한천 장착(Agar Mounting): 장기 이미징을 위해 살아있는 제브라피시 배아를 장착하는 기본 방법

- E3 매체를 낮은 융점 아가로 스에 첨가하고 아가 로즈가 완전히 용해 될 때까지 가열합니다. 아가로스를 섭씨 37도로 식히고 트리카인 용액을 넣는다. 다음으로, E3 배지의 배아가 들어 있는 페트리 접시에 트리카인을 첨가하여 배아를 마취합니다. 페트리 접시를 소용돌이쳐 중간에 있는 배아를 모읍니다.

전달 피펫을 사용하여 최소한의 배지로 하나의 배아를 추출합니다. 피펫을 똑바로 세우고 배아를 튕겨 피펫 끝에 놓습니다. 이제 과도한 배지를 추가하지 않고 배아를 아가로스 용액에 넣으면 아가로스를 희석하고 겔화를 방지할 수 있습니다. 아가로스 내에서 배아를 부드럽게 혼합하고 피펫을 사용하여 용액을 이미징 플레이트의 웰로 옮깁니다.

플레이트를 현미경 아래에 놓고 피펫 팁을 사용하여 배아를 원하는 방향으로 배치합니다. 아가로스가 응고되면 그 위에 트리카인이 함유된 E3 배지를 부어 한천을 수화하고 배아를 이미지화합니다. 예시 프로토콜에서는 이미징 및 분석을 위해 파라바이오틱 제브라피시 배아를 장착할 것입니다.

융합된 배아의 이미지를 획득하려면 0.8% 저융점 아가로스를 준비합니다. 여전히 뜨거울 때 아가로스 1ml를 섭씨 37도의 가열 블록에 설정된 1.5ml 마이크로퓨지 튜브에 분취합니다. 배아를 포함하는 25ml의 E3 배지에 pH 7.0 트리카인 1ml당 4mg을 첨가하여 기생충 배아를 마취합니다. 배아가 가운데에 고이도록 접시를 부드럽게 휘젓습니다.

그런 다음 끝이 넓은 플라스틱 이송 피펫을 사용하여 가능한 한 적은 액체로 배아를 끌어냅니다. 다음으로, 피펫을 똑바로 세우고 배아를 부드럽게 튕겨 피펫의 맨 아래에 안착시킵니다. 그런 다음 아가로스 표면의 피펫 팁을 가볍게 터치하여 배아를 저융점 아가로스의 1ml 분취액으로 옮깁니다. 피펫에서 여분의 액체를 버리고 피펫을 사용하여 아가로스의 배아를 부드럽게 혼합합니다.

그런 다음 피펫을 사용하여 아가로스와 배아를 유리 바닥 6웰 플레이트의 웰로 옮깁니다. 실체 현미경 하에서 티징 바늘 끝에 고정된 겔 로딩 팁을 사용하여 배아를 커버 유리에 가깝게 그리고 이미징을 위해 원하는 방향으로 배치합니다. 아가로스가 설정되고 트리카인이 포함된 배지를 웰에 추가한 후 반전된 광시야 에피형광 레이저 스캐닝 컨포칼 또는 회전 디스크 컨포칼 현미경을 사용하여 이미지를 획득합니다.

전체 배아 시야의 경우 4x 주관식을 사용합니다. 20x 대물렌즈를 사용하여 특정 조직을 이미지화합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 이미지를 처리합니다.