형광 현미경으로 Stromule 주파수를 시각화

이 절차의 전반적인 목표는 잎 내의 라이브 셀 컨포칼 형광 현미경을 사용하여 스트로뮬 빈도를 시각화 및 결정하고, 잎에서 추출한 엽록체를 사용하여 체외에서 스트로뮬을 시각화하는 것입니다. 이러한 실험 방법은 스트로뮬의 기능을 발견함으로써 식물 세포 생물학 및 엽록체 연구의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 기술의 주요 장점은 이러한 매우 동적인 엽록체 구조에 대해서도 재현 가능하고 강력한 데이터를 생성한다는 것입니다.

우리는 엽록체 분리 연구에 대한 아이디어를 가지고 있었는데, 일부 연구에서는 스트로뮬 형성이 형성되기 위해서는 세포골격과 같은 세포질 구조가 필요하다고 제안했기 때문입니다. 그래서 우리는 세포를 혼합하고 스트로뮬이 여전히 형성될 수 있는지 확인하기로 결정했습니다. 잎 샘플을 준비하려면 먼저 매우 날카로운 면도날을 사용하여 니코티아나 벤타미아나 잎의 작은 부분을 자릅니다.

잎 부분을 자른 직후 물을 채운 5mm 주사기에 담그십시오. 그런 다음 주사기에서 공기를 제거하고 플런저를 당기기 전에 손가락을 사용하여 주사기 구멍을 덮어 진공 청소기를 적용합니다. 잎 부분이 손상되지 않도록 플런저를 부드럽게 해제합니다.

그런 다음 공기 제거를 두세 번 반복하거나 공기가 제거되고 잎이 짙은 녹색으로 나타날 때까지 반복합니다. 슬라이드에 물 한 방울을 넣고 물방울 위에 잎 부분을 놓습니다. 그런 다음 잎 위에 물 한 방울을 더 넣고 커버 슬립을 추가합니다.

기포가 있으면 제거될 때까지 커버 슬립을 가볍게 두드립니다. 투과광과 20x 대물렌즈를 사용하여 잎 섹션 중앙 근처의 시야에 초점을 맞추고 여러 엽록체를 동시에 시각화합니다. 투과광이 있는 이미지를 저장하여 나중에 필요한 경우 세포 유형을 구별할 수 있습니다.

그런 다음 사용 중인 형광단에 적합한 excitation 및 emission filter를 사용하여 레이저 조명으로 전환하고 다른 이미지를 저장합니다. 현미경 소프트웨어를 사용하여 GFP 채널을 선택하고 클릭하여 핀홀 조리개를 하나의 통풍 장치로 조정합니다. 레이저 스캔을 선택하여 샘플 시각화를 시작한 다음 GFP 채널과 검출기 게인을 클릭하여 레이저 출력을 최소화하는 동시에 스트로뮬을 명확하게 시각화합니다.

다음으로, 시야에서 잎 표피를 통해 일련의 이미지를 수집하는 Z 스택 실험을 준비합니다. Z 스택이 빠르게 수집되도록 필요에 따라 스캔 속도와 이미지 해상도를 조정합니다. 그런 다음 나중에 분석할 수 있도록 Z 스택을 저장합니다.

이미지 J를 사용하여 소프트웨어에서 최대 명암을 사용하여 Z 스택을 단일 이미지로 병합합니다. 그런 다음 이미지에서 모든 엽록체를 식별하고 수동으로 계수합니다. 각 엽록체에 대해 병합된 Z 스택 이미지에서 엽록체에서 확장되는 하나 이상의 스트로뮬이 보이는지 육안으로 확인합니다.

온전한 엽록체를 추출하려면 다음 시약을 사용하여 저온 추출 버퍼를 준비합니다. 그런 다음 NaOH 및 HCl을 사용하여 pH를 6.9로 조정하고 사용하기 전에 냉장 보관하십시오. 분리 완충액을 준비하고 pH를 7.6으로 조정합니다.

잎이 유전적으로 암호화된 스트로모플루오로포단을 발현하지 않는 경우 Carboxyfluorescein diacetate 또는 CFDA 용액을 준비합니다. 엽록체를 분리하려면 여러 식물에서 약 5-10g의 잎을 제거하고 찬물로 잠시 헹굽니다. 그런 다음 즉시 잎을 50ml의 냉추출 버퍼로 옮깁니다.

몇 번의 짧은 펄스가 있는 블렌더를 사용하여 잎을 갈아서 2-3겹의 치즈 천으로 혼합물을 여과하여 잎 찌꺼기를 제거합니다. 추출된 엽록체를 50ml 원심분리기 튜브 2개로 나누고 750 x g에서 1분 동안 원심분리합니다. 상등액을 버리고 10밀리터의 분리 완충액을 사용하여 녹색 엽록체를 다시 현탁시킵니다.

그런 다음 750 x g에서 1분 동안 다시 원심분리하고, 상층액을 버리고, 분리 버퍼를 사용하여 엽록체를 최종 부피인 5ml까지 다시 현탁시킵니다. 엽록체가 플라스티드 표적 형광 단백질을 발현하는 형질전환 식물에서 유래한 경우, 엽록체 20마이크로리터를 슬라이드로 옮기고 커버 슬립을 추가합니다. 그런 다음 현미경을 수행하십시오.

플라스티드 표적 형광 단백질을 발현하지 않는 식물에서 엽록체를 염색하려면 분리 완충액에 있는 5밀리리터의 엽록체에 50밀리리터의 CFDA 스톡을 첨가합니다. 엽록체를 5분 동안 배양한 후 작은 부분 표본을 슬라이드로 옮기고 커버 슬립을 추가하고 현미경 검사를 수행합니다. 마지막으로, FITC 또는 GFP 필터 세트와 20x 대물렌즈를 사용하여 여러 엽록체를 동시에 시각화합니다.

또는 단일 분리된 엽록체를 시각화하기 위한 더 높은 목표. 어린 N.Benthamiana 묘목의 교구에서 GFP stomule 빈도를 보여주는 병합된 스택이 여기에 나와 있습니다. 이 패널에서는 이미지의 채도가 낮아지고 반전되어 기질이 검게 보입니다.

엽록체는 스트로뮬이 없거나 적어도 하나의 스트로뮬이 있는 것으로 표시되었습니다. 시각화된 87개의 표피 엽록체 중 33개는 스트로뮬을 가지고 있으며, 이 잎에서 37.9%의 빈도로 나타납니다. 이 그래프는 21개의 서로 다른 식물의 단일 잎에서 23, 000개 이상의 엽록체와 수백 개의 세포를 분석

낮 동안의 평균 스트로뮬 빈도는 20.8 플러스 마이너스 1.8 퍼센트였고, 평균 야간 스트로뮬 빈도는 12.8 플러스 마이너스 0.9 퍼센트였으며, 이는 Welch의 T 테스트에 의해 결정된 바와 같이 상당히 높은 주간 빈도가 있음을 나타냅니다. 이 그림에서, 플라스티드 표적 GFP를 발현하는 N.벤타미아나(N.benthamiana)에서 분리한 후 또는 CFDA를 사용하여 N.벤타미아나(N.benthamiana) 또는 스피나치아 올레라세아(Spinachia oleracea)에서 엽록체를 염색한 후 엽록체 스트로뮬을 체외에서 관찰했습니다. 스트로뮬의 라이브 셀 이미징을 수행하는 동안 신속하게 작업하고 가능한 한 적게 식물 조직을 조작하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 유전자 침묵 또는 화학적 처리와 같은 다른 방법을 사용하여 스트로뮬 형성 및 기능과 관련된 추가 분자 플레이어 또는 경로를 발견할 수 있습니다. 이 기술은 식물 세포 생물학 및 식물 면역 연구자들이 세포 신호 전달 경로에서 스트로뮬의 역할과 병원체에 대한 식물 반응을 연구하는 데 사용되었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 잎에서 스트로뮬 빈도를 계산하는 방법과 추출된 엽록체에서 스트로뮬을 관찰하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

그리고 주사 전자 컨포칼 현미경에 공급되는 레이저와 전기 전압은 매우 위험할 수 있으며 이 장비를 사용하기 위한 시스템 요구 사항을 이해하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오.