El aislamiento y enriquecimiento de hígado progenitoras subconjuntos identificados por una combinación de marcadores de superficie Novel

Los objetivos generales de este protocolo de digestión hepática son evaluar los diversos subconjuntos de progenitores hepáticos mediante citometría de flujo y aislar estas células a una alta pureza utilizando un nuevo cóctel de marcadores de superficie para su posterior análisis. Este método puede ayudar a responder varias preguntas sobre la biología de las células progenitoras del hígado, por ejemplo, cuáles son las características específicas de su subconjunto y cuáles son sus causas lejanas durante la lesión hepática. La principal ventaja de esta técnica es que permite el aislamiento de células progenitoras para obtener una alta pureza y viabilidad, lo cual es importante para el análisis in vitro.

Aunque esta técnica de digestión proporciona información sobre la biología de las células progenitoras, en realidad se puede utilizar para el aislamiento de poblaciones de células hematopoyéticas y endoteliales. Para preparar una preparación de una sola célula a partir de un hígado de ratón, transfiera los lóbulos a una placa de Petri seca y use un bisturí para cortar los tejidos en cubos homogéneos de aproximadamente dos milímetros cúbicos. Transfiera las piezas a dos tubos de centrífuga cónicos de 15 mililitros por hígado que contienen 2,5 mililitros de tampón de digestión cada uno.

Y coloque las muestras en un baño de agua a 37 grados centígrados con agitación suave a los cinco y 10 minutos. Después de 15 minutos de digestión, utilice una pipeta de 1.000 microlitros con una punta cortada para valorar suavemente los trozos de hígado. Luego regrese los tubos al baño y deje que las piezas se asienten durante dos minutos.

A continuación, filtre dos alícuotas de aproximadamente 700 microlitros del sobrenadante a través de un colador de 100 micras prehumedecido con 800 microlitros de tampón de recolección. Y reemplace el sobrenadante eliminado con un tampón de digestión fresco. Cuando el tejido hepático ya no sea visible, pase todo el sobrenadante de los tubos de digestión a través del filtro.

Y recoger todas las células por centrifugación. Vuelva a suspender los pellets en un mililitro de tampón de lisis de cloruro de amonio y potasio a temperatura ambiente, deteniendo la lisis con cinco mililitros de tampón de recolección fresco después de un minuto. Recoja las células con otra centrifugación.

Luego, aspire con cuidado el sobrenadante sin alterar la bolita suelta. Y resuspender las células en cuatro mililitros de tampón de recolección fresca en hielo. Para determinar el número de células de la muestra de hígado por citometría de flujo, primero mezcle 20 microlitros de la suspensión de células hepáticas con 174 microlitros de PBS en un tubo de poliestireno de 1,5 mililitros y seis microlitros de yodo propidio.

Agregue perlas de conteo que permitan la cuantificación de celdas y cargue la mezcla de perlas y celdas en el citómetro de flujo. Puerta en la dispersión lateral por parámetros de dispersión frontal para evitar escombros. Excluyendo los dobletes a través de una altura de dispersión directa frente a una puerta de área de dispersión directa y las células muertas positivas de yodo propidio.

Luego, cargue una muestra de 30 microlitros en el citómetro de flujo y registre los eventos. Para teñir las células hepáticas para el análisis por citometría de flujo de los subconjuntos progenitores, transfiera 2x10^5 alícuotas de las células a tubos de reacción de 1,5 mililitros. Y pellet las células por centrifugación.

Vuelva a suspender los gránulos en el bloque Fc para una incubación de cinco minutos en hielo. A continuación, añada 50 microlitros del cóctel de anticuerpos que teñe la superficie celular de interés a los tubos adecuados para una incubación de 20 minutos en hielo protegido de la luz. Al final de la incubación, lavar las muestras con 400 microlitros de tampón de tinción por muestra.

Y resuspender los pellets en 100 microlitros del cóctel de anticuerpos secundarios adecuado durante 20 minutos sobre hielo protegido de la luz. A continuación, lavar las células con otros 400 microlitros de tampón de tinción. Y vuelva a suspender los gránulos en 300 microlitros de tampón de tinción que contenga yoduro de propidio.

Mida la muestra con un citómetro de flujo. Para enriquecer la población de células progenitoras mediante la separación basada en microperlas magnéticas, transfiera 1.5-2x10^6 células al número apropiado de tubos cónicos de 15 mililitros y recoja las células por centrifugación. Vuelva a suspender los pellets en 400 microlitros de HBSS suplementado con BSA.

Y agregue 40 microlitros de microperlas anti-CD31 y 30 microlitros de microperlas anti-CD45 para una incubación de 15 minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, lave las células en cinco mililitros de HBSS más BSA. Y vuelva a suspender los gránulos en 100 microlitros de perlas de eliminación de células muertas para una incubación de 15 minutos a temperatura ambiente.

Mientras las células se incuban, equilibre una columna de selección positiva de tamaño adecuado por hígado con tres mililitros de HBSS más BSA. A continuación, añada 900 microlitros de HBSS más BSA a las células y filtre las células a través de una malla filtrante de poliamida de 100 micras. Cargue las células incubadas en perlas filtradas en las columnas que recogen el eluido en el tubo de centrífuga.

Cuando todas las células hayan fluido a través de la columna, lave las columnas tres veces con tres mililitros de HBSS más BSA. Granular las células por centrifugación y resuspender el pellet celular en 100 microlitros de tampón de enjuague y bloque Fc. Extraiga los gránulos de celdas de cuatro a seis hígados o hasta menos de 1x10^6 celdas seleccionadas negativamente.

Después de cinco minutos, etiquete las células con el anticuerpo biotinilado anti-GP38 durante 10 minutos en hielo. Al final de la incubación, recoja las células por centrifugación para su resuspensión en 400 microlitros de tampón de enjuague y cinco microlitros de microesferas antibiotina. Después de 15 minutos a cuatro grados centígrados, lavar inmediatamente las células con cinco mililitros de tampón de enjuague.

Y vuelva a suspender el pellet en un mililitro de tampón de enjuague fresco. Coloque las celdas resuspendidas en un rack refrigerado de 15 y comience la separación magnética automática. A continuación, centrifugar el flujo y volver a suspender los gránulos en la solución adecuada para el análisis experimental posterior previsto.

La activación de las células que son negativas para CD45, CD31 y asialoglycoprotein, un receptor selecciona las células progenitoras del hígado, que luego se pueden agrupar de acuerdo con su expresión de glicoproteína 38 y CD133. Las células CD133 positivas para gp38 y las células positivas para CD133 negativas para gp38 representan las poblaciones celulares más abundantes entre las células CD45 negativas, CD31 negativas y ASGPR1 negativas en el hígado de ratón adulto sano, con diferencias aparentes en su expresión de varios marcadores de superficie previamente asociados con las células progenitoras. El aislamiento de estas células progenitoras basado en microesferas magnéticas, como se acaba de demostrar, da como resultado una pureza de más del 90% de las células hepáticas con un alto grado de viabilidad.

Al intentar aislar estas células poco comunes, es importante tener en cuenta las enzimas utilizadas durante los pasos de la digestión hepática, ya que diferentes enzimas pueden producir preferentemente subpoblaciones progenitoras específicas y reducir en gran medida los niveles de expresión de CD133. Es importante recordar que la pureza y el rendimiento de las células dependen de la preparación suave de las suspensiones unicelulares del hígado. Y que la gran cantidad de desechos celulares y la contaminación de las células moribundas pueden afectar negativamente el éxito de este protocolo.