형광 현미경으로 Stromule 주파수를 시각화

이 실험 절차의 전반적인 목표는 잎 내부에서 생세포 공초점 형광 현미경을 사용하여 스트로뮬(stromule)의 빈도를 시각화하고 결정하며, 잎에서 추출한 엽록체를 이용해 인비트로(in vitro)에서 스트로뮬을 시각화하는 것입니다. 이러한 실험 방법은 스트로뮬의 기능을 밝혀냄으로써 식물 세포 생물학 및 엽록체 연구의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술들의 주요 장점은 매우 역동적인 엽록체 구조임에도 불구하고 재현성 있고 견고한 데이터를 생성한다는 점입니다.

일부 연구에서 스트로뮴(stromule) 형성에 세포골격과 같은 세포질 구조가 필요하다는 점이 시사되었기에, 저희는 엽록체 분리 연구를 고안하게 되었습니다. 이에 따라 세포를 파쇄한 후에도 스트로뮴이 여전히 형성될 수 있는지 확인하기로 했습니다. 잎 시료를 준비하려면, 매우 날카로운 면도날을 사용하여 Nicotiana benthamiana 잎의 작은 조각을 절단하는 것부터 시작하십시오.

잎 절편을 자른 직후, 물이 채워진 5 mL 주사기에 담그십시오. 그다음, 주사기 내부의 공기를 제거하고, 손가락으로 주사기 입구를 막은 상태에서 플런저를 당겨 진공 상태를 만드십시오. 잎 절편이 손상되지 않도록 플런저를 천천히 놓으십시오.

그 후 공기 제거 과정을 2~3회 반복하거나, 공기가 모두 제거되어 잎이 짙은 녹색으로 보일 때까지 반복합니다. 슬라이드 글라스에 물 한 방울을 떨어뜨리고, 그 위에 잎 절편을 올립니다. 그다음 잎 윗부분에 물 한 방울을 더 추가하고 커버 글라스를 덮습니다.

공기 방울이 있다면, 방울이 제거될 때까지 커버 슬립을 가볍게 두드립니다. 투과광과 20x 대물렌즈를 사용하여 잎 단면의 중앙 근처 시야에 초점을 맞추고, 여러 개의 엽록체가 동시에 보이도록 합니다. 나중에 필요한 경우 세포 유형을 구분할 수 있도록 투과광 이미지를 저장합니다.

그런 다음 사용 중인 형광체에 적합한 여기 및 방출 필터를 갖춘 레이저 조명으로 전환하고, 다른 이미지를 저장합니다. 현미경 소프트웨어를 사용하여 GFP 채널을 선택하고, 핀홀 조리개를 1 airy unit으로 조정합니다. 레이저 스캐닝을 선택하여 샘플 시각화를 시작한 다음, GFP 채널과 검출기 게인(detector gain)을 클릭하여 stromule이 명확하게 시각화되는 범위 내에서 레이저 출력을 최소화합니다.

다음으로, 시야 내의 잎 표피를 통해 일련의 이미지를 수집할 Z 스택 실험을 준비합니다. Z 스택이 신속하게 수집될 수 있도록 스캔 속도와 이미지 해상도를 필요에 따라 조정하십시오. 그 후, 추후 분석을 위해 Z 스택을 저장합니다.

Image J를 사용하여 소프트웨어 내의 최대 강도 투영(maximum intensity) 기능을 통해 Z 스택을 단일 이미지로 병합합니다. 그런 다음 이미지 내의 모든 엽록체를 식별하고 수동으로 계수합니다. 각 엽록체에 대해, 병합된 Z 스택 이미지에서 엽록체로부터 하나 이상의 스트로뮬(stromule)이 뻗어 나와 있는지 시각적으로 판별합니다.

손상되지 않은 엽록체를 추출하려면 다음 시약을 사용하여 차가운 추출 완충액을 준비하십시오. 그다음 NaOH와 HCl을 사용하여 pH를 6.9로 조절하고, 사용 전까지 냉장 보관하십시오. 분리 완충액을 준비하고 pH를 7.6으로 조절하십시오.

잎이 유전적으로 부호화된 스트로마 형광단백질을 발현하지 않는 경우, Carboxyfluorescein diacetate 또는 CFDA 용액을 준비합니다. 엽록체를 분리하기 위해, 여러 식물에서 약 5~10g의 잎을 채취하여 찬물로 짧게 헹굽니다. 그 후 즉시 잎을 50mL의 차가운 추출 버퍼로 옮깁니다.

블렌더를 사용하여 짧게 여러 번 작동시켜 잎을 갈아낸 후, 거즈를 두세 겹으로 겹쳐 혼합물을 여과하여 잎 찌꺼기를 제거합니다. 추출된 엽록체를 50 milliliter 원심분리관 두 개에 나누어 담고, 750 x g에서 1분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고, 10 milliters의 isolation buffer를 사용하여 녹색 엽록체를 재부유시킵니다.

그런 다음 750 x g에서 1분 동안 다시 원심분리하고, 상층액을 제거한 후 분리 버퍼를 사용하여 엽록현탁액의 최종 부피가 5 mL가 되도록 재현탁합니다. 만약 엽록체가 플라스티드 표적 형광 단백질을 발현하는 형질전환 식물에서 유래한 경우, 엽록현탁액 20 µL를 슬라이드 글라스에 옮기고 커버 글라스를 덮습니다. 그런 다음 현미경 관찰을 수행합니다.

플라스티드 표적 형광 단백질을 발현하지 않는 식물의 엽록체를 염색하려면, 분리 완충액에 있는 5 mL의 엽록체에 50 mM CFDA 스톡 5 µL를 첨가합니다. 엽록체를 5분 동안 배양한 후, 소량을 슬라이드로 옮기고 커버 슬립을 덮어 현미경 관찰을 수행합니다. 마지막으로, FITC 또는 GFP 필터 세트와 20x 대물렌즈를 사용하여 여러 개의 엽록체를 동시에 시각화합니다.

또는 단일 분리 엽록체를 시각화하기 위해 더 높은 배율의 대물렌즈를 사용합니다. 여기에는 어린 N.Benthamiana 묘목의 하배축에서 GFP 기공 빈도를 보여주는 병합 스택이 제시되어 있습니다. 이 패널에서는 스트로마가 검은색으로 보이도록 이미지를 탈색하고 반전시켰습니다.

엽록체는 스트로물(stromule)이 없는 경우와 적어도 하나의 스트로물을 가진 경우로 구분하여 표시하였습니다. 관찰된 87개의 표피 엽록체 중 33개에서 스트로물이 확인되었으며, 해당 잎에서의 빈도는 37.9%였습니다. 이 그래프는 21개 서로 다른 식물에서 유래한 단일 잎의 수백 개 세포와 23,000개 이상의 엽록체를 분석한 결과를 나타냅니다.

주간의 평균 스트로뮬(stromule) 빈도는 20.8 ± 1.8%였고, 야간의 평균 스트로뮬 빈도는 12.8 ± 0.9%였으며, Welch's T test 결과 주간의 빈도가 유의하게 더 높은 것으로 나타났습니다. 이 그림에서는 plastid-targeted GFP를 발현하는 N.benthamiana에서 분리한 엽록체 또는 CFDA를 사용하여 N.benthamiana 또는 Spinachia oleracea의 엽록체를 염색한 후 in vitro에서 엽록체 스트로뮬을 관찰하였습니다. 스트로뮬의 살아있는 세포 이미징을 수행할 때는 신속하게 작업하고 식물 조직의 조작을 최소화하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라, 유전자 사이런싱이나 화학적 처리와 같은 다른 방법들을 사용하여 스트로뮴(stromule) 형성 및 기능에 관여하는 추가적인 분자 인자나 경로를 발견할 수 있습니다. 이 기술은 식물 세포 생물학 및 식물 면역학 연구자들이 세포 신호 전달 경로와 병원균에 대한 식물의 반응에서 스트로뮴의 역할을 연구하는 데 사용되어 왔습니다. 이 영상을 시청한 후에는 잎에서 스트로뮴 빈도를 계산하는 방법과 추출된 엽록체 내의 스트로뮴을 관찰하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

또한, 주사 전자 공초점 현미경에 공급되는 레이저와 전기 전압은 매우 위험할 수 있으므로, 이 장비를 사용하기 위한 시스템 요구 사항을 이해하는 것이 중요함을 기억하십시오.