높은 해상도 단일 셀 형태학 초파리 에서 명과의 세포 상호 작용을 공부 하 고 다 색 FlpOut 기술의 응용

셀 다른 형태학을 표시 하 고 그들의 이웃과 상호 작용의 다양 한 설정. 이 프로토콜에는 단일 세포의 형태를 공개 하 고 확고 Gal4/UAS 식 시스템을 사용 하 여 세포 세포 상호 작용을 조사 하는 방법을 설명 합니다.

이 기술의 전반적인 목표는 복잡한 해부학적 조직에서 단일 세포 형태를 시각화하여 초파리의 세포 세포 상호 작용 연구를 단순화하는 것입니다. 이 방법은 초파리를 이용한 복잡한 형태학 및 세포 세포 상호 작용에 관한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 모든 조직과 모든 발달 단계에서 단일 세포 형태 연구에 적용할 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 사람은 우리 실험실의 기술자인 Anja Kieser가 맡을 것입니다. MCFO 기술은 표준 FlpOut 기술을 다음과 같이 수정합니다. 열 충격 FLP 재조합 효소 및 다른 보고자는 UAS의 통제 하에 남아 있지만, 각 보고자는 에피토프 태그의 사본이 삽입된 미리스토일화된 상위폴더 GFP의 공통 백본을 가지고 있습니다.

그 결과로 생성된 비형광 단백질은 스파게티 몬스터 GFP라고 명명되며 항체로 확인됩니다. 절제의 수에 따라 다른 조합의 에피토프가 발현됩니다. HSP 프로모터는 섭씨 25도에서 약간 활성화되기 때문에 실제로 비활성 상태인 섭씨 18도에서 크로스를 설정합니다.

그런 다음 F20 세대를 얻으려면 약 1일 동안 기다립니다. F1 암컷과 수컷을 별도의 바이알로 분류합니다. 열 충격을 주려면 먼저 생후 3-4일이 되었을 때 신선한 식품 바이알에 옮기십시오.

어린 파리는 너무 섬세해서 열 쇼크를 일으킬 수 없습니다. 다음으로, 바이알을 섭씨 37도의 수조에 옮깁니다. 균일한 열 충격을 보장하기 위해 깊이 담그십시오.

신경교세포의 희박한 표지의 경우, 5분에서 8분 동안 열 충격으로 시작한 다음 최적화합니다. 최적의 열 충격 시간은 대상 셀에 드물게 레이블을 지정하며 그 관계는 사용 중인 특정 GAL4 드라이버에 따라 다릅니다. 열 쇼크 후 바이알을 벤치에 몇 분 동안 수평으로 놓고 식히십시오.

이제 같은 바이알에서 파리를 섭씨 25도로 유지하기 시작합니다. 이틀 후에는 기자 표정이 최적화되고 파리를 해부할 수 있습니다. 준비로 얼음 위에 세 개의 깊은 함몰 우물을 놓습니다.

하나는 70% 에탄올, 하나는 PBS로, 다른 하나는 S2 세포 배양 배지로 채웁니다. 그런 다음 검은색 실리콘을 깐 3cm 해부 접시에 차가운 S2를 넣습니다. 조직을 건강하게 유지하기 위해 S2에서 전체 해부를 수행합니다. 이제 이산화탄소로 파리를 마취하십시오.

그런 다음 집게나 깃털을 사용하여 파리를 차가운 70% 에탄올에 약 30초 동안 넣은 다음 차가운 PBS에 약 30초 동안 넣은 다음 차가운 S2로 옮깁니다. 따라서 해부 할 모든 파리를 씻으십시오. 일반적으로 하나의 유전자형을 가진 최대 10마리의 파리로 충분합니다. 이제 30분 이내에 모든 뇌를 해부하십시오.

먼저 몸의 나머지 부분에서 머리를 분리하고 몸을 버립니다. 해부 내내 다른 손으로 머리를 잡고 있지 않으면 다시 잡기가 매우 어려울 것입니다. 그런 다음 망막 바로 아래 조직만 잡고 한쪽 눈을 뽑습니다.

그런 다음 다른 쪽 눈을 뽑아 뇌와 주변 조직을 드러냅니다. 다음으로, 뇌 조직이 깨끗해 보일 때까지 뇌 주변의 모든 기관 조직과 남아 있는 큐티클을 제거합니다. 최적의 염색 결과를 얻으려면 모든 기관 조직을 제거해야 합니다.

이것이 뇌가 고정을 위해 준비하는 데 필요한 전부입니다. 해부된 뇌를 차가운 S2에 유지하면서 모든 뇌를 해부하는 것을 진행한다. 최적의 염색을 위해 마이크로 원심분리기 튜브당 최대 10개의 뇌를 준비하십시오. P10 피펫 팁을 사용하여 분리된 뇌를 고착 용액이 있는 200마이크로리터 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

절대로 집게를 사용하여 뇌를 다루지 마십시오. 빛으로부터 보호되는 조직을 배양하십시오. 용액 전달 중에 뇌를 흡인하지 마십시오.

정착액을 제거하려면 세척액으로 15분 이상 세척하십시오. 그런 다음 차단 용액으로 조직을 30분 이상 차단합니다. 다음으로, 차단 용액을 세척 용액에 희석된 1차 항체로 교체하고 섭씨 4도에서 밤새 뇌를 배양합니다.

1차 항체를 제거하려면 세척액으로 1시간 동안 3회 세척하십시오. 다음으로, 세척 용액에 2차 형광단 접합 항체를 추가하고 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 또는 실온에서 4시간 동안 뇌를 배양합니다. 결합되지 않은 항체를 완전히 씻어내려면 세척 용액으로 1시간 동안 3회 세척한 다음 PBS로 더 오래 세척하십시오.

그런 다음 뇌를 장착하십시오. 상상의 스페이서로 2개의 커버 슬립을 준비합니다. 스페이서와 추가 커버 슬립에 페이드 방지제가 포함된 10마이크로리터의 장착 매체를 적용합니다.

다음으로, P10 피펫을 사용하여 뇌를 커버 슬립으로 옮기고 PBS와 함께 배지 옆에 놓습니다. 조직이 마르지 않도록 하십시오. 이제 피펫을 사용하여 뇌를 장착 매체로 조심스럽게 이동하고 마지막으로 스페이서의 매체로 이동하고 집게로 배열합니다.

그런 다음 스페이서의 접착 라이너를 제거하고 커버 슬립을 부착합니다. 집게를 사용하여 약간의 압력으로 커버 슬립을 고정하고 즉시 이미징을 진행하거나 나중에 분석할 수 있도록 슬라이드를 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 설명된 방법을 사용하여 세 가지 다른 멤브레인 태그가 지정된 리포터는 FRT 부위 옆에 있는 전사 종결자에 의해 침묵을 유지합니다.

동물에게 열충격을 가했을 때 FLP 재조합효소를 발현하고 터미네이터를 무작위로 제거하여 다양한 리포터 조합의 발현을 유도했습니다. 전반적으로 다양한 리포터 조합은 7가지 색상을 제공하므로 여러 단일 세포 형태를 개별적으로 시각화하고 연구할 수 있습니다. EG-GAL4 및 ALG-GAL4로 다양한 열 충격 시간을 테스트했습니다.

단세포 표지는 뇌의 더듬이 엽 영역에서 분석되었습니다. EG-GAL4 드라이버는 모두 더듬이 엽의 표면에 포위된 신경교세포를 포획하는 것으로 발현되었습니다. 이에 비해 ALG-GAL4가 표적으로 하는 성상세포와 같은 신경교세포는 대부분 더듬이엽의 겹치지 않는 영역을 덮었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 용액에서 단일 세포를 라벨링하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이들의 복잡하고 해부학적 관계를 이해하기 위해 초파리를 사용하여 원칙적으로 그리고 이진 시스템 GAL4 UIS를 적용할 수 있는 모델 유기체에서 이해할 수 있습니다. 이 절차를 처음 시도하는 경우 먼저 열 충격 시간을 최적화하고 최상의 결과를 얻기 위해 염색 프로토콜의 단일 단계를 최대한 따르는 것이 중요합니다.