인간 말초 혈액에서 B 세포의 분리 및 정제

B 세포의 면역자기 음성 분리를 수행하려면 혈액 응고를 방지하기 위해 항응고제 함유 튜브에 인간 말초 혈액을 수집합니다. 적혈구, 적혈구, 용해 완충액을 첨가하여 다른 혈액 세포에 영향을 주지 않고 적혈구를 용해합니다.

원심분리하여 상청액에 남아 있는 밀도가 낮은 용해된 적혈구에서 온전하고 밀도가 높은 혈액 세포를 침전시킵니다. 상청액을 버리십시오. 펠릿을 신선한 배지에 재현탁합니다.

세포를 배양 플레이트로 옮깁니다. B 세포를 포함한 비부착 세포가 현탁액으로 남아 있는 동안 대식세포와 단핵구가 플레이트에 부착되도록 배양합니다.

현탁액의 세포를 새 튜브에 모으십시오. 원심분리하여 세포를 펠릿화하고 완충액에 재현탁합니다.

B 세포 이외의 혈액 세포에 특이적인 비오틴화 항체가 포함된 칵테일 용액을 추가합니다. 항체는 비 B 세포 표면의 항원에 결합하여 B 세포는 표지되지 않은 상태로 남깁니다.

원심 분리기. 결합되지 않은 항체를 포함하는 상청액을 버립니다.

스트렙타비딘 접합 마그네틱 비드 용액을 첨가하십시오. 배양하는 동안 마이크로비드의 스트렙타비딘은 비 B 세포에 결합된 비오티닐화 항체에 단단히 결합하여 복합체를 형성합니다.

튜브를 자기장에 넣어 자기 비드에 결합된 비 B 세포를 튜브 벽에 부착하고 B 세포를 현탁 상태로 둡니다. 순수 B 세포를 포함하는 상청액을 튜브로 옮깁니다.

추가 다운스트림 분석을 위해 B 세포를 배지에 원심분리하고 재현탁합니다.

정중 팔뚝 정맥에서 칼륨이 보충된 EDTA가 들어 있는 15밀리리터 튜브로 10밀리리터 혈액 샘플을 채취한 직후 혈전 형성을 방지하기 위해 튜브를 여러 번 뒤집습니다. 그런 다음 35밀리리터의 고압멸균 적혈구 용해 완충액을 세포에 첨가하여 실온에서 5분 동안 배양합니다.

튜브를 통해 빛이 관찰될 수 있으면 혈액을 원심분리하고 흰색 알갱이의 존재를 확인합니다. PBS에 10밀리리터의 오토클레이브로 잔류 용해 완충액을 제거하고 10밀리리터의 RPMI 1640 배지에 펠릿을 재현탁합니다.

를 10cm 배양 접시에 접시하여 섭씨 37도 및 이산화탄소 5%에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 배양 접시를 부드럽게 몇 번 휘젓고 부유 세포를 플라스틱 15밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다.

원심분리에 의한 2회 세척 후, 펠릿을 200마이크로리터의 저온 PBS 완충액에 밀리리터당 5 내지 10 x 10⁶ 세포 농도로 재현탁하고, 1 x 10⁶ 세포당 혈액 세포에 특이적인 비오티닐화된 항인간 항체 칵테일 5 마이크로리터를 첨가한다.

얼음 위에서 30분 배양한 후, 10배 초과 부피의 멸균 PBS로 세포를 세척하고 펠릿을 1 x 10⁶ 세포당 5마이크로리터의 스트렙타비딘 접합 마이크로비드에 재현탁하여 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 PBS 완충액 2밀리리터를 세포에 추가하고 튜브를 실온에서 8분 동안 마그네틱 스탠드에 놓습니다.

마이크로비드가 튜브 벽에 부착되면 상청액을 새 원뿔형 튜브로 조심스럽게 옮기고 PBS 완충액 2밀리리터를 세포에 더 추가합니다. 두 번째 상청액 수집 후, 원심분리에 의해 풀링된 세포를 수집하고, 밀리리터당 1 x 10⁷ 세포 농도로 신선한 PBS 완충액에 있는 5밀리리터 폴리스티렌 튜브로 세포를 옮깁니다.