Name: 형광 현미경으로 Stromule 주파수를 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: 배우세요 형광 현미경으로 식물 세포에서 스트로뮬(Stromule) 주파수를 시각화하고 정량화하는 방법을. Nicotiana benthamiana 엽록체를 이용한 이 기술은 재현 가능한 데이터를 제공하여 엽록체 역학 연구에 기여합니다.

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J.O.B.와 A.M.R.은 국립과학재단(National Science Foundation)의 박사 전 펠로우십의 지원을 받았습니다.

참고 :이 프로토콜을 위해, 우리는 N의 표피에 stromule 주파수을 분석에 초점을 맞추고있다 benthamiana 나뭇잎. FNRtp : EGFP 13 NRIP1 6 세룰 리안 여러 안정한 형질 전환 라인 35S PRO 포함하여 이러한 목적을 위해 사용될 수있는 생성되었다. 이 라인은 모두 광범위한 조건 하에서 성장 잎의 엽록체 기질의 형광의 강력한 표현을 보여줍니다. 대안 적으로, 엽록체 표적 형광체는 일시적 N. 표현 될 수있다 benthamiana하여 아그로 13 변형. 아그로 박테 리움이 침입 N. 일부 기초 방어 반응을 유도하기 때문에 이것은 트랜스 제닉 라인보다 적합 아그로 박테 리움과 benthamiana과 상호 작용 가능성이 결과의 해석을 복잡하게 잎 14 stromule 주파수를 변경할 수 있습니다. 마지막으로, 시험 관내에서 stromule 형성을 시각화하기 위해,아래의 섹션 5에 기술 된 바와 같이 엽록체는 유전자 코드 형광체 또는 형광 염료를 사용하여, 임의의 종의 식물에서 추출 할 수있다. 9,15 참고 :. 식물 재배에 대한 자세한 방법은 이전에 기술되어있다 (16) 간단히, N. 성장 좋은 배수를 제공하는 전문적인 토양 혼합 가득 4 &quot;냄비에 benthamiana 식물입니다.. 발아 습한 환경을 제공하는 최초의 10-14일에 대한 명확한 플라스틱 돔 모종을 커버 14-에 제조업체의 지침에 따라 표준 비료 혼합 추가 일 된 식물. ~ 100 μmol 광자 m -2 초 -1 빛의 강도를 사용하여, 백색광에서 식물을 성장. 물 식물을 정기적으로. 시각화 1. 준비 잎 샘플 참고 : 조직 준비가 stromule를 시각화하기 직전에 수행되어야하므로 Stromule 역학은 8 부상에 의해 영향을받는공 초점 형광 현미경으로의. 이상적으로, 샘플은 공장에서 제거 후 15 분으로 시각화한다. <ol><li> 매우 날카로운 면도날을 사용하여 잎의 작은 부분을 잘라. 항상 일관성 잎의 같은 영역을 사용하고 모든 실험에서 (향축 또는 배축) 같은 표면을 시각화 확신 할 수. </li><li> 즉시 잎 부분을 절단 한 후, 물을 가득 5 ㎖ 무 바늘 주사기의 잎 부 잠수함 주사기로부터 공기를 제거하고, 손가락으로 주사기 구멍을 덮는 플런저 당기는 진공을 적용한다. <ol><li> 잎 부분이 손상되지 않도록 부드럽게 플런저를 놓습니다. 이 두 개 또는 세 번 반복, 또는 공기의 대부분이 제거 될 때까지 리프 깊은 녹색으로 보인다. 참고 :이 단계는 stromules의 정확한 시각화를 방해 할 수있는 잎에 공기를 제거합니다. </li></ol></li><li> 슬라이드에 물 한 방울을 추가하고이 드롭의 잎 부분을 배치합니다. 그런 다음, 다른 닥터를 추가잎의 상단에 물 연산, 그리고 잎 위에 커버 슬립을 배치합니다. 기포가있는 경우가 제거 될 때까지 천천히 커버 슬립을 탭. 슬라이드는 이제 현미경에 대한 준비가되어, 즉시 가시화되어야한다. </li></ol> 공 초점 형광 현미경 2. 떠올리 Stromules <ol><li> 투과광으로 (멀리 면도날에 의해 손상된 세포) 판 단면의 중심 부근의 시야에 초점을 맞춘다. 많은 엽록체 동시에 시각화 할 수 있도록하는 20X 목표를 사용합니다. 필요한 경우 세포 유형은 나중에 구별 될 수 있도록 전송 된 광 화상을 저장한다. </li><li> 형광 물질이 사용되기에 적합한 여기 및 방출 필터를 레이저로 조명 원 스위치. 예를 들어, 488 nm의 레이저로 GFP를 여기 500 nm 내지 525 nm의 사이에 배출을 모은다. <ol><li> 현미경의 소프트웨어를 사용하여 상기 GFP 채널을 선택하고, 핀홀 개구 아이 1을 조정 클릭스피 장치. 레이저 주사 선택 샘플 시각화 시작하고 레이저 강도 여전히 명확 stromules 시각화하면서 레이저 파워를 최소화하기 위해 상기 검출기 이득을 조정하는 GFP 채널을 클릭. 이러한 설정이 결정되고 나면, 그 모든 실험을 통해 가능한 한 일관성을 유지한다. </li></ol></li><li> 시야의 잎 표피를 통해 일련의 이미지를 수집하는 Z -stack 실험을 준비한다. <ol><li> 의 Z -stack를 들어, (잎 표면 근처 엽록체 테스트 조건에서 더 stromules이있는 경우, 예를 들어) 편견을 피하기 위해 시야에있는 모든 표피 엽록체를 포함한다. </li><li> A에서 Z의 -stack에 필요한 시간을 모든 stromules을 포함하지만 최소화 할 수있는 최대 간격 수의 이미지를 가져 가라. 예를 들어, 1 에어리 단위마다 2 ㎛의 가능성 이상적인 이미지를 촬영하고, 2 ㎛의 깊이 인 - 포커스 촛점 부에 상당한다. 참고 : 잎 epidermiS는 요철면이므로 시료에 따라 달라질 -stack는 z의 총 깊이; 대부분의 Z -stacks 10-20 이미지가 필요하지만 더 포함 할 수있다. </li><li> (가능하면, 일반적으로 5 ~ 10 분 이내)의 Z -stack 신속하게 수집되어 있는지 확인하기 위해 스캔 속도와 필요한 이미지 해상도를 조정합니다. 나중에 분석을위한 Z의 -stack을 저장합니다. </li></ol></li></ol> 3. 이미지 처리 <ol><li> 모든 이미지 분석 소프트웨어를 사용 stromule 주파수를 결정한다. 이 프로토콜을 위해, 우리는 국립 보건원 (http://imagej.nih.gov/ij/), 또는 ImageJ에, 피지의 인기 업그레이드에서 공개적으로 사용할 수 ImageJ에, (http://fiji.sc를 사용하는 것이 좋습니다 / 피지). </li><li> 소프트웨어의 최대 강도 투사를 사용하여 하나의 이미지로 Z의 -stack을 병합합니다. </li><li> 확인하고 수동으로 이미지의 모든 엽록체를 계산합니다. </li><li> 각 엽록체를 들어, 시각적으로인지하는 하나 이상의 stromules를 결정병합 된 Z -stack 이미지의 엽록체에서 연장 볼 수 있습니다. 예를 들어, 그림 1을 참조하십시오. 참고 : stromules의 생물학적 기능이 알려져 있지 않기 때문에, 엽록체에서 어떤 얇은 기질 가득한, 관 확장 길이에 관계없이,에 &quot;stromule&quot;으로 간주 될 수있다. 그것은 약 1 ㎛ 길이 7의 대부분을 따라 직경보다 작 으면 일반적으로 엽록체에서 기질 가득 확장은 stromule이다. 한 사람이 엽록체가 stromule을 가지고 있는지의 여부를 결정하는 주관적인 차이를 제어하는 ​​모든 이미지를 분석 있는지 확인합니다. 두 번째 연구는 독립적으로 더 주관적인 편견을 줄이기 위해 stromule 주파수를 확인해야합니다. </li></ol> 4. 실험 설계 및 표본 추출 참고 : Stromule 주파수는 잎 사이에서 매우 다양하지만, 몇 가지 보고서는 stromule 주파수에 약간의 변화가 INDIVI 내에서이 있음을 시사이중 잎 9,17. <ol><li> 한 잎의보기의 단일 필드에서 잎 stromule 주파수를 계산합니다. 잎을 폐기하고,이 독립적 인 샘플을 고려합니다. 독립적 인 샘플 하나 잎에서보기 별도의 필드를 고려하지 마십시오. 참고 : stromules의 기능을보다 명확하게 정의 stromule 활동 때까지 방법에 가장 측정 변경, 연구자 stromule 역학을 정량화 창조적 계속한다에 강한 공감대가 없습니다. 문헌에 걸쳐, 비교를 위해, 그러나,보고의 공통 표준은 창의적인 방법에 추가로 사용한다. 최소한, 항상 하나 이상의 stromules이 엽록체의 주파수를보고한다. </li><li> 보기의 필드에 stromules이 엽록체의 주파수를 결정합니다. 시야 모두 엽록체 ImageJ에 식별을 사용한다. 그리고, 각 엽록체 들어 엽록체 적어도 하나 stromule 형성 여부를 결정한다. percenta으로 보고서 stromule 주파수stromule와 엽록체의 GE. 주 : 일부 연구자 stromule 주파수를보고하기 전에, 아크 사인 변환하여, 예를 들어, 백분율 변환; 이 통계적 분석에 대한 옵션 인 반면, stromule 주파수 정현 직관적 값이되지 않고, 연구의 본문 또는 도면에보고 할 필요가 없다. <ol><li> 다른 방법으로, stromules의 총 수를 계산하고, 엽록체의 총 개수로 나눈다. 주 : 대부분의 경우,이 4.2에 접근하는 유사한 결과를 얻을 것입니다; 단일 엽록체 많은 stromules을 형성 한 경우는, 그러나, stromule 주파수 과대 평가된다. 대표적인 결과를 아래에 도시 된 예에서, 예를 들어, 여러 엽록체 (87분의 33의 주파수 대 stromule) 87분의 40에 엽록체 당 stromules 수를 높여 둘 이상의 stromules있다. </li><li> 또한, 대신 stromule 주파수의 stromule 길이를 결정합니다. 길이를 측정 할 수있다프리 핸드 선 도구를 사용하여 stromule을 추적하여 ImageJ에있다. 참고 stromules의 생물학적 역할은 알려져 있지 때문에,이 stromule 길이가 그 기능에 영향을 미치는 것을 명확하지 않다. 그들이 관찰하는 경우 stromule 길이가 유의 한 차이를보고하지만 (4.2에 설명 된대로)도 stromule 주파수를보고합니다. 참고 : Stromule 주파수는 동일한 성장 조건에서 다른 나뭇잎 사이에서 매우 다양 할 수있다. 따라서, 시간 소모적 일 수 stromule 주파수를 결정하지만, 실험은 신중하게 큰 샘플 크기를 포함하도록 설계되어야한다. 우리 실험실에서 데이터 세트를 사용하여, 우리는 기준 (각 처리에 대해 적어도 16 개의 식물의 샘플 크기는 두 조건 사이 stromule 주파수의 적어도 1.5 배의 변화가 통계적으로 유의 한 차이가 존재 하는지를 판정하기 위하여, 일반적으로 충분히 강력하다고 판단 α = 0.05 β는 = 0.80). </li></ol></li><li> 결과의 통계 분석. <ol><li> 중동을 비교하려면이 치료의 stromule 주파수는, (도 동일하지 않은 분산을 가정 heteroscedastic t 테스트 또는 t 테스트라고도 함) 웰치 t 테스트를 사용합니다. 주 :이 테스트는 종래 스튜던트 t 테스트처럼 강력하지 않다하지만 stromule 주파수 분포의 변화는 치료와 유사하다고 가정하지 않으므로 웰치 t 테스트가 바람직하다. 참고 : stromule 주파수는 &quot;비율&quot;이기 때문에, 그 샘플링 분포는 이론적으로 스큐 통계 분석을 표본 크기가 매우 낮은 경우 또는 stromule 주파수 (근접 0 %까지) 또는 매우 매우 낮은 경우 수있는, 이항보다는 정상적인 것으로 예상된다 높은 (100 %에 가까운). 몇몇 보고서는 정규 분포 이항 분포를 변환함으로써 학생의 t- 시험 또는 ANOVA 표준 요건을 충족하기위한 통계적 분석 전에 아크 사인 변환을 사용했다. 실제로, 그러나rcsine 변환은 통계 분석에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 때문에 사용하지 않는 것이 좋습니다. 그 대신에, 통계적 전력을 증가 및 데이터의 해석의 오류를 줄일 샘플 크기를 증가시키는 실험을 반복한다. </li><li> 사용 통계 어떤 접근 방법,주의 깊게 각 실험에 대한 표본 추출 방법, 표본의 크기, 통계 테스트 및 p 값을보고해야합니다. 주 : 생물학의 다른 분야와 같이, p 값 0.05는 &quot;통계적으로 유의 한&quot;고려 될 수있다, 연구자들은 확실히 얻은 정확한 p 값을보고해야하지만. p는 두 개 또는 세 개의 실험 시료의 크기를 증가 약간 0.05 이상이면 관찰 된 차이가 통계적으로 유의하고 재현 가능인지의 여부를 명확히하고있다. </li></ol></li></ol> 5. Stromule 역학을 시각화하기 위해 본래 엽록체 추출 참고 : 여러 가지 방법관내 15 stromule 형성에 대한 최근의 연구에서 약간 다른 프로토콜을 포함, 잎에서 엽록체를 분리하기 위해 사용되어왔다. 아래에 설명 된 프로토콜은 생화학 엽록체 순수한 샘플을 생성하지 않는 비교적 간단한 방법을 사용하는 대신 그대로 건강 엽록체 9,18 다량 격리 않는다. <ol><li> 냉 추출 버퍼 준비는 50mM 헤 페스의 NaOH를 330 mM의 소르비톨, 2 mM의 EDTA, 1.0 밀리미터의 MgCl 2와 1.0 mM의 MnCl 2. 사용하기 전에 수산화 나트륨과 염산, 냉장 6.9로 pH를 조정합니다. 참고 : 비록 필요하지, 감기 버퍼를 사용하여 그대로 엽록체의 높은 비율을 얻을 것입니다 가능하면 얼음에 샘플을 유지. </li><li> 분리 준비 완충액 : 50 mM의 헤 페스의 NaOH를 330 mM의 소르비톨, 2 mM의 EDTA, 1.0 mM의 MnCl 2, 1.0 밀리미터의 MgCl 2, 10mM의 KCl을, 1.0 mM의 염화나트륨. 사용하기 전에 수산화 나트륨과 염산 냉장와 7.6 pH를 조정합니다. </li><li> 잎이없는 경우디메틸 설폭 사이드에서 50 mM의 CFDA 주식 솔루션 (DMSO) (1.0 ml의 DMSO 당 2.3 mg을 CFDA) : 유전자 인코딩 된 기질의 형광을 발현, 카르복시 디 아세테이트 (CFDA) 솔루션을 준비합니다. 참고 : 정확한 농도는 중요하지 않다. 항상 어둠 속에서 CFDA의 재고를 유지합니다. -20 ° C에서 50 mM의 CFDA의 작은 분취 량을 저장합니다. </li><li> 엽록체를 분리하기 위해 여러 식물에서 ~ 5~10g 잎을 제거하고 간단하게 찬물에 헹군다. 즉시 50 ㎖ 차가운 추출 버퍼에 전송합니다. 여러 짧은 펄스로 믹서기를 사용하여 분쇄 잎. 이 50 ㎖ 원심 분리기 튜브로 추출 된 엽록체를 분할, 잎 파편을 제거하기 위해 투박한 무명의 두 개 또는 세 개의 레이어를 통해 필터, 750 X g에서 1 분간 원심 분리기. </li><li> 뜨는을 취소하고 10 ml의 분리 버퍼에 녹색 엽록체를 재현 탁. 원심 분리기는 다시 750 XG에 1 분 동안, 상층 액을 버리고, 및 절연 버퍼에 resuspend의 엽록체 5 ml의 최종 부피를 가지고. </li><li> 전송 (20)1, 슬라이드에 엽록체의 리터는 커버 슬립으로 커버하고, 현미경을 시작합니다. 참고 : 플라 타겟 형광 단백질을 발현하는 형질 전환 식물에서 엽록체 이제 공 초점 형광 현미경으로 시각화를위한 준비가되어 있습니다. </li><li> stromules을 시각화 플라 타겟 형광 단백질을 발현하지 않는 식물에서 엽록체를 얼룩. <ol><li> 분리 버퍼에 엽록체가 탁 5 ㎖의 50 mM의 CFDA 주식의 5 μl를 추가합니다. 50 μM에 최종 농도를 가져옵니다. </li><li> 엽록체는 5 분 동안 배양 한 다음 슬라이드에 작은 나누어지는 (~ 50 μL)를 전송하는 커버 슬립으로 커버하고, 현미경을 시작 할 수 있습니다. </li><li> FITC 또는 GFP 필터 세트를 사용합니다. 하나의 고립 된 엽록체를 시각화하는 동시에 많은 엽록체를 시각화하는 20X 목표, 또는 더 높은 목표를 사용합니다. 참고 : CFDA 그대로 엽록체의 기질 내부에 형광 것입니다. </li><li> 강한 배경 형광이있는 경우, chlo 씻어다시 CFDA, 750 XG에 1 분 동안 원심 분리기로 5 분 부화 후 10 ml의 분리 버퍼에 roplasts은 5 ml의 분리 버퍼에 뜨는, 그리고에 resuspend 폐기합니다. </li></ol></li></ol>

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stromules을 조사 할 때, 세 가지 중요한 요인 전반에 걸쳐 고려되어야한다 : 절대 최소로 유지해야 식물 조직의 (ⅰ) 조작, (ⅱ) 실험 시스템은 일관성을 유지해야하며, (ⅲ) 샘플링 전략은 신중을 계획해야합니다 강력한 보장, 재생 가능한 데이터 분석된다. Stromules는 매우 동적 : 그들은 확장하고 현미경 관찰자의 눈 앞에 빠르게 철회 할 수 있습니다. 또한 stromule 주파수 (예 : 잎 상처 등) stromules를 시각화하기 위해 피할 수없는 자극 치료를 포함하는 넓은 범위에 대응하여 크게 변화한다. 여기에 설명 된 프로토콜로 해결되는이 문제에 대한 주요 솔루션은 일관성있는 모든 변수를 유지, 잘 조절 된 실험을 수행하는 것입니다. 이것은 바로 현미경으로 데리고 전에 시각화를위한 각 샘플의 제조, 예를 들어, 포함하고; 식물이 손상되지 않아야시각화 직전까지. 잎을 제거하거나 손상시키지 않고 이상적으로, 치료는 어떤 식물에 직접 적용한다 :이 문제의 제...

엽록체는 광합성과 다른 많은 대사 과정을 담당하는 식물 세포의 동적 소기관입니다. 엽록체의 신호 경로는 또한 식물의 생리학 및 발달에 상당한 영향을 미치며, 환경 스트레스, 병원균 및 심지어 잎 모양1-6에 대한 식물의 반응을 조정합니다. 최근 생물학자들은 엽록체 구조에 대해 잘 이해되지 않은 측면, 즉 엽록체7의 표면에서 뻗어 있는 매우 얇은 기질로 채워진 세뇨관인 스트로뮬(stromules)에 관심을 갖게 되었습니다.
스트로뮬의 생물학적 기능은 아직 알려져 있지 않으나, 스트로뮬의 빈도는 환경적 자극7-9에 대한 반응으로 변하는 것으로 알려져 있으며, 스트로뮬은 세포소기관6 간에 신호 분자를 전달할 수 있다. 모든 유형의 플라스티드(녹색, 광합성 엽록체뿐만 아니라 투명 류코플라스트, 전분으로 채워진 아밀로플라스트, 색소 염색체, 몇 가지 유형의 플라스티드)가 스트로뮬을 만들며, 스트로뮬은 현재까지 조사된 모든 육상 식물 종에서 발견됩니다. 스트로뮬은 동적으로 확장 및 축소되어 몇 초 내에 나타나거나 사라지거나 오랫동안 상대적으로 정지해 있을 수 있습니다. 스트로뮬 생물학자들이 직면한 주요 장애물 중 하나는 스트로뮬이 종종 극적으로 다른 방법, 조직 및 종을 사용하여 연구되어 스트로뮬 생물학 문헌 간의 비교가 어렵다는 것입니다. 앞으로 스트로뮬을 연구하는 데 사용되는 실험 시스템에 대한 표준 관행과 철저한 설명은 엽록체 형태학의 이러한 유비쿼터스 특징의 기능을 발견하는 데 중요할 것입니다.
여기에서는 Nicotiana benthamiana 잎의 표피 엽록체에서 스트로뮬 형성을 시각화하는 방법을 설명합니다. 중엽소에서 엽록체는 큰 3차원 세포로 빽빽하게 밀집되어 있어 컨포칼 현미경으로 스트로뮬을 정확하고 빠르게 시각화하기가 어렵습니다. 대조적으로, 표피 세포는 상대적으로 편평하고 엽록체를 더 적게 함유하고 있으며 잎 표면에 있어 스트로뮬을 쉽고 빠르게 시각화할 수 있습니다. N. benthamiana는 많은 식물 종과 달리 N. benthamiana의 표피에 있는 모든 세포가 엽록체를 만들기 때문에 이러한 실험에 이상적인 모델 시스템입니다10. 애기장대(Arabidopsis thaliana)를 포함한 대부분의 식물의 표피에서는 기공 보호 세포에만 엽록체가 있는 반면 다른 표피 세포에는 투명하고 상대적으로 비정형이며 비광합성인 플라스티드인 "백혈질체"가 있습니다9,11,12. 따라서 A. thaliana 표피의 단일 시야는 한 쌍의 보호 세포에서 소수의 엽록체만 보여줄 수 있는 반면, N. benthamiana 표피의 시야에는 수십 또는 수백 개의 엽록체가 포함됩니다. 그러나 여기에 설명된 모든 방법은 스트로뮬 생물학의 다른 질문을 조사하기 위해 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 A. thaliana9의 leucoplast stromules를 연구하기 위해 동일한 접근 방식을 사용했습니다.

<table><tbody><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fischer-Scientific</td><td>S320-1</td><td></td></tr><tr><td>소르비톨</td><td>시그마-알드리치</td><td>S1876</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>피셔-바이오테크</td><td>BP121</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221279</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0250</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>레이저 스캐닝 컨포칼 현미경&nbsp;</td><td>Carl Zeiss Inc</td><td>모델: LSM710</td><td></td></tr><tr><td>Carboxyfluorescein diacetate (CFDA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21879&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드 (DMSO)</td><td>EMD</td><td>MX1458-6</td><td></td></tr><tr><td>Waring 블렌더</td><td>Waring&nbsp;</td><td>모델: 31BL92</td><td></td></tr><tr><td>피지</td><td>fiji.sc</td><td></td><td>생물학적 이미지 분석을 위한 오픈 소스 소프트웨어</td></tr></tbody></table>

형광 현미경으로 stromule 주파수를 시각화

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules 또는 "stroma-filled tubules"는 엽록체 표면에서 좁고 관 모양으로 뻗어 있는 것으로, 식물 세포에서 보편적으로 관찰되지만 그 기능은 여전히 신비로 남아 있습니다. 스트레스에 대한 식물 반응을 조정하는 엽록체의 역할에 대한 관심이 높아짐에 따라, 스트로뮬 역학을 빠르고 정확하게 시각화할 수 있는 형광 현미경 및 단백질 형광단의 발전에 힘입어 스트로뮬 및 엽록체 신호 역학과의 관계에 대한 관심이 최근 몇 년 동안 증가했습니다. 여기에서는 엽록체 스트로뮬 생물학을 조사하기 위한 우수한 모델 시스템인 Nicotiana benthamiana의 표피 엽록체에서 스트로뮬 빈도를 분석하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 또한 잎에서 엽록체를 추출하여 엽록체 스트로뮬을 체외에서 시각화하는 방법도 제공합니다. 마지막으로, 환경 스트레스, 화학적 처리 또는 유전자 침묵과 같은 자극에 대한 반응으로 스트로뮬 빈도의 차이를 분석하기 위한 샘플링 전략과 통계적 접근 방식을 간략하게 설명합니다. 연구원들은 이러한 프로토콜을 시작점으로 사용하여 엽록체가 스트로뮬을 만드는 방법과 이유를 탐구하기 위한 혁신적인 실험을 위한 새로운 방법을 개발할 수 있습니다.

이 프로토콜은 젊은 N.의 자엽에서 하루 밤에 stromule 주파수를 시각화하는 데 사용 된 benthamiana 모종. Z- 스택에서 슬라이스는 하나의 이미지 (그림 1A)에 병합되었다. 시각적 인 목적을 위해, 그 이미지는 흐릿한과 기질 블랙 (그림 1B)를 나타나도록 반전했다. 엽록체는 하나 더 stromules (녹색 별표)를 갖지 않는 또는 적어도 하나 stromule (마젠타 별표)을 갖는 것으로 분류되었다. 시각 87 표피 엽록체 중 33 stromules 있습니다. 따라서,이 판의 stromule 주파수는 37.9 %이다. 이 분석을 이용하여, 프로토콜은 밤낮 24 식물 총 21 중에 다른 식물 (식물 당 리프)에 대해 반복 하였다. 하...

엽록체의 표면에서 뻗어 있는 스트로마로 채워진 세뇨관인 엽록체 스트로뮬의 역학을 조사하기 위한 프로토콜이 설명되어 있습니다.

형광 현미경으로 Stromule 주파수를 시각화

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 잎 내부에서 생세포 공초점 형광 현미경을 사용하여 스트로뮬(stromule)의 빈도를 시각화하고 결정하며, 잎에서 추출한 엽록체를 이용해 인비트로(in vitro)에서 스트로뮬을 시각화하는 것입니다. 이러한 실험 방법은 스트로뮬의 기능을 밝혀냄으로써 식물 세포 생물학 및 엽록체 연구의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술들의 주요 장점은 매우 역동적인 엽록체 구조임에도 불구하고 재현성 있고 견고한 데이터를 생성한다는 점입니다.일부 연구에서 스트로뮴(stromule) 형성에 세포골격과 같은 세포질 구조가 필요하다는 점이 시사되었기에, 저희는 엽록체 분리 연구를 고안하게 되었습니다. 이에 따라 세포를 파쇄한 후에도 스트로뮴이 여전히 형성될 수 있는지 확인하기로 했습니다. 잎 시료를 준비하려면, 매우 날카로운 면도날을 사용하여 Nicotiana benthamiana 잎의 작은 조각을 절단하는 것부터 시작하십시오.잎 절편을 자른 직후, 물이 채워진 5 mL 주사기에 담그십시오. 그다음, 주사기 내부의 공기를 제거하고, 손가락으로 주사기 입구를 막은 상태에서 플런저를 당겨 진공 상태를 만드십시오. 잎 절편이 손상되지 않도록 플런저를 천천히 놓으십시오.그 후 공기 제거 과정을 2~3회 반복하거나, 공기가 모두 제거되어 잎이 짙은 녹색으로 보일 때까지 반복합니다. 슬라이드 글라스에 물 한 방울을 떨어뜨리고, 그 위에 잎 절편을 올립니다. 그다음 잎 윗부분에 물 한 방울을 더 추가하고 커버 글라스를 덮습니다.공기 방울이 있다면, 방울이 제거될 때까지 커버 슬립을 가볍게 두드립니다. 투과광과 20x 대물렌즈를 사용하여 잎 단면의 중앙 근처 시야에 초점을 맞추고, 여러 개의 엽록체가 동시에 보이도록 합니다. 나중에 필요한 경우 세포 유형을 구분할 수 있도록 투과광 이미지를 저장합니다.그런 다음 사용 중인 형광체에 적합한 여기 및 방출 필터를 갖춘 레이저 조명으로 전환하고, 다른 이미지를 저장합니다. 현미경 소프트웨어를 사용하여 GFP 채널을 선택하고, 핀홀 조리개를 1 airy unit으로 조정합니다. 레이저 스캐닝을 선택하여 샘플 시각화를 시작한 다음, GFP 채널과 검출기 게인(detector gain)을 클릭하여 stromule이 명확하게 시각화되는 범위 내에서 레이저 출력을 최소화합니다.다음으로, 시야 내의 잎 표피를 통해 일련의 이미지를 수집할 Z 스택 실험을 준비합니다. Z 스택이 신속하게 수집될 수 있도록 스캔 속도와 이미지 해상도를 필요에 따라 조정하십시오. 그 후, 추후 분석을 위해 Z 스택을 저장합니다.Image J를 사용하여 소프트웨어 내의 최대 강도 투영(maximum intensity) 기능을 통해 Z 스택을 단일 이미지로 병합합니다. 그런 다음 이미지 내의 모든 엽록체를 식별하고 수동으로 계수합니다. 각 엽록체에 대해, 병합된 Z 스택 이미지에서 엽록체로부터 하나 이상의 스트로뮬(stromule)이 뻗어 나와 있는지 시각적으로 판별합니다.손상되지 않은 엽록체를 추출하려면 다음 시약을 사용하여 차가운 추출 완충액을 준비하십시오. 그다음 NaOH와 HCl을 사용하여 pH를 6.9로 조절하고, 사용 전까지 냉장 보관하십시오. 분리 완충액을 준비하고 pH를 7.6으로 조절하십시오.잎이 유전적으로 부호화된 스트로마 형광단백질을 발현하지 않는 경우, Carboxyfluorescein diacetate 또는 CFDA 용액을 준비합니다. 엽록체를 분리하기 위해, 여러 식물에서 약 5~10g의 잎을 채취하여 찬물로 짧게 헹굽니다. 그 후 즉시 잎을 50mL의 차가운 추출 버퍼로 옮깁니다.블렌더를 사용하여 짧게 여러 번 작동시켜 잎을 갈아낸 후, 거즈를 두세 겹으로 겹쳐 혼합물을 여과하여 잎 찌꺼기를 제거합니다. 추출된 엽록체를 50 milliliter 원심분리관 두 개에 나누어 담고, 750 x g에서 1분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고, 10 milliters의 isolation buffer를 사용하여 녹색 엽록체를 재부유시킵니다.그런 다음 750 x g에서 1분 동안 다시 원심분리하고, 상층액을 제거한 후 분리 버퍼를 사용하여 엽록현탁액의 최종 부피가 5 mL가 되도록 재현탁합니다. 만약 엽록체가 플라스티드 표적 형광 단백질을 발현하는 형질전환 식물에서 유래한 경우, 엽록현탁액 20 µL를 슬라이드 글라스에 옮기고 커버 글라스를 덮습니다. 그런 다음 현미경 관찰을 수행합니다.플라스티드 표적 형광 단백질을 발현하지 않는 식물의 엽록체를 염색하려면, 분리 완충액에 있는 5 mL의 엽록체에 50 mM CFDA 스톡 5 µL를 첨가합니다. 엽록체를 5분 동안 배양한 후, 소량을 슬라이드로 옮기고 커버 슬립을 덮어 현미경 관찰을 수행합니다. 마지막으로, FITC 또는 GFP 필터 세트와 20x 대물렌즈를 사용하여 여러 개의 엽록체를 동시에 시각화합니다.또는 단일 분리 엽록체를 시각화하기 위해 더 높은 배율의 대물렌즈를 사용합니다. 여기에는 어린 N.Benthamiana 묘목의 하배축에서 GFP 기공 빈도를 보여주는 병합 스택이 제시되어 있습니다. 이 패널에서는 스트로마가 검은색으로 보이도록 이미지를 탈색하고 반전시켰습니다.엽록체는 스트로물(stromule)이 없는 경우와 적어도 하나의 스트로물을 가진 경우로 구분하여 표시하였습니다. 관찰된 87개의 표피 엽록체 중 33개에서 스트로물이 확인되었으며, 해당 잎에서의 빈도는 37.9%였습니다. 이 그래프는 21개 서로 다른 식물에서 유래한 단일 잎의 수백 개 세포와 23,000개 이상의 엽록체를 분석한 결과를 나타냅니다.주간의 평균 스트로뮬(stromule) 빈도는 20.8 ± 1.8%였고, 야간의 평균 스트로뮬 빈도는 12.8 ± 0.9%였으며, Welch's T test 결과 주간의 빈도가 유의하게 더 높은 것으로 나타났습니다. 이 그림에서는 plastid-targeted GFP를 발현하는 N.benthamiana에서 분리한 엽록체 또는 CFDA를 사용하여 N.benthamiana 또는 Spinachia oleracea의 엽록체를 염색한 후 in vitro에서 엽록체 스트로뮬을 관찰하였습니다. 스트로뮬의 살아있는 세포 이미징을 수행할 때는 신속하게 작업하고 식물 조직의 조작을 최소화하는 것이 중요합니다.이 절차에 따라, 유전자 사이런싱이나 화학적 처리와 같은 다른 방법들을 사용하여 스트로뮴(stromule) 형성 및 기능에 관여하는 추가적인 분자 인자나 경로를 발견할 수 있습니다. 이 기술은 식물 세포 생물학 및 식물 면역학 연구자들이 세포 신호 전달 경로와 병원균에 대한 식물의 반응에서 스트로뮴의 역할을 연구하는 데 사용되어 왔습니다. 이 영상을 시청한 후에는 잎에서 스트로뮴 빈도를 계산하는 방법과 추출된 엽록체 내의 스트로뮴을 관찰하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.또한, 주사 전자 공초점 현미경에 공급되는 레이저와 전기 전압은 매우 위험할 수 있으므로, 이 장비를 사용하기 위한 시스템 요구 사항을 이해하는 것이 중요함을 기억하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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