Name: 높은 해상도 단일 셀 형태학 초파리 에서 명과의 세포 상호 작용을 공부 하 고 다 색 FlpOut 기술의 응용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 학습하세요 Drosophila에서 MCFO 기술을 활용한 단일 세포 형태학 시각화 방법을. Gal4/UAS 시스템과 다색 레포터를 사용하여 복잡한 조직 내 세포 상호작용을 연구하고 발달생물학 연구에 적용할 수 있습니다.

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저자는 아 르 님 Jenett, Aljoscha Nern, 및 조언을 루빈 연구소의 다른 회원 들과 공유 되지 않은 시 약 및 confocal 이미지를 생성 하기 위한 Janelia 비행 빛 프로젝트 팀 감사 합니다. 저자 또한 원고에 의견에 대 한 갈리아 연구소의 회원을 감사합니다.

1. 멀티 컬러 FlpOut (MCFO) 실험에 대 한 준비 파리 참고: The MCFO 기술 소위 Flp 중재 중지 카세트 절단 (FlpOut)의 수정된 된 버전을 말합니다. 유전자 변형 MCFO 파리 열 충격 발기인 (hsp) 수행-Flp recombinase UAS 아래 다른 기자 제어. 각 기자 myristoylated (myr) 슈퍼 폴더 녹색 형광 단백질 (sfGFP), 피토 프 태그의는 10 년에서의 일반적인 백본 구성 됩니다 (예., 하, 플래그 또는 V5) 삽입 되었습니다. 결과 비 형광 단백질의 이름은 &#34; 스파게티 괴물 GFPs &#34; (smGFPs) 14 다른 epitope 태그에 대 한 특정 항 체를 사용 하 여 감지할 수 있습니다.
<ol><li>크로스 파리 MCFO 카세트와 hsp-Flp (hsp Flp; 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5)는 적절 한 폐해 GAL4 드라이버 라인에 (재료의 표 참조) .
	<ol><li>는 hsp 이미 25 ° C에 활성화 하 고 몇 셀 재결합 한 불특정 라벨을 선도 받을 수 시스템의 시키는 피하기 위하여 18 ° C에서 십자가를 설정 합니다. F1 세대를 18 ° C에서 약 20 일을 기다립니다. 열 후 (2 단계 참조) 충격, 25 ° C ( 그림 3)에서 날아 유지.</li>
	</ol></li></ol> 2. 열 충격 참고: 삽입 사이트 따라 hsp Flp의 효율은 달라질 수 있습니다; 그리고 따라서, 최적의 열 충격 시간 최적화가. 이 프로토콜에 대 한 hsp Flp X 염색체에 삽입 된 MCFO 비행 재고 사용 되었습니다 (재료의 표 참조).
<ol><li>전송 자손 단계 1.1에서에서 십자가의 (F1 세대 파리, 3-4 일) 음식과 열을 포함 하는 새로운 유리병에 물 욕조에 37 ° C에서 그들을 충격. 
	참고: 젊은 파리 (1-2 일)는 열 충격에 매우 민감합니다. 치료로 인 한 사망률을 줄이기 위해 열 충격을 수행 하기 전에 더 많은 일 1 또는 2를 기다립니다. 사용 F1 세대의 일부 컨트롤, 열 충격 없이 파리.</li>
	<li>열 충격 동안 스트레스 유발 사망률의 속도 감소 음식으로 일반 튜브에서 파리를 유지. 여성 및 남성 별도 튜브에 넣어.</li>
	<li>전체 유리병 균질 열 충격을 보장 하기 위해 물에 젖어 있는지 확인 합니다. 5-8 분 충격 적당 한 시작 지점으로 사용 하 여 스파스 많은 GAL4 드라이버 라인; 명과 셀의 라벨에 대 한 각 드라이버 및 실험 (짧은 또는 긴 열 충격 시간이 필요할 수 있습니다)에 대 한 충격 기간을 최적화 해야 합니다.</li>
	<li>열 충격 후 열 충격에서 회복 하기 위해 파리를 수 있도록 하기 위해 몇 분 동안 벤치에 가로로 튜브 하다. 
	참고: 그것은 튜브를 변경할 필요가 없습니다.</li>
	<li>25 ° C에서 파리를 유지 하 고 해 부 (3, 4 단계 참조) 그들 2 일 이상 열 충격 후 최적의 기자 식.</li>
</ol> 3. 해 부 준비 및 솔루션 <ol><li>해 부, 주 20 %paraformaldehyde (PFA)를 2 %PFA 솔루션의 20 µ L와 S2 세포 배양 매체의 180 µ L를 혼합 하 여 200 µ L PCR 튜브에 신선한 통 솔루션을 준비. 전과 해 부 동안에 얼음 통 솔루션 유지. 
	주의: PFA 독성 그리고 관리와 처리 해야 합니다. 
	참고: 혼합 S2 세포 배양 매체의 160 µ L 2% 솔루션 대신 4 %PFA 솔루션을 준비 하는 200 µ L PCR 튜브에 20 %paraformaldehyde (PFA)의 40 µ L.</li>
	<li>튜브 당 8-10 두뇌의 최대 유전자 당 1 개의 PCR 관을 사용 하 여 최적의 얼룩 결과.</li>
	<li>두뇌 세척 솔루션의 준비: 0.5% 소 혈 청 알 부 민, 0.5 %PBS 트라이 톤 X-100. 
	참고: 얼룩, 1%를 포함 하는 솔루션에 따라 트라이 톤 X-100 필요할 수 있습니다. Triton X-100의 높은 농도 조직에 항 체의 침투를 증가 하 고 그것은 깊은 조직 (예: 성인 초파리 뇌의 시 냅 스 지역) 안에 얼룩 지역 필요.</li>
	<li>차단 솔루션 준비: 3% 정상 염소 혈 청, 3% 정상 당나귀 혈 청, 그리고 0.5 %PBS 트라이 톤 X-100.</li>
	<li>두뇌 세척 솔루션 및 차단 솔루션의 몇 주 동안 4 ℃에 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>얼음에 깊은 우울증 웰 스 유리 접시를 넣고 각 채우기 다음 솔루션과 잘:와 70% 에탄올, 하나 PBS, S2 세포 배양 매체와 하나 하나.</li>
</ol> 4. 성인 뇌 해 부 <ol><li>3cm는 stereomicroscope의 무대에서 요리를 해 부하 고 차가운 S2 세포 배양 매체와 그것을 채우기. 조직 해 부 절차 동안 건강 한 유지에이 매체의 모든 해 실시. 
	참고: (이미지)에서 좋은 배경 대조를 제공 하는 블랙 실리콘의 몇 밀리미터 늘어서 해 접시를 사용 하 고 해 부 동안에 집게를 보존.</li>
	<li>CO 2 원하는 유전자의 파리 anesthetize.</li>
	<li>집게, 날개에 의해 파리를 잡아와 30에 대 한 차가운 70% 에탄올에 그것을 씻어 다음 추가 30에 대 한 차가운 PBS 가진 s s.</li>
	<li>깊은 우울증 잘 S2 세포 배양으로 가득으로 즉시 전송.</li>
	<li>동일한 유전자 형의 모든 파리에 대 한 동일한 절차를 반복 하 고 해 부, 조직 유지 됩니다 때까지 차가운 S2 세포 배양 매체에서 그들을 유지. 
	참고: Anesthetize 수 수 해 부 약 30 분의 기간에 S2 세포 배양 매체에서 긴 보육 시간 파리의 수는 조직 손상 될 수 있습니다만.</li>
	<li>집게와 함께 파리를 잡아와, stereomicroscope에서 잠수함 S2 세포 배양 매체에서 비행.</li>
	<li>머리는 시체의 나머지 부분에서 분리합니다. 본문을 삭제 하 고 S2 세포 배양 매체에 빠져들 머리를 유지. 그것은 매우 중요 한 해 부의 전체 기간에 대 한 집게로 머리를 잡아입니다. 머리를 시작 하는 경우는 조직 손상 없이 검색 하기 어려울 것입니다.</li>
	<li>항상 적어도 하나의 집게로 머리를 잡고 한쪽 눈을 꺼내 여 해 부를 시작 합니다. 그는 집게의 끝은 바로 피하려고 망막 아래는 조직 손상 아래 다는 것을 확인 하십시오. 다른 눈에 밖으로 끌어와 두뇌가 나타날 때까지 표 피를 제거 시작.</li>
	<li>제거 모든 tracheal 조직과 뇌 주변의 표 피 조직 깨끗 한 때까지 합니다. 최적의 얼룩 결과; 뇌 주변의 모든 tracheal 조직을 제거 확인 조직 고정 하 고 얼룩이 될 준비가 됩니다.</li>
	<li>차가운 S2에 모든 해 부 머리 고정 단계 시간 위하여 PFA 솔루션으로 그들을 전송 하기 전에 배양 세포 유지.</li>
</ol> 5. 성인 두뇌 얼룩 < ol> <li>전송 P10 피 펫과 격리 된 뇌 실 온 (RT)에서 PFA 솔루션으로. 조직 손상을 방지 하려면 해 부 후 두뇌를 전송 집게를 사용 하지 마십시오. 200 µ L PCR 튜브는 nutator에 있는 모든 단계를 수행 하십시오.</li>
	<li>튜브의 하단에 정착을 두뇌 허용 P200 피 펫과 오래 된 솔루션을 삭제 하기 전에 모든 단계. 발음은 조직 없이 상쾌한을 제거 하려고 합니다. 가벼운 노출에서 조직 보호.</li>
	<li>수정 2%의 200 µ L에서 두뇌 PFA S2 세포 배양 매체 1 h 또는 4% PFA 30 분. 재현성을 증가 하기 위하여 샘플 사이 동일한 고정 시간을 유지.</li>
	<li>세척 솔루션, 성인 뇌의 200 µ L에 각각 15 분의 3 (또는 이상) 세척 후 30 분에 대 한 솔루션을 차단의 200 µ L로 조직 차단. 솔루션을 차단에 더 이상 부 화 시간이 가능 하다.</li>
	<li>두뇌 두뇌 세척 솔루션 200 µ L의 총 볼륨 희석 주 항 체와 4 ° C에서 하룻밤 품. 
	참고: 보육 시간 사용 하는 항 체의 종류에 따라 달라질 수 있습니다. 더 이상 외피 필요할 수 있습니다.
	<ol><li>3 MCFO 마커의 라벨에 대 한 안티와 두뇌를 품 어-하 (1: 500), 반대로 플래그 (DYKDDDDK epitope) (1: 100), 및 안티-v 5 기본 항 체.</li>
		<li>기본 직접 활용 된 항 체는 정상적인 1 차 + 2 차 조합 대신 사용할 수 (예., 안티-V5:DyLight 549 (1: 200)). 이 경우에, 2 차 항 체로 직접 활용 된 항 체 치료. 
		참고: 각 유전자 형에 대 한 컨트롤을 확인 하는 얼룩의 특이성으로 일부 머리를 유지. 1 차적인 항 체 외피를 생략 하 고 다음 단계로 직접 이동.</li>
	</ol></li> <li>성인 뇌 세척 솔루션 (단계 3.3)의 200 µ L에 3 번 1 시간을 위한 조직을 세척 하 고 보조 fluorophore-어원이 같은 말/기본 직접 활용 된 항 체 두뇌 4 솔루션을 하룻밤 세척 희석으로 그들을 품 어 ° C 또는 200 µ L의 전체 볼륨에 RT에서 4 h 참고: 적절 한 항 체의 예: AlexaFluor 488 (1: 250), 안티-V5:DyLight 549 (1: 200) 및 DyLight 647 (1: 100)-항 체를 활용 시켰다.</li>
	<li>성인 뇌 세척 솔루션, 4 ° C에서 하룻밤 또는 RT에 1-2 h는 PBS의 200 µ L에서 최종 세척 뒤의 200 µ L에 1 시간에 3 번 두뇌 세척, PBS 최종 세척 단계 Triton X-100의 모든 흔적을 제거 하 고 필요 최적의 얼룩 결과입니다. 유리 coverslips에 방지 페이드 에이전트 설치 매체에 두뇌를 탑재.</li>
</ol> 6. 이미징에 대 한 두뇌의 장착가 위를 사용 하 여 적절 한 크기를 <ol>이미징은 트림 <li>스페이서. 고해상도 현미경 검사 법에 대 한 두 개의 유리 coverslips 사이 견본 및 이미징 스페이서 샌드위치. 
	참고: 이미징 스페이서는 얇은 (0.12 m m 두께) 접착제 스페이서 껍질 및 유리 coverslips 또는 현미경 슬라이드에 충실 하는 압축 하지 않고 표본의 장착 수.</li>
	<li>집게를 사용 하 여, 1 개의 표면에서 접착제 라이너를 제거 하 고 스페이서, 접착 면이 아래로, 유리 coverslip (22 m m x 60 m m)의 표면에 적용. 새로운 유리 coverslip 장착 매체의 10 µ L 적용.</li>
	<li>P10와 피 펫, 200 µ L 튜브에서 설치 매체의 드롭 옆 coverslip 두뇌를 전송. 조직, 함께 솔루션에 두뇌를 유지 하기 위해 일부 PBS 전송.</li>
	<li>P10와 피 펫, PBS에서 PBS의 양을 제한 하는 설치 매체의 드롭 두뇌를 이동 합니다. 설치 매체에 있는 표본 이미징 스페이서와 coverslip에 전송 합니다. 충분 한 설치 미디어를 사용 하 여 표본을 커버.</li>
	<li>는 스페이서의 상단에서 다른 접착제 라이너를 제거 하 고는 표본 위에 유리 coverslip 추가. 집게의 끝에와 함께 부드러운 압력 밀봉 접착제 영역에 적용 됩니다. 이미지 탑재 된 조직을 즉시 또는 나중에 분석-20 ° C에서 슬라이드 저장.</li>
</ol> 7. 이미지 수집 <ol><li>confocal 형광 이미지 40 X confocal 현미경을 사용 하 여 취득 스택 (나 = 1.2, 물 침수) 목표 또는 63 X (NA = 1.4, 기름 침수) 목표 (픽셀 크기 xy 평면;에서 1024 x 1024 = 두 개의 confocal 섹션 사이의 거리 = 0.5 µ m). 감지기 이득 및 오프셋 아무 포화 픽셀 및 0 픽셀 값은 이미지;에 존재 하는 방식으로 각 채널에서을 조정합니다 이 정보 손실 방지 및 검출기의 전체 동적 범위를 사용 하 여 보장. 
	참고: 지금까지 3D 영상 시간이 소요 때문에에 측정 다른 위치에서 동시에 여러 개의 샘플을 검색 하 여 자동화할 수 있습니다. 물 침수 목적으로 증발을 피하기 위해, 사용 하 여 특별 한 기름 침수 매체 굴절률 n = 1.33.</li>
	<li>Confocal 스택 최대 밀도 프로젝션, 채널 색조 및 밝기 조정에 변화를 처리 하 고 모든 표준 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 대조 (재료의 표 참조).</li>
</ol>

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</ol>

작가의 아무도 경쟁 또는 충돌 관심 있다.

이 프로토콜 높은 해상도에 관심의 조직 내에서 다른 세포 유형의 형태를 연구 하는 간단 하 고 효율적인 방법을 설명 합니다. MCFO 기술을 다른 epitope 태그로 여러 기자 색 확률적 라벨 (그림 2)에 대 한 조합에 사용 됩니다. Brainbow/Flybow15,,1617등 다른 방법과 마찬가지로 MCFO 증가 마커 coexpression 통해 레이블 다양성 셀 경계 세포 세포 상호 작용 연구에 대 한 시각화를 허용 합니다. 예를 들어 3 기자, 7 잠재적인 표식 조합 가능 하다. 이전 표시 방법에 비해, MCFO 기술을 보여줍니다 셀 밀도17라벨의 더 정확 하 고 쉽게 제어: Flybow 1.0 파리 익스프레스 단일 셀 라벨 더 어려운; 하 게 기본 마커 Fl...

명과, 신경 계통 (NS), 비 신경 세포 인구 했다 긴 신경 세포에 대 한 정적 프레임 워크를 제공 하 고 따라서 자세히 공부 하지 했다. 그러나, 인간, 명과 셀 NS (~ 90%)의 대다수를 구성 하 고 이다, oligodendrocytes, microglia 및 Schwann 세포를 포함 하 여 일부의 범주에 빠지다. 초파리에서 명과 NS에 있는 세포의 약 10%를 구성 합니다. 글에, 그들의 형태학과 기능 척추 동물1,2에서 발견 된 현저 하 게 유사 하다. 그들의 형태학 혈액-뇌 장벽 (BBB) 형성 epithelia, ensheathing, 사이토와 같은 셀을 포함 합니다.
다음 주 구조 이루어져 초파리 중앙 신경 시스템 (CNS): 신경 셀 시체;를 포함 하는 피 질 영역 neuropils 시 냅 스 연결 항구 다른 neuropiles; 연결 하는 크고 작은 축 삭 책자 CNS는 (그림 1)과 감각 기관과 근육을 연결 하는 주변 신경 명과 이러한 모든 해 부 구조와 관련 된 찾을 수 있습니다: 피 질 명과 (CG) 대뇌 피 질의 영역, 사이토 처럼 명과 (ALG) 및 neuropile 지역, ensheathing 명과 ensheathing 명과 (EG)에 또한 중앙 축 삭 책자와 주변 기기 연결 신경 (EGN), 그리고 마지막으로, 두 개의 시트 같은 명과, perineurial 명과 (PG) subperineurial (SPG)는 함께 전체 NS (그림 2)를 포함 하는 연속 층을 형성 하 고.
이전 연구는 명과 NS;의 개발에 중요 한 역할을 그들은 체계적으로 순환 인슐린 같은 펩 티 드에 반응 하 여 신경 세포 수를 모니터링 하 고 사이토 신경 젖 셔틀 같은 신경에 영양 지원을 제공, 먹어서3,4 여 죽어가는 신경 세포를 제거 , 5 , 6. 성숙한 NS에서 명과 BBB 유지, 신경 전달 물질을 차지 하 고 이온 항상성 유지, NS, 주요 면역 세포 대 식 세포 수 없기 때문에 BBB, 위반 시 냅 스 활동으로 동물 행동6 조절 역할 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11.
다른 폐해 하위 전문된 기능을 수행 하는 여부는 중요 한 미결 문제에 남아 있다. 그러나, 명과, 성인, 특히에 대 한 체계적인 게놈 넓은 분석 그들의 조작에 대 한 적절 한 유전 도구의 부족에 의해 방해 되어 있다. 여기, 셀 셰이프 셀을 복잡 한 상호 작용을 공부를 효율적이 고 쉬운 특성을 허용 하는 메서드가 제공 됩니다. 이 기술은 성인 초파리 뇌의 다른 폐해의 형태학 특성을 적용 하지만, 특정 GAL4 드라이버 사용에 따라 그것은 신경12,13 공부에 적응 수 있습니다. , intermingling 셀의 원리에 어떤 종류 어떤 발달 단계에 있는 조직.

<table><tbody><tr><td>수조</td><td>Grant</td><td>GD100</td><td></td></tr><tr><td>PCR 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>72.737.002</td><td></td></tr><tr><td>집게</td><td>Dumont</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>해부 접시 30 mm x 12 mmm</td><td>전자 현미경 과학</td><td>70543-30</td><td>유리 해부 접시</td></tr><tr><td>Pyrex 3 함몰 유리 스폿 플레이트</td><td>Corning</td><td>7223-34</td><td>유리 해부 플레이트</td></tr><tr><td>Sylgard Black</td><td>SYLGARD, Sigma-Aldrich</td><td>805998</td><td>숯으로 만든 가정용</td></tr><tr><td>ExpressFive S2 세포 배양 배지</td><td>Invitrogen</td><td>10486-025</td><td></td></tr><tr><td>20% PFA</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15713</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Roth</td><td>3051.3</td><td></td></tr><tr><td>일반 염소 혈청</td><td>Jackson Laboratories</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>정상 당나귀 혈청</td><td>Jackson Laboratories</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>토끼 HA-tag</td><td>세포 신호</td><td>C29F4</td><td>1 차 항체, 희석 1 : 500</td></tr><tr><td>Rat FLAG-tag</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-06712</td><td>1 차 항체, 희석 1 : 100</td></tr><tr><td>마우스 V5 - 태그 : DyLight 549</td><td>AdSerotec</td><td>0411</td><td>Conjugated 항체, 희석 1:200</td></tr><tr><td>anti-rabbit AlexaFluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11034</td><td>2차 항체, 희석 1:250</td></tr><tr><td>anti-rat DyLight 647</td><td>Jackson Laboratories</td><td>712-605-153</td><td>2차 항체, 희석 1:100</td></tr><tr><td>Vecta Shield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>SlowFate Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S36937</td><td></td></tr><tr><td>Secure Seal Spacer</td><td>Grace Biolabs</td><td></td><td>주문 회사에 문의</td></tr><tr><td>현미경 커버 유리 22 X 60 mm</td><td>Marienfeld</td><td>101152</td><td></td></tr><tr><td>현미경 커버 유리 22 x 22 mm</td><td>Roth</td><td>H874</td><td></td></tr><tr><td>스테레오 현미경, 라이카 MZ6</td><td>라이카</td><td></td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 LSM710</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersol</td><td>Zeiss</td><td>518 F</td><td>형광 현미경 검사용 이멀젼 오일, 할로겐</td></tr><tr><td>프리 Immersol</td><td>Zeiss</td><td>W 2010</td><td>이멀젼 오일, 무할로겐</td></tr><tr><td>R56F03-GAL4 (EG)</td><td>블루밍턴 스톡 센터</td><td>39157</td><td>GAL4 드라이버</td></tr><tr><td>R86E01-GAL4 (ALG)</td><td>블루밍턴 스톡 센터</td><td>45914</td><td>GAL4 드라이버</td></tr><tr><td>hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>64085</td><td>UAS reporter (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php)</td></tr><tr><td>Fiji (Image J)</td><td></td><td></td><td>자동</td></tr><tr><td>스캔을 위한</td> 이미지 분석 소프트웨어<td>Multi Time Macro</td><td>Zeiss</td><td></td> 소프트웨어</tr></tbody></table>

높은 해상도 단일 셀 형태학 초파리 에서 명과의 세포 상호 작용을 공부 하 고 다 색 flpout 기술의 응용

Application of MultiColor FlpOut Technique to Study High Resolution Single Cell Morphologies and Cell Interactions of Glia in Drosophila

셀 다른 형태학 및 복잡 한 해 부 관계를 표시합니다. 그들의 이웃과 셀 어떻게 상호 작용 합니까? 상호 작용 세포 유형 사이 또는 지정 된 형식 내에서 심지어 다릅니까? 그들은 어떤 종류의 공간 규칙을 따라 합니까? 이러한 근본적인 질문에 비보에 대 한 답변 고해상도 단일 셀 라벨에 대 한 도구의 부족으로 지금까지 방해 되어 있다. 여기, 상세한 프로토콜 멀티 컬러 FlpOut (MCFO) 기법으로 단일 세포를 대상으로 제공 됩니다. 이 방법은 3 다르게 태그 기자 (HA, 플래그 및 V5) UAS 통제 transcriptional 터미네이터 2 개의 FRT 사이트 (FRT-정지-FRT)에 의해 형벌에 의해 자동 보관을 사용 합니다. 열 충격 펄스 유도 열 충격 유도 Flp recombinase, 개별 셀에 FRT-정지-FRT 카세트를 임의로 제거 하 식: 식 또한 GAL4 드라이버를 표현 하는 셀에만 발생 합니다. 이것은 높은 해상도에서 개별 셀 형태학의 시각화 수 있는 특정된 셀 종류의 서로 다른 색된 셀의 배열. 예를 들어, MCFO 기술 초파리 두뇌의 다른 폐해의 형태학을 시각화 하기 위해 특정 glial GAL4 드라이버와 결합할 수 있습니다.

이 섹션에서는 초파리 두뇌의 MCFO 기술을 사용 하 여 얻을 수 있는 결과의 예를 보여 줍니다. 그림 3 방법의 회로도 보여준다. 3 명의 다르게 막 태그 기자 (myr-smGFP-하, myr-smGFP-플래그 myr-smGFP-V5) UAS 통제 transcriptional 터미네이터 2 개의 FRT 사이트 (FRT-정지-FRT)에 의해 형벌에 의해 자동 보관 됩니다. 열 충격 펄스 유도 임의로 개별 셀에서 FRT-정지-FRT 카세트를 제거 하는 Flp recombinase 표현 합니다. 이것은 서로 다른 색된 셀 형식의 셀을 주어진된, GAL4 드라이버 사용 하 여 지정 된 배열에.
전반적으로, 7 색상 수 있습니다. ...

셀 다른 형태학을 표시 하 고 그들의 이웃과 상호 작용의 다양 한 설정. 이 프로토콜에는 단일 세포의 형태를 공개 하 고 확고 Gal4/UAS 식 시스템을 사용 하 여 세포 세포 상호 작용을 조사 하는 방법을 설명 합니다.

높은 해상도 단일 셀 형태학 초파리 에서 명과의 세포 상호 작용을 공부 하 고 다 색 FlpOut 기술의 응용

Cells display different morphologies and complex anatomical relationships. How do cells interact with their neighbors? Do the interactions differ between ...

이 기술의 전반적인 목표는 복잡한 해부학적 조직 내에서 단일 세포의 형태를 시각화하여 Drosophila의 세포 간 상호작용 연구를 간소화하는 것입니다. 이 방법은 초파리를 이용하여 복잡한 형태 및 세포 간 상호작용에 관한 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 모든 조직 및 모든 발달 단계에서 단일 세포 형태 연구에 적용 가능하다는 점입니다.본 실험 절차의 시연은 저희 실험실의 기술자인 Anja Kieser가 맡아 진행하겠습니다. MCFO 기술은 표준 FlpOut 기술을 다음과 같이 수정하여 적용합니다. 열충격 FLP 재조합효소와 서로 다른 리포터들은 UAS 제어 하에 유지되지만, 각 리포터는 에피토프 태그 사본이 삽입된 myristoylated superfolder GFP라는 공통 백본을 가집니다.결과적으로 생성된 비형광 단백질은 스파게티 몬스터 GFP라고 명명하며 항체를 통해 식별합니다. 절제 횟수에 따라 서로 다른 에피토프 조합이 발현됩니다. HSP 프로모터는 25 °C에서 약간 활성화되므로, 완전히 비활성 상태인 18 °C에서 교배를 설정하십시오.그 후, F1 세대를 얻기 위해 약 20일 동안 기다립니다. F1 암컷과 수컷을 각각 별도의 바이알에 분류합니다. 열충격을 가하기 위해, 이들이 3~4일 되었을 때 먼저 신선한 먹이가 담긴 바이알로 옮깁니다.어린 초파리는 열 충격에 너무 민감할 수 있습니다. 다음으로, 바이알을 37 °C 항온수조로 옮깁니다. 균일한 열 충격을 가하기 위해 바이알을 깊게 담급니다.글리아 세포의 희소 표지를 위해서는 5분에서 8분 동안 열 충격을 준 후 최적화하십시오. 최적의 열 충격 시간은 표적 세포를 희소하게 표지하게 되며, 이 관계는 사용되는 특정 GAL4 드라이버에 따라 달라집니다. 열 충격 후에는 바이알을 벤치 위에 몇 분 동안 수평으로 눕혀 냉각시키십시오.이제 초파리를 동일한 바이알에서 25 °C로 유지하십시오. 2일 후면 리포터 발현이 최적 상태가 되며 초파리를 해부할 수 있습니다. 준비 단계로, 딥 디프레션 웰(deep depression well) 3개를 얼음 위에 놓으십시오.한 개의 웰에는 70% ethanol을, 다른 웰에는 PBS를, 나머지 하나에는 S2 세포 배양 배지를 채웁니다. 그런 다음, 검은색 실리콘이 깔린 3cm 해부 접시에 차가운 S2 배지를 넣습니다. 조직의 상태를 건강하게 유지하기 위해 모든 해부 과정은 S2 배지 내에서 수행합니다. 이제 이산화탄소로 초파리를 마취시킵니다.그 다음, 핀셋이나 깃털을 사용하여 파리를 차가운 70% ethanol에 약 30초 동안 넣었다가, 이어서 차가운 PBS에 약 30초 동안 넣은 후 차가운 S2로 옮깁니다. 이렇게 하여 해부할 모든 파리를 세척합니다. 일반적으로 한 유전자형당 최대 10마리의 파리면 충분합니다. 이제 30분 이내에 모든 뇌를 적출하십시오.먼저 머리를 몸통에서 분리하고 몸통은 폐기합니다. 해부 과정 전반에 걸쳐 반대쪽 손으로 머리를 계속 고정하고 있어야 하며, 그렇지 않으면 머리를 다시 잡기가 매우 어렵습니다. 그다음, 망막 바로 아래의 조직만을 잡고 눈 하나를 뽑아냅니다.그 다음 반대쪽 눈을 제거하여 뇌와 주변 조직을 노출시킵니다. 이어서 뇌 조직이 깨끗하게 보일 때까지 뇌 주변의 모든 기관 조직과 남아있는 큐티클을 제거합니다. 최적의 염색 결과를 얻기 위해서는 모든 기관 조직이 반드시 제거되어야 합니다.이것으로 고정을 위한 뇌 준비 단계가 완료되었습니다. 분리한 뇌를 차가운 S2 용액에 보관하면서 모든 뇌의 해부를 진행하십시오. 최적의 염색 결과를 얻기 위해 마이크로 원심분리 튜브당 최대 10개의 뇌를 준비하는 것이 좋습니다. P10 피펫 팁을 사용하여 분리된 뇌를 고정액이 담긴 200 µL 마이크로 원심분리 튜브로 옮기십시오.포셉을 사용하여 뇌를 취급하지 마십시오. 조직은 빛이 차단된 상태에서 배양하십시오. 용액을 옮길 때 뇌 조직이 흡입되지 않도록 주의하십시오.고정액을 제거하기 위해 세척액으로 15분씩 3회 이상 세척합니다. 그 다음, 블로킹 용액을 사용하여 조직을 30분 이상 블로킹합니다. 이어서 블로킹 용액을 세척액에 희석한 1차 항체로 교체하고, 뇌 조직을 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.1차 항체를 제거하기 위해 세척액으로 1시간 동안 세 번 세척합니다. 그다음, 세척액에 2차 형광 표지 항체를 첨가하고 뇌 조직을 4°C에서 하룻밤 동안 또는 상온에서 4시간 동안 배양합니다. 결합되지 않은 항체를 완전히 세척하기 위해 세척액으로 1시간 동안 세 번 세척한 후, PBS로 더 길게 세척합니다.그 다음 뇌 조직을 마운팅합니다. 이미징 스페이서가 포함된 커버슬립 두 개를 준비합니다. 스페이서 내부와 추가 커버슬립 위에 항퇴색제가 포함된 마운팅 용액 10 microliters를 도포합니다.다음으로 P10 피펫을 사용하여 뇌 조직을 커버슬립으로 옮기고, PBS와 함께 배지 옆에 놓습니다. 이때 조직이 마르지 않도록 주의하십시오. 이제 피펫을 사용하여 뇌 조직을 마운팅 배지로 조심스럽게 이동시킨 후, 최종적으로 스페이서 내의 배지로 옮기고 핀셋으로 배열합니다.그런 다음, 스페이서의 접착 라이너를 제거하고 커버슬립을 부착합니다. 핀셋을 사용하여 약간의 압력을 가해 커버슬립을 고정하고, 즉시 이미징을 진행하거나 추후 분석을 위해 슬라이드를 -20°C에서 보관합니다. 설명된 방법들을 사용하여, FRT 사이트로 둘러싸인 전사 종결자에 의해 세 가지 서로 다른 막 표지 리포터가 비활성 상태로 유지됩니다.동물에게 열 충격을 가하면 FLP 재조합효소가 발현되어 터미네이터를 무작위로 제거하며, 이로 인해 서로 다른 조합의 리포터가 발현됩니다. 전반적으로, 이러한 다양한 리포터 조합은 일곱 가지의 서로 다른 색상을 제공하므로, 여러 단일 세포 형태를 개별적으로 시각화하고 연구할 수 있습니다. EG-GAL4 및 ALG-GAL4를 사용하여 다양한 열 충격 시간을 테스트하였습니다.단일 세포 표지 분석은 뇌의 촉각엽 영역에서 수행되었습니다. EG-GAL4 드라이버는 촉각엽 표면을 모두 둘러싸고 있는 초포성 글리아 세포에서 발현되었습니다. 이에 비해 ALG-GAL4에 의해 표적화된 성상교세포 유사 글리아는 촉각엽의 대부분 서로 겹치지 않는 영역을 덮고 있었습니다.이 영상을 시청하고 나면 용액 내의 단일 세포를 표지하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이는 초파리, 그리고 원칙적으로 binary system인 GAL4 UAS를 적용할 수 있는 모델 생물체를 사용하여 이들의 복잡한 해부학적 관계를 이해하기 위함입니다. 이 절차를 처음 시도할 때는 최상의 결과를 얻기 위해 먼저 열 충격 시간을 최적화하고, 염색 프로토콜의 개별 단계들을 최대한 충실히 따르는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Behavior

행동

우리는 공촛점 현미경과 형광 염료를 사용하여 라이브 파리 애벌레의 소설 내부 아웃 조직 준비에 Glia - 신경근육학 시냅스의 구조 기능을 설명했다. 우리는 HRP에 형광 기본 항체 살 신경 터미널로 표시하고, 또한 형광 Dextrans와 perisynaptic 공간을 시각.

라이브를 떠올리 Drosophila</em형광 염료와 함께> Glial - 신경근육학 융티온

여기 GFP 태그 glial 세포와 결합하여 라이브 미세 분석을 사용하여 개발 Drosophila의 눈을 glial 세포의 마이 그 레이션을 검사하기 위해 프로토콜을 설명합니다.

Drosophila 아이 Imaginal 디스크에 Glial 세포 이미징 마이 그 레이션 라이브

Drosophila의 hemocytes은 개발 배아의 전체를 통해 분산. 이 프로토콜은 찬란 표시된 hemocytes와 배아를 사용하여 이러한 마이 그 레이션을 마운트 및 이미지하는 방법을 보여줍니다.

라이브 영상 Drosophila melanogaster 배아 Hemocyte 마이 그 레이션

단일 Drosophila Ommatidium의 해부 및 이미징

이 비디오는 신경교세포의 단세포 이미징을 위한 형질전환 초파리 뇌의 면역형광 염색을 보여줍니다. 뇌는 신경교세포 특이적 재조합효소 시스템의 제어 하에 항원 항원결정기의 다양한 조합과 융합된 막 표적 단백질을 발현합니다. 분리되고 고정된 뇌는 항원 항원결정기에 특이적인 1차 항체로 염색된 후 형광단 접합 2차 항체로 염색됩니다. 이 라벨링을 통해 다양한 뇌 영역에 걸쳐 서로 다른 신경교세포 하위 집단을 동시에 이미징할 수 있습니다.

신경교세포의 단세포 이미징을 위한 초파리 뇌의 면역형광 염색

우리는 중추 신경 시스템에 하나의 뉴런을 라벨에 대한 기술 (CNS)의...

의 중추 신경계에 단일 세포의 라벨<em&gt; Drosophila melanogaster</em

이 프로토콜은 그대로 애벌레 뇌의 맥락에서 라이브 세포 이미징을 수행하는 데 사용하는 효율적인 방법을 자세히 설명합니다. 라이브 세포 이미징 방식은 지속적으로 이전에 간과 된 메커니즘을 밝혀, 비대칭 신경 줄기 세포 분열의 연구뿐만 아니라 다른 신경 인성과 발달 과정에 대한 귀중한 있습니다.

의 라이브 영상<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레 Neuroblasts

이 프로토콜 설명 해 부와 성인 초파리 melanogaster 의 immunostaining 뇌 조직. 특히,이 프로토콜은 신경 개발의 많은 측면을 기본 일반적인 원리를 밝히기 위해 정확 하 게 사용할 수 있는 예제 신경 하위 집합으로 초파리 버섯 몸과 포토 리셉터 뉴런의 사용을 강조 표시 합니다.

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

초기 초파리 배아에서는 많은 소기관이 운동성입니다. 원칙적으로, 그들은 특정 형광 프로브를 통해 실시간으로 이미징 될 수 있지만, 달걀 껍질은 배아에 직접 적용하는 것을 방지합니다. 이 프로토콜은 미세주입을 통해 이러한 프로브  를 도입한 다음 입자 이미지 속도측정법을 통해 벌크 소기관 움직임을 분석하는 방법을 설명합니다.

초파리 배아에서 지질 함유 소기관의 세포 골격 의존성 밀매 시각화

여기에서, 광수용체 막 단백질의 국소화 및 eGFP 형광을 이용한 초파리 화합물 안구에서의 망막 변성의 평가를 위한 비침습적 방법이 기재되어 있다.

eGFP 태그 단백질을 사용하여 초파리 광수용체 세포에서 막 단백질 밀매를 연구하기

Expansion-Assisted Iterescence In Situ Hybridization(EASI-FISH)은 확장 현미경 검사와 FISH(Fluorescence in situ hybridization)를 결합하여 두꺼운 조직에서 여러 유전자의 발현을 검출하는 강력한 기술입니다. 이 프로토콜은 이 방법의 최근 발전과 온전한 초파리 중추 신경계를 라벨링하기 위한 적응을 간략하게 설명합니다.

Expansion-Assisted Iterescence In Situ Hybridization을 사용한 온전한 초파리 뇌의 유전자 발현의 다중 검출

학습하세요 Drosophila에서 MCFO 기술을 활용한 단일 세포 형태학 시각화 방법을. Gal4/UAS 시스템과 다색 레포터를 사용하여 복잡한 조직 내 세포 상호작용을 연구하고 발달생물학 연구에 적용할 수 있습니다.

높은 해상도 단일 셀 형태학 초파리 에서 명과의 세포 상호 작용을 공부 하 고 다 색 FlpOut 기술의 응용

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