Name: Identificación y aislamiento de Oligopotent y linaje comprometido progenitores mieloides de la médula ósea de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Aprenda a identificar y aislar seis subconjuntos de progenitores mieloides de médula ósea de ratón mediante MACS y FACS. Este protocolo permite análisis de ARN, proteínas y cultivos in vitro.

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Este protocolo fue desarrollado con fondos de la Junta de Gobernadores regenerativa medicina Instituto de Cedars-Sinai Medical Center (HSG), carreras en beca de Inmunología de la Asociación Americana de inmunólogos (AY y HSG) y Scholar Award de la sociedad americana de Hematología (para sí). Agradecemos al núcleo de citometría de flujo en el Cedars-Sinai Medical Center para obtener ayuda con la clasificación de FACS.

Todos los métodos aquí descritos fueron aprobados por el institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC) de Cedars-Sinai Medical Center.
1. aislamiento de médula ósea de ratón y la preparación de una suspensión unicelular
<ol><li>Eutanasia el ratón según las directrices.</li>
	<li>Coloque el ratón sacrificaron a sus espaldas y rociar con 70% de etanol (EtOH). Hacer una incisión pequeña (3-5 mm) en cada miembro trasero en el tobillo nivel usando afiladas, tijeras puntiagudas y tire la piel hacia arriba hacia el cuerpo para eliminar de las piernas y exponer los músculos y los huesos.</li>
	<li>Quitar los músculos (cuádriceps, isquiotibiales, etc.) de los huesos por recortar con tijeras, siguiendo la dirección del hueso. Tenga cuidado de no dañar los huesos.</li>
	<li>Dislocar el fémur de la cadera y corte el tejido conectivo y músculo para soltar las piernas, teniendo cuidado de no cortar los huesos.</li>
	<li>Retire los pies por dislocar los tobillos de la tibia, colocar los huesos en un tubo estéril PBS o los medios de comunicación y transporte en hielo a la sala de cultivo de tejidos. Nota: Para algunas aplicaciones (por ejemplo, derivadas de los macrófagos de médula ósea total) es posible dejar los huesos en el hielo durante un tiempo, pero para el aislamiento del progenitor es importante proceder lo más rápidamente posible para evitar downregulation de marcadores de superficie importantes (especialmente CD115).</li>
	<li>En un gabinete de bioseguridad, quitar cualquier tejido blando restante de los huesos por frotamiento con papel de seda. Nota: El protocolo debe realizarse en un gabinete de bioseguridad si una muestra estéril se requiere de estudios de cultura o en vivo de células después de su clasificación de FACS. Si no tienen células estériles, todo el proceso se puede realizar en el Banco de laboratorio.</li>
	<li>Sumerja brevemente los huesos en el 70% EtOH para la desinfección de ellos y luego en PBS estéril para lavarlos.</li>
	<li>Separar el fémur de las tibias y peronés cortando a través de la rodilla y deseche los peronés.</li>
	<li>Corte los extremos de los huesos con unas tijeras afiladas.</li>
	<li>Cosecha de la médula con PBS estéril fría como sigue hasta que los huesos aparecen blancos:<ol>
<li>Agarre cada hueso con pinzas y coloque una aguja de 26G conectada a una jeringa de 10 mL con PBS estéril fría en el eje del hueso en un extremo.</li>
		<li>Sostenga el hueso por encima de un tubo de centrífuga de 50 mL y lavar 2-5 mL de PBS a través del hueso para la cosecha de la médula.</li>
		<li>La médula de los 4 huesos por ratón (2 fémures y 2 tibias) de la cosecha.</li>
	</ol>
</li>
	<li>¡Pipeta suavemente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 1 mL a la desagregación de la médula ósea para formar una suspensión.</li>
	<li>Filtrar la suspensión de la médula ósea a través de un pedazo de malla de nylon de 30 μm para eliminar piezas de hueso y agregados, generando una suspensión unicelular de células.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión unicelular a 280 x g por 5 min y resuspender el precipitado de células en solución tampón de tinción estéril (PBS + 0,5% FBS + 2 mM EDTA), usando 5 mL de buffer por ratón (por ejemplo, 10 mL para las células de los fémures y tibias de 2 ratones) la coloración.</li>
	<li>Tomar 10 μL alícuota de la muestra, mezclar con 10 μL azul de tripán y carga 10 μL de la muestra marcada con azul de tripán resultante en un hemocitómetro. Contar las células utilizando un microscopio de luz. Nota: Si las células son demasiado concentradas para conteo confiable, diluir la muestra antes de la adición de azul de tripano.</li>
</ol>2. progenitor enriquecimiento por célula activada por el magnético clasificación (MACS)
<ol><li>Centrifugue la suspensión de toda la célula individual (o tantas células como están obligadas a obtener el rendimiento deseado) a 280 x g durante 5 min a 4° C y resuspender el pellet celular en 40 μL tampón (PBS + 0,5% FBS + 2 mM EDTA) por 107 células de tinción. Nota: También es posible utilizar tampón MACS del fabricante del kit del agotamiento del linaje (véase Tabla de materiales) como una alternativa para el tampón de tinción.</li>
	<li>Realizar el agotamiento de linaje según las instrucciones suministradas con el kit de agotamiento de linaje. Las instrucciones siguientes son para el juego visto en la Tabla de materiales. Si se utiliza un equipo diferente, siga las instrucciones del fabricante y luego continúe con el paso 2.3.<ol>
<li>Añadir 10 μL biotina anticuerpo cóctel por 107 células, mezclar mediante pipeteo e incubar 10 min a 4 ° C.</li>
		<li>Añadir 30 μL tampón/MACS la coloración buffer por 107 células y mezclar.</li>
		<li>Añadir 20 μL anti-biotina microesferas por 107 células. Mezclar bien e incubar un adicional 15 min a 4 ° C. Nota: Vórtice microbeads antes de agregar a las células para asegurarse de que están totalmente dispersas.</li>
		<li>Añadir 1 mL de tampón buffer/MACS por 107 células de tinción, centrifugar las células a 280 x g por 5 min y resuspender el pellet celular en 500 μL tampón/MACS tinción para células de8 hasta 10. Para más de 108 células, aumentar el volumen de tampón buffer/MACS de tinción por consiguiente.</li>
		<li>Preparar el separador magnético automatizado según las instrucciones del fabricante.</li>
		<li>Coloque el tubo que contiene las células etiquetadas en el separador y elegir el programa de selección negativa.</li>
		<li>Recoger la fracción negativa, que contiene las células progenitoras enriquecido linaje negativo (Lin–). Desechar la fracción positiva, que contiene las células de linaje-positivos marcados magnéticamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lin– las células de 280 x g durante 5 min, de centrifugar y resuspender el precipitado de células en 2 mL de tampón buffer/MACS por ratón (por ejemplo, 4 mL si la médula se agruparon de 2 ratones) la coloración. Nota: El pellet debe ahora ser blanco en vez de rojo porque los eritrocitos se han agotado.</li>
	<li>Tomar 10 μL alícuota de las células de Lin– , mezclar con 10 μL azul de tripán y carga 10 μL de la muestra marcada con azul de tripán resultante en un hemocitómetro. Contar las células utilizando un microscopio de luz. Nota: Si las células son demasiado concentradas para conteo confiable, diluir la muestra antes de la adición de azul de tripano.</li>
</ol>3. mieloides progenitoras identificación y aislamiento de células activado por fluorescencia (FACS) de clasificación
<ol><li>Etiqueta 9 tubos de microcentrífuga (1.5 ó 2 mL) para: 1) sin mancha las células, 2-8) solo de células teñidas con anticuerpos conjugados fluoróforo contra FcγR (CD16/32), c-Kit, Sca-1, CD34, Flt3 (CD135), Ly6C y CD115 para compensación de color y selección de la tensión y 9) células de la muestra a teñir con 7 anticuerpos todo progenitor identificación y clasificación.</li>
	<li>Distribuir 100.000 células a cada uno de los tubos de control (tubos 1-8) y todas las células restantes (o menos si se desea) al muestra tubo (9). Nota: Si el volumen de muestra es mayor de 1.5-2 mL, puede ser necesario distribuir las células de la muestra en un tubo de 15 mL, centrifugarlos Resuspender el precipitado (paso 3.3 a continuación) y luego se transfieren las células a un tubo de microcentrífuga para los posteriores pasos de tinción.</li>
	<li>Centrifugar las células a 1.500 x g durante 5 min y volver a suspender los pellets de tubo control en 100 μL tampón (PBS + 0,5% FBS + 2 mM EDTA) y el sedimento del tubo de muestra en 100 μL de tinción tinción buffer por 5 x 106 células (por ejemplo, 200 μL de células 1 x 107 ).</li>
	<li>Añadir 2 μg/mL anti-CD16/CD32-APC-Cy7 FcγR mancha solo tubo y el tubo de muestra. Vórtice suavemente para mezclar e incubar 10 min a 4 ° C. Nota: Es importante teñir las células de la muestra con el anticuerpo FcγR (CD16/32) antes de añadir los otros anticuerpos para evitar la competencia debido a la Unión de anticuerpos Fc-mediada no específicos. No incubar las células con un FcγR bloqueo reactivo.</li>
	<li>Añadir los otros anticuerpos a los tubos correspondientes de tinción simple (1 anticuerpo) y el tubo de muestra (todos 6 anticuerpos): 10 μg/mL c-Kit-Pacífico azul, Sca-1-PE-Cy7 de 2 μg/mL, 25 μg/mL CD34-FITC, 10 μg/mL Flt3-APC, 2 μg/mL Ly6C-PerCP-Cy5.5 y 4 μg/mL CD115-PE. Vortex e incubar por 15 min a 4 ° C.</li>
	<li>Añadir 900 tampón de tinción μL a los tubos de control y 1 mL de tampón de tinción por 107 células en el tubo de muestra. Centrifugar las células a 1.500 x g durante 5 minutos y resuspender el pellet celular en tampón de tinción: 200 μL por tubo de control y 500 μL por 25 x 106 células en el tubo de muestra. Transferir las células resuspendidas a tubos de 5 mL FACS. Nota: Si el volumen de muestra es mayor de 1.5-2 mL, puede ser necesario transferir las células a un tubo de 15 mL para centrifugación.</li>
	<li>Preparar el citómetro de flujo (analizador o clasificador) según las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Ejecute sin manchas y solo manchado las células del control por el citómetro de flujo para establecer las tensiones y compensaciones de color.</li>
	<li>Funcionamiento de las células de la muestra, los subconjuntos del progenitor como se describe a continuación y resumidas en la figura 2de la puerta y si lo desea, realizar FACS clasificación para aislar los subconjuntos relevantes del progenitor. Nota: Es típicamente necesario adquirir aproximadamente 200.000 células para obtener al menos 1.000 eventos en cada puerta del progenitor.<ol>
<li>Crear un diagrama de punto de todas las células, mostrando la FSC-A (eje x) y el SSC-A (eje y) y para excluir los desechos y células muertas de la puerta = > "viven" las células.</li>
		<li>Crear un diagrama de punto de células "vivas", mostrando FSC-H (eje x) y FSC-W (eje y) y la puerta para excluir dobletes = > puerta de vivir/camiseta (FSC).</li>
		<li>Crear un diagrama de punto de vivir/camiseta (FSC) células, mostrando SSC-H (eje x) y SSC-W (eje y) y la puerta para excluir dobletes = > vivir/camiseta (FSC) / puerta de camiseta (SSC).</li>
		<li>Crear un diagrama de punto de vivir/camiseta (FSC) / células de camiseta (SSC), visualización de Sca-1 (eje x) y c-Kit (eje y) y la puerta para seleccionar c-Kit+ Sca-1– células = > células LKS– .</li>
		<li>Crear un diagrama de punto de células LKS– , mostrando CD34 (eje x) y FcγR (eje y) y puerta para seleccionar CD34+ FcγRlo células = > "CMP" y CD34+ FcγRHola células = > "Correctas". Nota: Es importante el "CMP" y "GMPs" como precisamente la puerta como sea posible. Es útil utilizar un diagrama de densidad de pseudocolor o una trama de contorno para la sincronización exacta.</li>
		<li>Crear un diagrama de punto de "CMP", mostrando CD115 (eje x) y Flt3 (eje y) y la puerta para seleccionar: Flt3+ CD115lo células = > + CMP-Flt3 CD115lo las células, Flt3– CD115lo células = > CMP -– de Flt3 de células, Flt3+ CD115Hola células = > MDPs.
</li>
		<li>Crear un diagrama de punto de "Correctas", mostrando Ly6C (eje x) y FcγR (eje y) y puerta para seleccionar Ly6C células–= > "GMP-Ly6C– células" y Ly6C+ células = > "GMP-Ly6C+ células".</li>
		<li>Crear un diagrama de punto de "Células de GMP-Ly6C– ", mostrando CD115 (eje x) y Flt3 (eje y) y la puerta para seleccionar: Flt3– CD115lo células = > GMPs.
</li>
		<li>Crear un diagrama de punto de "Células de GMP-Ly6C+ ", mostrando CD115 (eje x) y Flt3 (eje y) y la puerta para seleccionar: Flt3– CD115lo células = > GPs, Flt3– CD115Hola células = > MPs + cMoPs.
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).</li>
<li>Yáñez, A., Ng, M. Y., Hassanzadeh-Kiabi, N., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRF8+acts+in+lineage-committed+rather+than+oligopotent+progenitors+to+control+neutrophil+vs+monocyte+production%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">IRF8 acts in lineage-committed rather than oligopotent progenitors to control neutrophil vs monocyte production.</a> Blood. 125 (9), 1452-1459 (2015).</li>
<li>Auffray, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CX3CR1%2B+CD115%2B+CD135%2B+common+macrophage%2FDC+precursors+and+the+role+of+CX3CR1+in+their+response+to+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">CX3CR1+ CD115+ CD135+ common macrophage/DC precursors and the role of CX3CR1 in their response to inflammation.</a> Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 595-606 (2009).</li>
<li>Fogg, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonogenic+bone+marrow+progenitor+specific+for+macrophages+and+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells.</a> Science. 311 (5757), 83-87 (2006).</li>
<li>Onai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clonogenic+common+Flt3%2BM-CSFR%2B+plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cell+progenitors+in+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow.</a> Nature Immunology. 8 (11), 1207-1216 (2007).</li>
<li>Hettinger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+monocytes+and+macrophages+in+a+committed+progenitor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor.</a> Nature Immunology. 14 (8), 821-830 (2013).</li>
<li>Yáñez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte-monocyte+progenitors+and+monocyte-dendritic+cell+progenitors+independently+produce+functionally+distinct+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Granulocyte-monocyte progenitors and monocyte-dendritic cell progenitors independently produce functionally distinct monocytes.</a> Immunity. 47 (5), 890-902 (2017).</li>
<li>Olsson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+mixed-lineage+states+leading+to+a+binary+cell+fate+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of mixed-lineage states leading to a binary cell fate choice.</a> Nature. 537 (7622), 698-702 (2016).</li>
<li>Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+hind+limb+long+bone+dissection+and+bone+marrow+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).</li>
<li>Yáñez, A., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+regulatory+factor+8+and+the+regulation+of+neutrophil%2C+monocyte%2C+and+dendritic+cell+production%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Hematology%22%5BJournal%5D)">Interferon regulatory factor 8 and the regulation of neutrophil, monocyte, and dendritic cell production.</a> Current Opinion in Hematology. 23 (1), 11-17 (2016).</li>
<li>Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+isolation+of+human+clonogenic+common+myeloid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Weissman gating estrategia para ratón progenitor mieloide identificación1 ha sido el estándar de oro para los inmunólogos y hematólogos durante casi 20 años, pero ahora es evidente que las puertas "CMP" y "GMP" son muy heterogéneas y más precisa se necesitan estrategias bloquea. El protocolo que hemos descrito aquí permite la identificación de oligopotent y subconjuntos linaje comprometido en ratones C57BL/6J más precisa cuantificación de progenitores mieloides específicos y asignación de las vías...

Monocitos, neutrófilos y células dendríticas (DCs) son células mieloides que provienen de progenitores hematopoyéticos, principalmente en la médula ósea, por un proceso llamado mielopoyesis. Progenitores mieloides comunes (CMPs) tienen el potencial para producir células mieloides, así como megacariocitos y eritrocitos, pero las células no linfoides. Progenitores de granulocitos-monocitos (BPF), que se derivan de los CMPs, producen granulocitos y monocitos, pero han perdido megakaryocyte y el potencial del eritrocito. Monocitos y clásica y plasmacytoid DCs (CDC/PDC) también se piensan para presentarse de progenitores comunes conocidos como progenitores de monocito DC (MDPs), que son producidos por CMPs. Gradual restricción potencial del linaje que finalmente se traduce en linaje comprometido progenitores: progenitores de granulocitos, monocito progenitores y progenitoras de células dendríticas (figura 1).
Weissman y sus colegas informaron que los CMPs se encuentran en Lin– c-Kit+ Sca-1– CD34 (LKS–)+ FcγRlo fracción de médula ósea de ratón, mientras que las prácticas correctas de fabricación están contenidos en el CD34 LKS– + FcγR Hola fracción1. Sin embargo, estas fracciones "CMP" y "GMP" son muy heterogéneas. Por ejemplo, la fracción de "GMP" también contiene progenitores comprometidos linaje granulocito monocito progenitores y1,2. MDPs se informaron por separado que CX3CR1+ Flt3+ CD115+ progenitores que también expresan CD34 y FcγR3,4. MDPs dan lugar a cDC/pDC-producción común DC progenitores (CDP), que se han divulgado para expresar niveles más bajos de c-Kit (CD117) y no están incluidos en la fracción LKS– 5.
Previamente, fue asumido que los monocitos surgen a través de una sola vía (CMP-GMP-MDP-monocito). Consistente con este modelo, cometidos por el monocito progenitores producida por prácticas correctas de fabricación (nombre de progenitores de monocitos, MPs)2 y MDPs (nombradas de progenitores comunes de monocitos, cMoPs)6 parecen ser las células del mismo en base a la expresión del marcador de superficie compartido . Sin embargo, nosotros recientemente demostró que los monocitos son producidos independientemente por GMPs y MDPs y fueron capaces de distinguir entre el MPs y el cMoPs unicelular RNA la secuencia7.
Recientemente modificamos la estrategia bloquea "GMP" y Weissman "CMP" para identificar 6 subfracciones de médula de ratón C57BL/6J que contiene diferentes oligopotent y subconjuntos de progenitor mieloide linaje comprometido. Primero nos informan que la coloración de Ly6C y CD115 permite el aislamiento de oligopotent correctas, como progenitores de granulocitos (GPs) y progenitores de monocitos (MPs y cMoPs, que actualmente no podemos separar) del "GMP" fracción2 (LKS - CD34+ FcγRHola puerta; Figura 1). Posteriormente demostró que MDPs se encuentran predominantemente en la fracción "CMP" (CD34 LKS– + lo puerta de FcγR), que también contiene Flt3+ CD115lo y Flt3– subconjuntos7 (figura 1 ). El CMP-Flt3+ CD115lo fracción rinde GMPs y MDPs sobre transferencia adoptiva. El CMP-– de Flt3 subconjunto contiene progenitores que parecen intermedios entre CD115 CMP-Flt3+ lo y las células correctas. A diferencia de MDPs, CD115 CMP-Flt3+ lo tanto fracciones de CMP-Flt3– también poseen megakaryocyte y el potencial del eritrocito.
Es importante señalar, sin embargo, que no está actualmente claro si las fracciones "CMP" contienen progenitores que son realmente oligopotent (por ejemplo, las células individuales en el CMP-Flt3+ CD115lo fracción que poseen del neutrófilo, monocito DC, megacariocitos y eritrocito potencial), o alternativamente, comprenden una mezcla de progenitores con potencial más restringido de linaje. Formadoras de ensayos (culturas de metilcelulosa) revelaron las células con granulocitos (neutrófilos), eritrocitos, monocitos y potencial de megacariocitos (células GEMM) en la "AMC", CMP-+ CD115lo de Flt3 y fracciones de CMP-Flt3– 1 ,7, pero no permiten la evaluación del potencial de DC. En cambio, formadoras de ensayos demostraron la existencia de oligopotent correctas (progenitores con recuento de neutrófilos y monocitos potencial) en el "GMP" fracción1,2, y esto es apoyado por recientes unicelular de análisis transcriptómico8. No se actualmente sabe, sin embargo, si estos oligopotent BPF también produce otros granulocitos (eosinófilos, basófilos y mastocitos).
Basado en estos estudios, ahora demostramos cómo 7 superficie marcadores (c-Kit, Sca-1, CD34, FcγR, Flt3, Ly6C y CD115) puede utilizarse para identificar y aislar estos 6 subconjuntos de oligopotent y de progenitores mieloides linaje comprometido. El protocolo descrito aquí puede ser aplicado para en vitro ensayos de cultura (culturas de la pastilla o líquido), en vivo experimentos transferencia adoptiva en ratones y el análisis molecular (secuencia de RNA a granel y unicelular, Western blotting, etc.).
El protocolo consta de 3 etapas: 1) preparación de una suspensión unicelular de la médula ósea las células, 2) enriquecimiento de progenitores hematopoyéticos (clasificación celular activada por el magnético) y 3) la identificación y aislamiento si lo desea, de subconjuntos del progenitor por flujo Citometría (mediante un analizador o un clasificador, según sea el caso). El primer paso es el aislamiento de las células de la médula ósea de los fémures y tibias de ratones eutanasia y es similar a otros protocolos previamente descritos9. A continuación, la muestra es enriquecida de células madre y progenitoras utilizando un cóctel de anticuerpos contra los marcadores de superficie celular de los eritrocitos, neutrófilos, monocitos, linfocitos, etc., para agotar las células diferenciadas. Esto no es obligatorio, pero se recomienda fuertemente para optimizar la detección de los subconjuntos de la progenitora y a reducir la cantidad de anticuerpos necesarios para la identificación del progenitor y el tiempo necesario para citometría de flujo. El protocolo de agotamiento del linaje más abajo describe Magnetic-Activated celular clasificación (MACS) usando un ratón linaje celular agotamiento Kit (que contiene anticuerpos biotinilados contra CD5, CD45R (B220), CD11b, Gr-1 (Ly6G/C), 7-4 y Ter-119, más anti-biotina microesferas) y un separador magnético automatizado. El paso final es la identificación (y ordenar, si lo desea) de los subconjuntos de progenitoras por citometria de flujo. El panel de anticuerpos se describe a continuación (ver también tabla 1) ha sido diseñado para ser utilizado en un citómetro de flujo (analizador o clasificador) con 4 rayos láser (405 nanómetro, 488 nanómetro, 561 nm, 640 nm).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58061/58061fig1.jpg"> Figura 1: vías de diferenciación y progenitores de neutrófilos, monocitos y DC. El modelo recientemente revisado de mielopoyesis7 se ilustra, con las puertas de Weissman "CMP" (azul) y "Correctas" (verde)1 overlaid. Esta figura ha sido modificada desde Yáñez et al. 20177. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58061/58061fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Ratón: Tipo salvaje C57BL/6J (CD45.2)</td><td>The Jackson Laboratories</td><td>Cat#JAX:000664</td><td></td></tr><tr><td>Lineage Cell Depletion Kit, ratón</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Cat#130-090-858</td><td></td></tr><tr><td>Rata anti-ratón CD34 (clon RAM34) FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat#553733</td><td></td></tr><tr><td>Rata anti-ratón CD16/CD32 (Fc&gamma; R; clon 93) APC-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>Gato#101327</td><td></td></tr><tr><td>Rata anti-ratón Ly6A/E (Sca-1; clon 108113) PE-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>Gato#108114</td><td></td></tr><tr><td>Rata anti-ratón CD117 (c-Kit; clon 2B8) Azul Pacífico</td><td>BioLegend</td><td>Gato#105820</td><td></td></tr><tr><td>Rata anti-ratón Ly6C (clon HK1.4) PerCP-Cy5.5</td><td>BioLegend</td><td>Gato#128012</td><td></td></tr><tr><td>Rata anti-ratón CD115 (clon AFS98) PE</td><td>BioLegend</td><td>Gato#135506</td><td></td></tr><tr><td>Rata anti-ratón CD135 (Flt3; clon A2F10.1) APC</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat#560718</td><td></td></tr><tr><td>CountBright Cuentas de conteo absolutas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat#C36950</td><td></td></tr><tr><td>Separador AutoMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>N/A</td><td>Utilice el programa "deplete"</td></tr><tr><td>BD LSRFortessa</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>5 láseres, 15 colores</td></tr><tr><td>Clasificadora de células BD FACS Aria III</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>5 láseres, 13 colores</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo, LLC</td><td>https://www.flowjo.com</td><td>Para un análisis más detallado de los archivos .fcs</td></tr></tbody></table>

identificación y aislamiento de oligopotent y linaje comprometido progenitores mieloides de la médula ósea de ratón

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

Progenitores mieloides que neutrófilos, monocitos y células dendríticas (DCs) pueden ser identificados en y aisladas de la médula ósea de ratones para análisis hematológicos e inmunológicos. Por ejemplo, estudios de las propiedades celulares y moleculares de las poblaciones progenitoras mieloides pueden revelar mecanismos subyacentes a la transformación leucémica, o demostrar cómo el sistema inmune responde a la exposición del patógeno. Previamente estrategias de citometría de flujo se describe para la identificación del progenitor mieloide han permitido avances significativos en muchos campos, pero las fracciones que se identifican son muy heterogéneas. Las estrategias más frecuentemente usadas bloquea definen fracciones de médula ósea que están enriquecidos para la población deseada, pero también contienen grandes cantidades de progenitores de "contaminar". Nuestros estudios recientes han resuelto gran parte de esta heterogeneidad y el protocolo que presentamos permite el aislamiento de 6 subpoblaciones de oligopotent y progenitores mieloides linaje comprometido de 2 describen anteriormente fracciones de médula ósea. El protocolo describe 3 etapas: 1) aislamiento de médula células, 2) enriquecimiento de progenitores hematopoyéticos por célula activada por el magnético clasificación (agotamiento del linaje por Mac) y 3) la identificación de subconjuntos del progenitor mieloide mediante citometría de flujo (incluyendo fluorescencia activada célula clasificación, FACS, si lo desea). Este enfoque permite la cuantificación de la progenitora y el aislamiento para una variedad de aplicaciones in vitro e in vivo y ya ha dado nuevo penetración en las vías y mecanismos de neutrófilos, monocitos y la diferenciación de DC.

Utilizando el protocolo descrito anteriormente, es posible obtener células 100 millones (incluyendo células de sangre rojas, o 50 millones de células nucleadas) de fémur y tibia (2 patas) de un ratón C57BL/6J (6-8 semanas edad, hombres o mujeres). 1-2 millones Lin– células pueden ser aisladas por ratón por agotamiento de MACS de células Lin+ .
Cada uno de los subconjuntos de progenitor mieloide 6 constituye...

Demostramos cómo identificar y aislar 6 subconjuntos de progenitores mieloides de médula murine usando una combinación de magnético y fluorescencia clasificación (MACS y FACS). Este protocolo puede ser utilizado para RNA/proteína análisis, experimentos de transferencia adoptiva en vivo y en vitro ensayos de cultura (culturas de la pastilla o líquido).

Identificación y aislamiento de Oligopotent y linaje comprometido progenitores mieloides de la médula ósea de ratón

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

Este método podría ser útil para los hematólogos e inmunólogos que estudian la producción y la función de las células mieloides, incluidos los neutrófilos, los monocitos y las células dendríticas. La principal ventaja de esta técnica es que permite una identificación más precisa de los subconjuntos de progenitores mieloides que las estrategias anteriores. Para enriquecer las células de la médula ósea para los progenitores mediante la clasificación de células activadas magnéticamente, o MACS, granule las células por centrifugación y vuelva a suspender el gránulo en 40 microlitros de tampón de tinción MACS por una vez 10 a las siete células de la médula ósea.Para agotar las células positivas de linaje diferenciado, agregue 10 microlitros de cóctel de anticuerpos de biotina por uno por 10 a las siete células y mezcle pipeteando para una incubación de 10 minutos a cuatro grados centígrados. Al final de la incubación, agregue 30 microlitros de tampón de tinción por una vez 10 a las siete celdas con mezcla, seguido de 20 microlitros de microperlas anti-biotina por una vez 10 a las siete celdas. Después de 15 minutos a cuatro grados centígrados, lave las células con un mililitro de tampón

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Un método de citometría de flujo para la identificación y el análisis molecular de la diferenciación de etapas específicas de murino progenitores eritroides y precursores, directamente en la médula ósea recién cosechadas del ratón, el bazo o el hígado fetal. El ensayo se basa en los marcadores de superficie celular CD71, Ter119 y tamaño de la celda.

Identificación y análisis de los progenitores eritroides ratón usando el CD71/TER119 citometría de flujo ensayo

Un método para analizar la distribución de progenitores hematopoyéticos de médula ósea en citometría de flujo, así como para aislar eficazmente altamente purificadas células madre hematopoyéticas (HSC) se describe. El procedimiento de aislamiento se basa esencialmente en el enriquecimiento magnética de c-kit + células y células de clasificación para purificar las CMH para los estudios celulares y moleculares.

El análisis fenotípico y aislamiento de células madre hematopoyéticas murinas y progenitores comprometidos Lineage

Combinatorias 5 proteínas fluorescentes de marcado de las células madre y progenitoras hematopoyéticas permite in vivo seguimiento clonal a través confocal y microscopía de dos fotones, que proporciona conocimientos sobre la médula ósea hematopoyética arquitectura durante la regeneración. Este método permite la correlación de destino no invasiva de las células derivadas de HSPCs espectralmente-codificados en tejidos intactos durante largos períodos de tiempo después del trasplante.

En Tracking Clonal vivo de madre hematopoyéticas y células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes utilizando confocal y Microscopía Multifotónica

Aquí describimos un protocolo optimizado y altamente reproducible para aislar células progenitoras mesodérmicas (MPCs) de médula ósea humana (hBM). Las MPC se caracterizaron por citometría de flujo y expresión de nestina. Demostraron la capacidad de dar lugar a cultivos celulares similares a MSC en crecimiento exponencial mientras conservan su potencial angiogénico.

Células Progenitoras de aislamiento Mesangiogenic (PSM) de Humana de Médula Ósea

Mientras que los macrófagos infiltrados son continuamente reclutados en tejidos adultos a partir de precursores circulantes, los macrófagos residentes sembran su tejido durante el desarrollo, donde se mantienen sin más aportación de los progenitores. Recientemente se identificaron los progenitores de macrófagos residentes. Aquí, presentamos métodos para el mapeo de destino genético de los progenitores de macrófagos residentes.

Identificación de progenitores eritromioideos y su progenie en el embrión de ratón por citometría de flujo

En este artículo se presentan métodos para aislar y diferenciar las células estromales de médula ósea y células madre hematopoyéticas de los huesos largos de ratón. Dos protocolos diferentes presentan rendimiento diferentes poblaciones celulares adecuadas para la expansión y diferenciación a osteoclastos, osteoblastos y adipocitos.

Aislamiento, cultivo y diferenciación de células estromales de médula ósea y progenitores de los osteoclastos de los ratones

Aquí se presentan protocolos detallados para el cultivo de la línea de célula 32D/G-CSF-R precursor mieloide murinas, realizar infecciones virales y llevar a cabo ensayos de proliferación y diferenciación. Esta línea celular es conveniente para el estudio de desarrollo de las células mieloides y el papel de los genes de interés en el crecimiento de las células mieloides y diferenciación neutrofílica.

Proliferación y diferenciación de precursores mieloides murinas 32D/G-CFS-R las células

Aquí proporcionamos un método para la identificación y aislamiento de grandes cantidades de GM-CSF por células mieloides con clasificación de celda de alta velocidad. Pueden identificarse cinco poblaciones distintas (progenitores mieloides comunes, progenitores de granulocitos/macrófagos, monocitos, macrófagos derivados de monocitos y DCs derivados de monocitos) basado en la expresión Ly6C y CD115.

Generación de un gran número de progenitores mieloides y células dendríticas precursores de médula Murine usando una célula nueva clasificación estrategia

Este método describe la purificación por citometría de flujo de MEP y MKp de fémures, tibias y huesos pélvicos de ratones.

Aislamiento de progenitores de megacariocitos de ratón

Aquí, describimos un nuevo método citométrico de flujo para el aislamiento prospectivo de progenitores eritroides unitarios formadores de ráfagas tempranas (BFU-e) y eritroides unitarios formadores de colonias (UFC-e) directamente de médula ósea y bazo de ratón frescos. Este protocolo, desarrollado en base a datos transcriptómicos unicelulares, es el primero en aislar todos los progenitores eritroides del tejido con alta pureza.

Identificación y aislamiento de progenitores eritroides de unidades formadoras de ráfagas y unidades formadoras de colonias a partir de tejido de ratón mediante citometría de flujo

Aquí se presenta un protocolo detallado para aislar y caracterizar poblaciones microambientales de médula ósea a partir de modelos murinos de síndromes mielodisplásicos y leucemia mieloide aguda. Esta técnica identifica cambios en el nicho de la médula ósea no hematopoyética, incluidas las células endoteliales y mesenquimales del estroma, con progresión de la enfermedad.

Identificación de poblaciones microambientales de médula ósea en el síndrome mielodisplásico y la leucemia mieloide aguda

Aprenda a identificar y aislar seis subconjuntos de progenitores mieloides de médula ósea de ratón mediante MACS y FACS. Este protocolo permite análisis de ARN, proteínas y cultivos in vitro.

Identificación y aislamiento de Oligopotent y linaje comprometido progenitores mieloides de la médula ósea de ratón

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