간단한 한 단계 성인의 전체 마운트 준비에 대한 해부 프로토콜 초파리 두뇌

이 프로토콜의 전반적인 목표는 전체 마운트 분석에 적합한 잘 보존된 형태를 가진 뇌를 신속하게 생성할 수 있는 성인 초파리 뇌에 대한 간단한 1단계 해부 절차를 설명하는 것입니다. 이 방법은 신경 과학 및 유전학 분야의 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기에는 뇌 회로의 미세 매핑, 뉴런의 유전자 조작의 영향 연구, 유전자의 기능적 특성화가 포함됩니다.

이 기술의 주요 장점은 배우기 쉬운 절차가 포함된다는 것입니다. 그것은 10초 이내에 잘 보존된 형태를 가진 성인 파리 뇌를 해부하는 것을 용이하게 할 수 있습니다. 플라이 헤드를 둘러싼 외골격을 떼어내기 위해 집게를 놓을 때 필요한 운동량을 제어하려면 기술과 연습이 필요하기 때문에 이 방법의 비디오 시연은 매우 중요합니다.

이 작고 성가신 초파리는 우리에게 생물학적 원리에 대해 많은 것을 가르쳐 주었다. 또한 알츠하이머병, 파킨슨병과 같은 인간 질병의 원인과 치료법을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 1.2X 배율로 설정된 해부 현미경을 사용하여 마취된 파리를 움직이지 못하게 하고 복부가 위를 향하도록 하여 냉간 해부 용액에 담급니다.

집게를 해부판에 각각 160도에서 170도 각도로 유지한 다음 파리의 복부에 작은 힘을 가합니다. 이렇게 하면 파리가 움직이지 못하게 되고, 머리를 뒤로 15-25도 기울이고, 주둥이를 위쪽으로 펴야 합니다. 이 조작 후에는 아래 큐티클의 부드럽고 반투명한 영역이 분명해져야 합니다.

배율을 높이고 이 영역에 대한 초점면을 조정합니다. 주로 사용하는 손을 사용하여 한 쌍의 해부 집게를 잡고 팁을 닫도록 압력을 가합니다. 집게를 파리를 억제하는 집게에 수직으로 배치합니다.

큐티클의 부드럽고 반투명한 부분을 통해 집게의 닫힌 끝을 뚫고 뇌에 닿을 정도로 깊이 침투하지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 빠르지만 꾸준히 집게를 풀어 점이 열리고 플라이 헤드의 외골격이 찢어지도록 합니다. 집게 끝을 놓는 가속도를 사용하여 한 번의 동작으로 뇌 조직에서 외골격과 머리, 케이스, 눈과 기관을 연결하는 대부분의 부분을 부드럽게 제거합니다.

이제 온전한 뇌를 볼 수 있습니다. 겸자를 사용하여 흰색 섬유 기관 조직과 같은 나머지 부속 조직을 조심스럽게 제거하고 뇌를 당기거나 손상시키지 않도록 주의하십시오. 해부된 뇌 샘플과 관련 몸통을 약 1ml의 4%파라포름알데히드에 넣고 얼음 위에서 40-60분 동안

파라포름알데히드를 제거한 다음 뇌를 흡인하지 않도록 주의하면서 용액을 위아래로 세 번 피펫팅하여 1mL의 X PBS로 샘플을 헹굽니다. 다음으로, PBS를 제거한 다음 너트레이션으로 각각 5분씩 1mL의 X PBT로 5회 세척합니다. 적절한 희석액으로 관심 있는 1차 항체를 추가합니다.

그런 다음 너트레이션을 사용하여 섭씨 4도에서 밤새 샘플을 배양합니다. 1차 항체를 제거하고 1ml의 X PBT로 5-10분 동안 샘플을 5회 세척한 후 너트레이션으로 세척합니다. 적절한 희석 및 배양 시간에 세척된 샘플에 2차 항체를 추가합니다.

그런 다음 너트레이션으로 샘플을 1 X PBT 1 밀리리터로 각각 10 분 동안 6 번 세척합니다. 이 단계는 특이적으로 결합되지 않은 2차 항체를 제거하는 데 중요합니다. 1 X PBT 용액 1 밀리리터에 1 밀리리터 DAPI를 1 - 10, 000 희석하여 너트레이션을 사용하여 30 - 60 분 동안 샘플을 배양합니다.

마지막으로, 1 X PBS 1 밀리리터를 첨가한 다음 용액을 위아래로 세 번 피펫팅하여 샘플을 헹굽니다. 커버 슬립을 장착 슬라이드에 놓습니다. 절단 팁이 있는 피펫을 사용하여 하나의 X PBS 용액에 있는 뇌를 커버슬립으로 옮깁니다.

다음으로, 겸자를 사용하여 뇌와 신체를 분리한다. 미세한 피펫 팁을 사용하여 뇌 조직 주변의 액체를 제거합니다. 그런 다음 20-40 마이크로 리터의 페이드 방지 장착 매체를 추가합니다.

점성이 있는 매체를 바깥쪽으로 이동시키면서 뇌를 부드럽게 펼칩니다. 한쪽에서 시작하여 두 번째 커버슬립을 샘플에 부드럽게 내리고 뇌와 거품의 접촉을 최소화하도록 주의합니다. 슬립이 가라앉을 때까지 기다린 다음 실험실용 물티슈를 사용하여 슬립 가장자리에서 과도한 액체를 제거합니다.

작은 테이프 조각을 사용하여 커버슬립 쌍을 장착 슬라이드에 임시로 부착합니다. 샘플을 이미지화하려면 복합 형광 또는 컨포칼 현미경을 사용하십시오. 이 이미지는 동일한 성인 초파리의 전방 및 후방 모습을 보여줍니다.

세포핵은 DAPI 염색으로 시각화하고 뉴런은 팬 뉴런 마커와 항-ELAV 항체를 사용하여 라벨링했습니다. 도파민 또는 DA 뉴런은 항TH 항체 염색에 의해 밝혀졌습니다. 모든 이미지 채널에 대해 뇌의 양쪽에서 유사한 수준의 강도가 나타났습니다.

뇌의 전방과 후방을 확대하여 DA 신경 세포 클러스터를 자세히 검사할 수 있습니다. 쌍을 이루는 전방 내측 클러스터는 전방 이미지에서 볼 수 있으며, 쌍을 이루는 후방 내측 및 쌍을 이루는 후방 외측 클러스터는 뇌의 후방에서 볼 수 있습니다. 이러한 뉴런을 정량화한 결과, 생후 3일 된 수컷 w1118 균주파리는 일반적으로 전체 뇌의 PPM 클러스터에 27개의 DA 뉴런, 반구당 PPL 클러스터에 16개, 반구당 PAL 클러스터에 5개의 DA 뉴런을 가지고 있는 것으로 나타났습니다.

각 PAM에서 평균 97개의 DA 뉴런이 관찰되었으며, PAL 및 PAM 클러스터의 재구성clusters. 3D PAM 클러스터의 DA 뉴런이 PAL과 같은 다른 클러스터의 뉴런보다 상대적으로 크기가 작고 TH 염색이 약하다는 것을 보여주었습니다. 점점 더 많은 연구가 고등 뇌 기능의 기저에 있는 분자 경로와 신경 회로를 해부하고 인간의 뇌 질환을 모델링하기 위해 성체 파리의 뇌에 초점을 맞추

이러한 뇌 기반 연구에서는 형태가 잘 보존된 뇌 샘플을 효율적으로 준비해야 합니다. 이것은 대규모 뇌 기반 검사에서 특히 중요할 수 있습니다. 이 방법에 대한 아이디어는 집게에 파리를 잡으려고 애쓸 때 처음 떠올랐습니다.

대부분의 초파리 연구자들이 사용하는 끝이 뾰족한 겸자 대신, 셰브나는 끝이 뭉툭한 겸자를 사용해 보았고, 뇌를 해부하는 것이 더 쉽다는 것을 발견했다. 이 기술을 마스터하면 제대로 수행하면 10초 이내에 완료할 수 있습니다. 한 번은 단 하루 만에 한 번의 실험을 위해 6가지 유전자형을 가진 약 100개의 뇌를 해부한 적이 있습니다.

이 해부 절차는 간단해 보일 수 있지만 먼저 필요한 파리로 연습하는 것이 중요합니다. 조사자는 또한 파리 뇌를 파괴하지 않고 겸자를 배치하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다. 해부된 뇌는 RNA, 현장 혼성화, 뇌 조직에서 단백질 및 RNA 샘플 추출과 같은 다른 연구에 사용할 수 있습니다.

이 비디오를 보고 나면 형태가 잘 보존된 파리의 뇌를 해부할 수 있을 것입니다. 우리는 이 절차를 더 간단하고 빠르게 만들기 위해 개선 사항이 개발될 수 있을 것으로 예측합니다. 이는 향후 대규모 연구를 위해 자동화될 수 있습니다.

파라포름알데히드와 날카로운 해부 겸자로 작업하는 것은 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 정착액을 다룰 때는 장갑을 착용하는 등의 예방 조치를 취하고, 해부가 완료되면 즉시 겸자를 옆에 두기 전에 뚜껑을 씌우십시오.