간단한 한 단계 성인의 전체 마운트 준비에 대한 해부 프로토콜

본 프로토콜의 전반적인 목표는 성체 초파리(Drosophila) 뇌를 위한 간단한 1단계 해부 절차를 설명하는 것이며, 이를 통해 전층 분석(whole mount analysis)에 적합하도록 형태학적 구조가 잘 보존된 뇌를 빠르게 얻을 수 있습니다. 이 방법은 신경과학 및 유전학 분야의 질문들을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기에는 뇌 회로의 정밀 매핑, 뉴런의 유전적 조작 효과 연구 및 유전자의 기능적 특성 분석이 포함됩니다.

이 기술의 주요 장점은 배우기 쉬운 절차라는 점입니다. 이 방법을 통해 형태학적으로 잘 보존된 성체 초파리 뇌를 10초 이내에 해부하여 추출할 수 있습니다. 초파리 머리를 둘러싼 외골격을 떼어내기 위해 핀셋을 놓을 때 필요한 운동량을 조절하는 데는 숙련도와 연습이 필요하므로, 이 방법의 비디오 시연이 매우 중요합니다.

이 작고 성가신 초파리들은 생물학적 원리에 대해 많은 것을 가르쳐 주었습니다. 또한 이들은 알츠하이머병이나 파킨슨병과 같은 인간 질환의 원인과 치료법을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다. 1.2배 배율로 설정된 해부 현미경을 사용하여, 마취된 초파리를 고정하고 복부가 위를 향하도록 하여 차가운 해부 용액에 담급니다.

포셉을 해부판에 대해 160에서 170도 각도로 유지한 다음, 파리의 복부에 약간의 힘을 가합니다. 이렇게 하면 파리가 고정되면서 머리가 뒤쪽으로 15에서 25도 밀려나고 구각이 위쪽으로 확장됩니다. 이 조작 후에 구각 아래의 큐티클에서 부드럽고 반투명한 영역이 나타나야 합니다.

배율을 높이고 이 영역에 초점을 맞춥니다. 주로 사용하는 손으로 해부용 핀셋을 잡고 끝부분을 닫도록 압력을 가합니다. 파리를 고정하고 있는 핀셋에 수직이 되도록 핀셋을 배치합니다.

포셉의 닫힌 팁을 큐티클의 부드럽고 반투명한 영역에 찔러 넣되, 뇌에 닿을 정도로 너무 깊게 들어가지 않도록 주의합니다. 그다지 빠르게 그러나 일정하게 포셉을 벌려 초파리 머리의 외골격을 찢어냅니다. 포셉 팁을 벌릴 때 생기는 운동량을 이용하여, 외골격과 뇌 조직에 연결된 머리 케이스의 대부분, 눈 및 기관을 한 번의 동작으로 부드럽게 제거합니다.

이제 손상되지 않은 뇌가 보일 것입니다. 핀셋을 사용하여 뇌 본체를 당기거나 손상시키지 않도록 주의하면서, 하얀 섬유성 기관 조직과 같은 나머지 부수 조직들을 조심스럽게 제거하십시오. 적출한 뇌 샘플을 몸통과 함께 4% paraformaldehyde 약 1mL가 담긴 얼음 위 용기에 넣고 40분에서 60분 동안 보관하십시오.

파라포름알데히드를 제거한 후, 1 mL의 1X PBS를 사용하여 솔루션을 세 번나누어 파이펫팅하며 샘플을 헹구되, 뇌 조직이 흡입되지 않도록 주의하십시오. 다음으로 PBS를 제거하고 1 mL의 1X PBT로 5분씩 5회 너테이션(nutation)하며 세척합니다. 적절한 희석 배수로 원하는 1차 항체를 첨가하십시오.

그 다음, 샘플을 4 °C에서 누테이션(nutation)과 함께 하룻밤 동안 배양합니다. 1차 항체를 제거하고, 1 X PBT 1 mL를 사용하여 누테이션과 함께 5~10분씩 5회 샘플을 세척합니다. 세척된 샘플에 적절한 희석 배수와 배양 시간으로 2차 항체를 첨가합니다.

그 후, 샘플을 1 mL의 1X PBT로 각각 10분씩 6회 너테이션(nutation)하며 세척합니다. 이 단계는 비특이적으로 결합된 2차 항체를 제거하는 데 매우 중요합니다. 샘플을 1 mL의 1X PBT 용액에 1 mg/mL DAPI를 1:10,000로 희석한 용액에 넣고 30분에서 60분 동안 너테이션하며 배양합니다.

마지막으로, 1 X PBS 1 mL를 첨가하고 피펫으로 용액을 세 번 빨아들였다가 내뱉어 샘플을 헹굽니다. 마운팅 슬라이드 위에 커버 슬립을 놓습니다. 팁 끝을 자른 피펫을 사용하여 1 X PBS 용액에 있는 뇌 조직을 커버 슬립 위로 옮깁니다.

다음으로, 핀셋을 사용하여 뇌를 몸체에서 분리합니다. 미세 피펫 팁을 사용하여 뇌 조직 주변의 액체를 제거합니다. 그런 다음, 20~40 µL의 항퇴색 마운팅 용액을 첨가합니다.

점성 매질을 바깥쪽으로 밀어내면서 뇌 조직을 부드럽게 폅니다. 한쪽 끝부터 시작하여, 기포가 뇌 조직에 닿는 것을 최소화하며 두 번째 커버슬립을 샘플 위에 천천히 내립니다. 커버슬립이 안착되도록 기다린 후, 실험실용 와이프를 사용하여 커버슬립 가장자리의 과잉 액체를 제거합니다.

작은 테이프 조각을 사용하여 커버슬립 쌍을 마운팅 슬라이드에 임시로 부착합니다. 샘플을 이미징하려면 복합 형광 현미경 또는 공초점 현미경을 사용하십시오. 이 이미지들은 동일한 성체 Drosophila의 전면 및 후면 모습을 보여줍니다.

세포핵은 DAPI 염색으로 시각화하였으며, 뉴런은 범뉴런 마커(pan neuronal marker)와 anti-ELAV 항체를 사용하여 표지하였습니다. 도파민성(DA) 뉴런은 anti-TH 항체 염색을 통해 확인하였습니다. 모든 이미지 채널에서 뇌의 양측 간에 유사한 강도의 수준이 관찰되었습니다.

뇌의 전면과 후면을 확대하여 관찰함으로써 DA 신경세포 군집을 세밀하게 검사할 수 있습니다. 전면 영상에서는 쌍을 이룬 전내측 군집을 확인할 수 있으며, 뇌의 후면에서는 쌍을 이룬 후내측 및 후외측 군집을 확인할 수 있습니다. 이들 신경세포를 정량 분석한 결과, 3일 된 수컷 w1118 계통 초파리의 전뇌에는 일반적으로 PPM 군집에 27개의 DA 신경세포가 있으며, 각 반구의 PPL 군집에는 16개, PAL 군집에는 5개의 신경세포가 있는 것으로 나타났습니다.

PAM 클러스터 각각에서 평균 97개의 DA 뉴런이 관찰되었습니다. PAL 및 PAM 클러스터의 3D 재구성 결과, PAM 클러스터의 DA 뉴런은 PAL과 같은 다른 클러스터의 뉴런보다 상대적으로 크기가 작고 TH 염색이 더 약하게 나타났습니다. 점점 더 많은 연구가 고등 뇌 기능의 기저에 있는 분자 경로와 신경 회로를 분석하고, 인간의 뇌 질환을 모델링하기 위해 성체 초파리 뇌에 집중하고 있습니다.

이러한 뇌 기반 연구에서는 형태학적으로 잘 보존된 뇌 샘플을 효율적으로 준비하는 것이 필수적입니다. 이는 특히 대규모 뇌 기반 스크리닝에서 매우 중요할 수 있습니다. 본 방법은 제가 포셉으로 초파리를 잡는 데 어려움을 겪었을 때 처음으로 고안되었습니다.

대부분의 Drosophila 연구자들이 사용하는 끝이 뾰족한 핀셋 대신, Shebna는 끝이 뭉툭한 핀셋을 시도했고 이것이 뇌를 해부하는 데 더 쉽다는 것을 발견했습니다. 숙련되면, 이 기술은 적절하게 수행했을 때 10초 이내에 완료될 수 있습니다. 한 번은 단 하루 만에 한 가지 실험을 위해 여섯 가지 서로 다른 유전자형의 뇌 약 100개를 해부한 적이 있습니다.

이 해부 절차는 간단해 보일 수 있지만, 먼저 폐기 가능한 초파리를 사용하여 연습하는 것이 중요합니다. 연구자는 초파리 뇌를 손상시키지 않으면서 포셉의 위치를 잡는 데 어려움을 겪을 수 있습니다. 해부된 뇌는 RNA, in situ hybridization 및 뇌 조직에서의 단백질 및 RNA 샘플 추출과 같은 다른 연구에 사용될 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후, 형태학적 구조가 잘 보존된 상태로 초파리 뇌를 해부할 수 있게 될 것입니다. 향후 이 절차를 더 간단하고 빠르게 개선할 수 있을 것으로 예상하며, 이는 대규모 연구를 위해 잠재적으로 자동화될 수 있습니다.

파라포름알데히드와 날카로운 해부용 핀셋을 사용하는 것은 위험할 수 있다는 점에 유의하십시오. 고정액을 다룰 때는 장갑을 착용하는 등 예방 조치를 취하고, 해부가 완료되면 핀셋을 옆으로 치우기 전에 즉시 캡을 씌우십시오.