 가능할 뿐만 아니라 약물 이미징 및 대사 영상(14,15)과 같은 많은 다른 하이퍼스펙트럼 SRS 이미징 응용에도 적용될 수 있다.
일반 시스템 요구 사항 이 프로토콜의 레이저 시스템은 2개의 동기화된 펨토초 레이저 빔을 출력할 수 있어야 합니다. 시스템은 이상적으로 레이저 빔 중 하나의 넓은 파장 튜닝을 위한 광학 파라메트릭 발진기(OPO)를 갖추고 있습니다. 이 프로토콜의 설정은 80MHz의 반복률로 두 개의 레이저(1,040nm에서 하나의 고정 빔과 680nm ~ 1,300nm의 OPO 기반 조정 가능 빔 1개)를 출력하는 상용 레이저 시스템 Insight DS+를 사용합니다. 주요 현미경 제조업체 또는 가정용 레이저 스캐닝 현미경을 SRS 이미징에 사용할 수 있습니다. 활용 된 현미경은 상업용 직립 현미경 프레임 위에 구축 된 직립 레이저 스캐닝 현미경입니다. 한 쌍의 5mm 갈보 거울이 레이저 빔을 스캔하는 데 사용됩니다. 가정용 레이저 스캐닝 현미경을 채택하기로 선택한 사용자는 레이저 스캐닝 현미경(16)의 구축을 위해 이전에 공개된 프로토콜을 참조한다.

<table><tbody><tr><td>100 mm 무채색 렌즈</td><td>THORLABS</td><td>AC254-100-B</td><td>광대역, 650 - 1,050 nm, 무채색 렌즈 초점 거리, 100 mm</td></tr><tr><td>20 MHz 대역통과 필터</td><td>Minicircuits</td><td>BBP-21.4+</td><td>Lumped LC 대역 통과 필터, 19.2 - 23.6 MHz, 50 &Omega;</td></tr><tr><td>200 mm 무채색 렌즈</td><td>THORLABS</td><td>AC254-200-B</td><td>광대역, 650 - 1,050 nm, 무채색 렌즈 초점 거리, 200 mm</td></tr><tr><td>무채색 반파장판</td><td>유니온 광학</td><td>WPA2210-650-1100-M25.4</td><td>광대역 반파장판</td></tr><tr><td>무채색 쿼터 웨이브 플레이트</td><td>유니온 광학</td><td>WPA4210-650-1100-M25.4</td><td>광대역 쿼터 웨이브 플레이트</td></tr><tr><td>빔 샘플러</td><td>THORLABS</td><td>BSN11</td><td>10:90 Plate Beamsplitter</td></tr>, <tr><td>Dichroic Mirror</td><td>THORLABS</td><td>DMSP1000</td><td>중심 파장이 약 1,000nm인 다른 이색성을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>DMSO(Dimethyl sulfoxide)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>472301</td><td>라만 이동 교정용 용매. 알려진 라만 피크를 가진 다른 용매를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>전기 광학 진폭 변조기</td><td>THORLABS</td><td>EO-AM-NR-C1</td><td>직교 변조 및 이중 채널 이미징에는 두 개의 EOM이 필요합니다. 더 낮은 구동 전압을 사용할 수 있도록 공진 버전을 사용하는 것이 좋습니다.</td></tr><tr><td>거짓 H& E 염색 스크립트</td><td>Matlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining 팬아웃 버퍼</td><td>PRL-414B</td><td>펄스 연구소</td><td>1:4 TTL/CMOS 팬아웃 버퍼 및 라인 드라이버, EOM 구동 주파수 및 잠금</td></tr> 고속 <tr><td>포토다이오드</td><td>THORLABS</td><td>DET10A2</td> Si 검출기에 대한 참조 생성, <td>1ns 상승 시간</td></tr><tr><td>주파수 분배기</td><td>PRL-220A</td><td>펄스 연구소</td><td>TTL 주파수 분배기(f/2, f/4, f/8, f/16), 레이저 출력에서 20MHz 생성용.</td></tr><tr><td>고분산 유리 막대</td><td>유니온 광학</td><td>CYLROD01</td><td>고분산 H-ZF52A 막대 렌즈 120 mm, SF11 막대 렌즈 100 mm</td></tr><tr><td>Insight DS+</td><td>Newport</td><td></td><td>레이저 시스템은 두 개의 동기화 펄스 레이저(1, 040 nm에서 하나의 고정 빔과 680-1,300 nm 범위의 조정 가능한 빔)를 80 MHz의 반복률로 출력할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>락인앰플리파이어</td><td>리퀴드 인스트루먼트</td><td>Moku Lab</td><td>락인앰플리파이어는 포토다이오드에서 SRS 신호를 추출합니다. 취리히 인스트루먼트 HF2LI 또는 이와 유사한 기기도 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>미러</td><td>THORLABS</td><td>BB05-E03-10</td><td>광대역 유전체 미러, 750 - 1,100 nm. 은색 거울도 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>전동 지연 스테이지</td><td>Zaber</td><td>X-DMQ12P-DE52</td><td>펌프와 스톡스 레이저의 시간적 겹침을 미세 제어하기 위한 지연 스테이지. 다른 전동 스테이지가 작동해야 합니다.</td></tr><tr><td>오일 침지 응축기</td><td>니콘</td><td>CSC1003</td><td>1.4 NA. NA>1.2가 있는 다른 콘덴서를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>오실로스코프</td><td>Tektronix</td><td>TDS7054</td><td>400MHz 대역 이상의 다른 오실로스코프가 작동해야 합니다.</td></tr><tr><td>위상 시프터</td><td>SigaTek</td><td>SF50A2</td><td>변조 주파수의 위상 이동용</td></tr><tr><td>포토다이오드</td><td>Hamamatsu Corp</td><td>S3994-01</td><td>넓은 면적(10 x 10cm2)의 실리콘 PIN 다이오드. 면적이 넓고 정전 용량이 낮은 다른 다이오드를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>편광 빔 스플리터</td><td>유니온 옵틱</td><td>PBS9025-620-1000</td><td>광대역 편광 빔 스플리터</td></tr><tr><td>굴절률 데이터베이스</td><td></td><td></td><td>refractiveindex.info</td></tr><tr><td>Retro-reflector</td><td>Edmund Optics</td><td>34-408</td><td>BBAR 직각 프리즘. 다른 프리즘 또는 역반사체를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>RF 전력 증폭기</td><td>Minicircuits</td><td>ZHL-1-2W+</td><td>Gain Block, 5 - 500 MHz, 50 &Omega;</td></tr><tr><td>스캔 미러</td><td>Cambridge Technologies</td><td>6215H</td><td>은색 코팅이 된 5mm 미러 세트를 사용했습니다</td></tr>. <tr><td>ScanImage</td><td>Vidrio</td><td>ScanImage Basic</td><td>레이저 스캐닝 현미경 제어 소프트웨어</td></tr><tr><td>Shortpass Filter</td><td>THORLABS</td><td>FESH1000</td><td>25.0mm 프리미엄 Shortpass Filter, 차단 파장: 1,000nm. 스톡스를 효율적으로 억제하기 위해서는 두 개의 필터가 필요할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>정립 현미경</td><td>Nikon</td><td>Eclipse FN1</td><td>다른 현미경 프레임을 사용할 수 있습니다. 레이저 스캐닝 현미경을 사용할 수 있는 경우 직접 사용할 수 있습니다. 그렇지 않으면 갈보 스캐너와 스캔 렌즈를 현미경에 추가해야 했습니다.</td></tr><tr><td>Water Immersion Objective</td><td>Olympus</td><td>XLPLN25XWMP2</td><td>다광자 25X 대물렌즈의 개구수는 1.05입니다. 다른 유사한 목표를 사용할 수 있습니다.</td></tr></tbody></table>

조직 진단을 위한 마우스 뇌의 실시간 두 가지 색상 자극 라만 산란 영상

Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis

자극된 라만 산란(SRS) 현미경은 조직 진단을 위한 강력한 광학 이미징 기술로 부상하고 있습니다. 최근 몇 년 동안 두 가지 색상 SRS는 헤마톡실린과 에오신(H&E)과 동등한 이미지를 제공하여 뇌암을 빠르고 안정적으로 진단할 수 있는 것으로 나타났습니다. 이러한 기능은 흥미 진진한 수술 중 암 진단 응용 프로그램을 가능하게했습니다. 조직의 두 가지 컬러 SRS 이미징은 피코초 또는 펨토초 레이저 소스로 수행 할 수 있습니다. 펨토초 레이저는 빠른 하이퍼스펙트럼 이미징과 실시간 이색 SRS 이미징을 포함한 유연한 이미징 모드를 가능하게 하는 장점이 있습니다. 처프 레이저 펄스를 사용한 스펙트럼 포커싱 접근법은 일반적으로 높은 스펙트럼 분해능을 달성하기 위해 펨토초 레이저와 함께 사용됩니다. 
두 가지 색상 SRS 수집은 직교 변조 및 잠금 감지를 통해 실현할 수 있습니다. 펄스 처핑, 변조 및 특성화의 복잡성은이 방법의 광범위한 채택을위한 병목 현상입니다. 이 기사는 에피 모드에서 마우스 뇌 조직의 스펙트럼 포커싱 SRS 및 실시간 이색 이미징의 구현 및 최적화를 입증하기 위한 상세한 프로토콜을 제공한다. 이 프로토콜은 SRS의 고속 및 분광학적 이미징 기능을 활용하는 광범위한 SRS 이미징 애플리케이션에 사용할 수 있습니다.

스펙트럼 분해능 최적화: 물질을 통한 분산은 분산 매질(길이 및 물질) 및 파장에 의해 영향을 받는다. 분산봉 길이를 변경하면 스펙트럼 분해능과 신호 크기에 영향을 미칩니다. 그것은 응용 프로그램에 따라 다르게 무게가 가질 수있는 주고받는 관계입니다. 막대는 빔 펄스를 주파수가 넓고 시간이 좁아지는 것에서 주파수가 좁고 시간이 넓어지는 것까지 뻗어 나갑니다. 그림 7은 다양한 막대 길이가 스펙트럼 분해능에 미치는 영향을 보여줍니다. 도 7A는 매우 불량한 스펙트럼 분해능을 보여준다; 이 설정에는 유리 짹짹 거리는 막대가 없으며 DMSO의 두 라만 피크는 전혀 해결되지 않습니다. 그림 7B,C에서, 유리 짹짹 막대의 수의 증가는 두 피크를 해결하기 시작한다. 마지막으로, <strong class="xfig"...

자극된 라만 산란(SRS) 현미경은 강력하고 비파괴적이며 라벨이 없는 이미징 기술입니다. 한 가지 새로운 응용 분야는 자극 라만 조직학이며, 여기서 단백질과 지질 라만 전이에서 두 가지 컬러 SRS 이미징이 의사 헤마톡실린 및 에오신 이미지를 생성하는 데 사용됩니다. 여기에서는 조직 진단을 위한 실시간 이색 SRS 이미징을 위한 프로토콜을 시연합니다.

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has ...

이 프로토콜은 스펙트럼 포커싱 SRS 현미경의 구현 및 최적화와 실시간 자극된 라만 조직학 애플리케이션에 어떻게 사용될 수 있는지를 시연할 것이다. 이 기술의 가장 큰 장점은 SRS가 조직 처리 및 염색을 필요로하지 않기 때문에 계측이 적절하게 정렬되면 샘플을 처리 할 수있는 속도입니다. 이 프로토콜은 조직학에만 국한되지 않고 다른 SRS 애플리케이션에도 적용 가능합니다.이러한 적용에는 소분자, 약물, 세포 및 조직이 포함됩니다. 먼저 펌프 빔에 무채색 렌즈 한 쌍을 설치하여 레이저 빔 크기를 시작점으로 두 배로 확대하십시오. 100 밀리미터와 200 밀리미터 렌즈를 서로 약 300 밀리미터에 놓습니다.그런 다음 펌프 빔을 두 렌즈의 중심을 통해 정렬하십시오. 다음으로 두 번째 렌즈 뒤에 거울을 놓아 빔을 두 미터 이상 떨어진 벽쪽으로 보냅니다. IR 카드로 거울에서 벽까지 빔을 추적하고 빔의 크기가 변하는지 확인하십시오.빔의 크기가 거리의 함수로 변하는 경우 빔을 시준합니다. 조정을 위해 여러 스티어링 미러와 이색성 거울을 설치하여 두 개의 레이저 빔을 결합하십시오. 펌프와 스토크스의 공간 중첩을 최적화하여 한 미터 떨어진 두 개의 서로 다른 위치에서 이색성 거울 뒤의 빔을 모니터링합니다.스티어링 미러 다음에 이색성 거울을 반복적으로 조정하여 Stokes 빔을 펌프 빔과 정렬합니다. 스캔 미러가 주차 위치에있을 때 한 쌍의 스티어링 미러를 조정하여 결합 된 빔이 레이저 스캐닝 현미경의 스캔 미러의 중앙으로 보내지는지 확인하십시오. 콘덴서 후에 초점 거리가 각각 100mm와 30mm인 다른 렌즈 쌍을 사용하여 전송된 빔을 광 다이오드에 릴레이하여 두 빔이 모두 광 다이오드 내에 포함되도록 합니다.그런 다음 두 개의 저역 통과 필터를 설치하여 변조 된 Stokes 빔을 차단하십시오. 빔 샘플러를 스토크스 빔 경로에 배치하여 빔의 10%를 집어 들고 빠른 광 다이오드로 보내 80메가헤르츠 펄스 트레인을 감지합니다. 팬아웃 버퍼의 출력 중 하나를 가져와 대역 통과 필터로 필터링하여 20메가헤르츠 정현파를 얻습니다.그런 다음 RF 감쇠기를 사용하여 출력 피크 전압을 약 500밀리볼트로 피크 전압으로 조정합니다. 결과 출력을 위상 시프터로 보내면 전압 소스로 RF 위상을 미세하게 조정할 수 있습니다. 이 출력을 RF 전력 증폭기로 보내고 증폭기의 출력을 EOM에 연결합니다.Stokes 빔의 차단을 해제한 후 빔 경로에 광 다이오드를 배치하여 첫 번째 EOM의 변조 깊이를 최적화합니다. EOM 전압 및 쿼터 웨이브 플레이트를 변조 깊이가 만족스럽게 나타날 때까지 조정하십시오. 이색성 거울 뒤에 광 다이오드를 배치하여 레이저 빔을 감지합니다.스토크스 빔을 먼저 차단한 다음 오실로스코프의 펌프 펄스 피크 중 하나를 확대합니다. 수직 커서를 배치하여 이 피크의 시간적 위치를 오실로스코프로 표시합니다. 이제 펌프 빔을 차단하고 스토크스 빔의 차단을 해제하십시오.지연 단계를 변환하여 오실로스코프의 피크 위치를 이전 단계에서 표시된 위치와 일시적으로 일치시킵니다. 두 빔을 일치시키는 데 필요한 지연 거리를 계산하여 더 빠른 빔의 빔 경로를 길게하거나 느린 빔의 빔 경로를 단축시킵니다. 다음으로 DMSO 및 양면 테이프를 스페이서로서 사용하여 현미경 슬라이드 샘플을 준비하여 슬라이드와 커버슬립 사이에 샘플을 고정시킵니다.커버슬립 면이 현미경 대물렌즈를 향하도록 현미경 위에 샘플을 놓고 밝은 장 조명 아래에서 I 조각의 샘플을 관찰합니다. 유리 테이프 인터페이스에서 기포의 상단 및 하단 레이어에서 샘플의 초점을 찾은 다음 테이프의 두 레이어 사이에 초점을 이동합니다. 다음으로 조정 가능한 빔 출력을 798나노미터로 설정합니다.콘덴서의 광학 처리량에 따라 목표 초점에서 펌프 및 스토크스 빔에 대해 각각 약 40밀리와트로 광 전력을 조정합니다. 그런 다음 MATLAB에서 스캔 이미지를 열고 포커스라고 표시된 버튼을 클릭하여 스캔을 시작합니다. galvo 스캐너 앞에 스티어링 미러를 조정하여 DC 신호를 채널 원 디스플레이에 중앙에 맞춥니다.전동 지연 스테이지를 이동하고 채널 두 디스플레이에 표시된 잠금 출력을 면밀히 관찰하십시오. 마지막으로 AC 신호 강도를 최대화하기 위해 시간 지연을 조정합니다. 이색성 미러를 조정하여 SRS 신호를 AC 채널의 중앙에 맞춥니다.그런 다음 잠금 증폭기의 위상을 조정하여 신호를 최대화하십시오. 샘플 슬라이드를 현미경에 장착하고 앞서 설명한 것처럼 샘플 초점에서 두 빔의 전력을 각각 약 40 밀리와트로 조정한 후. MATLAB에서 스캔 이미지를 엽니다.그 후 DMSO의 2, 913 역센티미터 라만 피크에 대응하는 지연 스테이지를 통해 스캐닝하여 최대 SRS 신호를 찾는다. DMSO의 2, 913 역센티미터 라만 피크에 대응하는 SRS 이미지를 획득한다. ImageJ에서 이미지를 열고 프레임 중앙의 작은 영역을 선택합니다.측정값 함수를 사용하여 선택한 영역에서 값의 평균 및 표준 편차를 계산합니다. 주파수 액세스 보정을 위해, DMSO의 2, 913 및 2, 994 역 센티미터 라만 피크를 커버하는 지연 스테이지 범위로 하이퍼스펙트럼 스캔을 저장하십시오. 그런 다음 하이퍼스펙트럼 데이터 세트에 해당하는 스테이지 위치를 저장합니다.스테이지 위치에 대해 선형 회귀를 수행하고 라만 시프트를 2, 913 및 2, 994 역 센티미터로 이동합니다. 선형 회귀 방정식을 사용하여 지연 위치를 해당 라만 주파수로 변환합니다. 스펙트럼 분해능의 교정을 위해, 막대의 삽입으로 인해 증가된 광학 경로 길이로 이전 위치를 기준으로 스테이지 위치를 추정하십시오.유리 막대가 추가될 때 빔의 약간의 편차로 인해 빔의 공간 중첩을 다시 정렬합니다. 편광 빔 스플리터, 쿼터 웨이브 플레이트 및 두 번째 EOM을 첫 번째 EOM 이후의 흡수 빔 경로에 설치합니다. 두 번째 EOM에 입력된 신호를 뽑은 다음 신호 입력을 첫 번째 EOM에 연결하고 전원을 켭니다.첫 번째 EOM을 통해 빔을 전송하여 스토크스 빔을 20메가헤르츠로 변조합니다. 첫 번째 EOM의 기울기와 위치를 조정하여 빔이 EOM 크리스탈을 통해 중심이 되도록 합니다. 양면 테이프, 현미경 슬라이드 및 커버 유리로 조직 슬라이드 샘플을 준비하십시오.시료를 현미경 표면에 놓고 커버슬립 면이 현미경 목표를 향하도록 합니다. 에피 모드 SRS 이미징의 경우, 빔이 현미경으로 들어가기 전에 반파 플레이트를 설치하여 현미경으로 들어가는 빔의 편광을 변경하십시오. 편광 빔 스플리터를 목표 위에 배치하여 탈분극된 후방 반사 빔이 검출기에 도달할 수 있도록 합니다.다음으로, 75mm 아크로메이트 렌즈와 30mm 비구면 렌즈를 사용하여 물체의 뒤쪽 조리개에서 사진 검출기로 뒤쪽에 흩어져있는 광자를 릴레이하십시오. 검출기를 장착하여 편광 빔 스플리터에 의해 지시되는 후방 산란광을 수집한다. 그런 다음 필터를 설치하여 변조 된 빔이 검출기에 들어 가지 않도록하십시오.막대 길이를 변경하면 스펙트럼 분해능에 영향을 미칩니다. 유리 짹짹 막대를 사용하지 않으면 DMSO의 두 라만 피크가 전혀 해결되지 않습니다. 유리 짹짹 막대의 수가 증가하면 만족스러운 지점에서 두 개의 피크가 해결되기 시작합니다.정합된 처핑은 두 피크를 모두 해결하며 스테이지 위치를 주파수로 교정하는 데 사용할 수 있습니다. DMSO 스펙트럼을 이미지화하기 위해 사용되는 직교 편광의 두 시간 지연 펄스 트레인은 허용 가능한 변조 깊이와 시간적 분리를 갖는 SRS 여기 사이의 시간 지연을 보여준다. 대조적으로, 불량한 두 가지 컬러 SRS 위상 이동은 반전 또는 음의 피크를 발생시킨다.생체외 마우스 뇌 조직의 2, 850 및 2, 930 역 센티미터에서의 실시간 2색 SRS 영상화가 여기에 도시되어 있다. 원시 지질 및 단백질 이미지는 지질 및 단백질 기여를 묘사하는 단일 이미지를 생성하도록 컬러 코딩되었다. 거짓 헤마톡실린 및 에오신 재착색은, 또한 병리학적 적용을 위해 헤마톡실린 및 에오신 염색을 모방하기 위해 수행되었다.공간 시간 중첩 및 공간 분해능 최적화는 SRS의 공간 초점 접근 방식에서 가장 중요한 단계입니다. 이 방법은 일반적으로 과도 흡수 현미경과 같은 다른 펌프 프로브 현미경 실험에 적용 가능합니다. 이 방법은 또한 세포 및 조직에서 비형광 분자의 이미징을 허용한다.여기에 제시된 방법은 클리닉에서 자극 된 라만 조직학의 향후 번역을위한 이미지 수집 시간을 단축시킵니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

nanoparticles의 세포 biodistribution을 평가하는 데 사용 Bioimaging 방법은 nanoformulated 화합물의 치료 및 진단 모니터링에 적용할 수 있습니다. histological coregistration에 의해 평가하면 여기에 설명된 방법은 민감하고 구체적인 수 있습니다. 방법은 설치류에서 인간의 응용 프로그램에 translational 경로를 제공합니다.

진단 및 치료 모니터링을위한 Nanomaterials 등록 Bioimaging

출처: Espinoza, R., et al. 조직 진단을 위한 마우스 뇌의 실시간 2색 자극 라만 산란 영상. J. Vis. Exp. (2022).  이 비디오는 쥐의 뇌 조직 절편에 대한 2색 자극 라만 산란(SRS) 이미징을 보여줍니다. 두 개의 동기화된 레이저 빔이 조직 부분으로 향하여 분자 진동을 여기시켜 빔의 상대적인 강도 변화를 초래합니다. 조직의 지질과 단백질은 레이저 빔의 고유한 주파수 쌍을 사용하여 검출됩니다. 그런 다음 결과 신호에 별도의 색상이 할당되어 조직의 단백질과 지질을 식별하는 데 도움이 되는 2색 이미지를 생성합니다.

마우스 뇌 조직의 2색 자극 라만 산란 이미징

Source: Nishimura, C.  외. HIV-induced Neuroinflammation의 마우스 모델에서 이광자 현미경을 사용하여 대뇌 혈관 건축의 정량화. J. Vis. 특급. (2016). 이 비디오는 이광자 현미경을 사용하여 마우스 뇌의 피질 모세혈관의 생체 내 시각화를 보여줍니다. 얇은 두개골 피질 창이 있는 마취된 마우스에 형광 염료를 주입하고, 이미징을 위한 설정을 준비하고, 분석을 위해 뇌 미세혈관 구조의 상세한 이미지를 획득하는 단계를 간략하게 설명합니다.

 마우스 뇌 미세혈관 구조의 생체 내 이미징을 위한 이광자 현미경 

출처: McCullagh, E. A., et al. 뇌 절편의 수초화 이미징을 위한 CARS(Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy) 적용. J. Vis. 경험. (2022년)이 비디오는 설치류 뇌 조직의 신경 구조를 시각화하기 위한 형광 및 CARS(Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy) 이미징을 보여줍니다. Nissl 염색은 리보솜 RNA에 결합하여 세포체를 표지하는 반면, CARS 이미징은 레이저 유도 신호를 통해 지질이 풍부한 미엘린을 표적으로 삼습니다. 형광 및 CARS 이미지를 오버레이하면 세포체와 수초가 있는 축삭에 대한 자세한 보기를 제공합니다.

마우스 뇌 조직에서 수초 뉴런을 시각화하기 위한 Coherent Anti-Stokes Raman 분광법

급성 뇌 손상은 날짜에 더 적절한 치료가없는 심각한 부상입니다. 다 광자 현미경은 길이 방향으로 급성 뇌 손상 개발의 과정을 공부하고 설치류에 치료 적 전략을 프로빙 할 수 있습니다. 두뇌의 생체 내 두 광자 이미징 연구 급성 뇌 손상의 두 가지 모델이 프로토콜에 설명되어 있습니다.

세로 두 광자 이미징 다음 마우스의 급성 뇌 외상

이 비디오는 Thy1-GFP 형질전환 라인에서 생체 내 2광자 현미경을 사용하여 마우스 후비장 피질의 뉴런을 만성적으로 이미징할 수 있는 개두술 절차를 보여줍니다. 이 접근법은 mCherry 발현 아데노 관련 바이러스를 배측 해마에 주입하는 것과 결합됩니다. 이러한 기술을 통해 RSC에서 경험 의존적 구조적 가소성을 장기간 모니터링할 수 있습니다.

동시에 두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 마우스 Retrosplenial 코어 텍스에서 시냅틱 입력의 이미징 및 시냅스 대상

자극된 라만 산란(SRS) 현미경은 특정 화학 결합의 고유 진동을 기반으로 생체 분자의 라벨 없는 이미징을 가능하게 합니다. 이 프로토콜에서, 통합 SRS 및 이광자 형광 현미경의 도구 셋업은 살아있는 마우스의 척수에서 세포 구조를 시각화하기 위해 기술된다.

생체 내 결합 된 이광자 형광 및 자극 된 라만 산란 현미경을 사용한 생물학적 조직 이미징

무지개 유사 라만 염료의 전자 사전 공명 자극 라만 산란 (epr-SRS) 이미징은 고도로 다중화 된 에피토프 기반 단백질 이미징을위한 새로운 플랫폼입니다. 여기에서는 항체 준비, 조직 샘플 염색, SRS 현미경 어셈블리 및 epr-SRS 조직 이미징을 포함한 실용적인 가이드를 제시합니다.

라만 염료를 이용한 고도의 다중화 조직 이미징

수초화를 시각화하는 것은 신경계를 연구하는 많은 연구자들에게 중요한 목표입니다. CAS는 미엘린과 같은 특수 구조를 조명하는 뇌와 같은 조직 내에서 지질을 기본적으로 이미지화할 수 있는 면역형광법과 호환되는 기술입니다.

뇌 조각의 수초화 이미징을 위한 일관된 안티-스톡스 라만 분광법(CARS) 애플리케이션

이 프로토콜은 형광 스티렌 미세구를 이용한 생 체 내 2광자 현미경 영상에 최적화된 만성 두개골 창문 및 미세혈관 색전증 마우스 모델에 대한 단계별 접근법을 상세히 설명하고 있습니다.

형광 폴리스티렌 미세구를 이용한 생체 내 2광자 현미경용 미세혈관 색전증 마우스 모델

학습하세요 실시간 조직 진단을 위한 두 가지 색상 자극 라만 산란 현미경법으로 마우스 뇌 조직을 영상화하는 방법을. 이 기술은 조직 처리 없이 신속한 병리 분석이 가능합니다.

조직 진단을 위한 마우스 뇌의 실시간 두 가지 색상 자극 라만 산란 영상

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