Identificación y aislamiento de Oligopotent y linaje comprometido progenitores mieloides de la médula ósea de ratón

Este método podría ser útil para los hematólogos e inmunólogos que estudian la producción y la función de las células mieloides, incluidos los neutrófilos, los monocitos y las células dendríticas. La principal ventaja de esta técnica es que permite una identificación más precisa de los subconjuntos de progenitores mieloides que las estrategias anteriores. Para enriquecer las células de la médula ósea para los progenitores mediante la clasificación de células activadas magnéticamente, o MACS, granule las células por centrifugación y vuelva a suspender el gránulo en 40 microlitros de tampón de tinción MACS por una vez 10 a las siete células de la médula ósea.

Para agotar las células positivas de linaje diferenciado, agregue 10 microlitros de cóctel de anticuerpos de biotina por uno por 10 a las siete células y mezcle pipeteando para una incubación de 10 minutos a cuatro grados centígrados. Al final de la incubación, agregue 30 microlitros de tampón de tinción por una vez 10 a las siete celdas con mezcla, seguido de 20 microlitros de microperlas anti-biotina por una vez 10 a las siete celdas. Después de 15 minutos a cuatro grados centígrados, lave las células con un mililitro de tampón de tinción por una vez 10 a las siete celdas y vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de tampón de tinción fresco hasta una vez 10 por las ocho celdas.

A continuación, configure el separador magnético automatizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante y coloque el tubo de celdas marcadas en el separador. Comience el programa de selección de negativos para recolectar la fracción negativa que contiene las células negativas del linaje enriquecido progenitor. Granule las células negativas del linaje por centrifugación y vuelva a suspender el pellet, que ahora es blanco, en dos mililitros de tampón de tinción por ratón para contar.

Para aislar las células progenitoras mieloides por FACS, agregue una vez 10 a las células negativas del quinto linaje a cada uno de los ocho tubos de microcentrífuga de control para la selección de voltaje y la compensación de color y agregue el resto de la muestra de células a un noveno tubo de microcentrífuga para tinción con los siete anticuerpos marcadores de superficie de interés para la identificación y clasificación de progenitores. Granular las células por centrifugación y resuspender los gránulos de control en 100 microlitros de tampón de tinción FACS y el pellet de muestra experimental en 100 microlitros de tampón de tinción por cinco veces 10 a las seis células. A continuación, agregue el anticuerpo anti-CD16/CD32 al tubo de tinción única del receptor gamma Fc y al tubo de muestra.

Agite suavemente e incube las muestras durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Al final de la incubación, agregue los otros anticuerpos a los tubos de tinción única correspondientes y al tubo de muestra y, después de un suave vórtice, incube las muestras durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Al final de la incubación, agregue 900 microlitros de tampón de tinción a los tubos de control y un mililitro de tampón de tinción por uno por 10 a las siete celdas del tubo de muestra para la centrifugación.

Vuelva a suspender los gránulos de control en 200 microlitros de tampón de tinción fresco por tubo y el gránulo experimental en 500 microlitros por 2,5 veces 10 a las siete celdas y transfiera las celdas marcadas a los tubos FACS individuales de cinco mililitros correspondientes. A continuación, configure el citómetro de flujo de acuerdo con los protocolos estándar y utilice los controles sin tinción y con una sola mancha para establecer los voltajes y las compensaciones de color. Para identificar y aislar las células progenitoras mieloides, cargue la muestra de células experimentales en el citómetro y cree un diagrama de área de dispersión frontal frente a área de dispersión lateral, con compuerta para excluir los desechos y las células muertas.

Cree un diagrama de altura de dispersión hacia adelante frente a ancho de dispersión hacia adelante de las celdas vivas y la puerta para excluir los dobletes. Repita este proceso con un diagrama de altura de dispersión lateral frente a ancho de dispersión lateral de los singletes de dispersión directa y la puerta para excluir los dobletes. Cree un gráfico y una puerta de Sca-1 frente a c-Kit para seleccionar los progenitores positivos de Sca-1 negativos de c-Kit.

A continuación, cree un gráfico y una puerta de receptor gamma CD-34 frente a FC para seleccionar las poblaciones mixtas de progenitores mieloides comunes y progenitores de monocitos de granulocitos mixtos. Es importante determinar con la mayor precisión posible las poblaciones mixtas de progenitores mieloides comunes y progenitores de monocitos de granulocitos mixtos. Puede ser útil utilizar una gráfica de densidad de pseudocolor o una gráfica de contorno para una compuerta más precisa.

Utilice las células de la puerta progenitora mieloide común mixta para crear una gráfica y una puerta CD115 frente a Flt3 para seleccionar las células bajas CD115 positivas para el progenitor mieloide común Flt3, las células bajas CD115 negativas para el progenitor mieloide común Flt3 y las células dendríticas monocitarias altas Flt3 positivas para CD115. Utilice las células de la puerta progenitora de monocitos de granulocitos mixtos para crear un gráfico y una puerta de receptor Gamma Ly6C frente a FC para seleccionar las células negativas de Ly6C y las células positivas de Ly6C. A continuación, cree una gráfica de CD115 frente a Flt3 para cada subpoblación de células progenitoras de monocitos de granulocitos mixtos con puerta cerrada y controle los progenitores de monocitos de granulocitos bajos Ly6C negativos para Flt3 negativos, CD115 con neutros bajos con Ly6C positivos, Flt3 negativos para CD115 y los progenitores de monocitos con alto índice de CD115 positivos para Flt3 negativo para Ly6C.

La depleción máxima del linaje es eficiente en la depleción de células diferenciadas y en el enriquecimiento de las células progenitoras positivas para c-Kit. La fracción negativa del linaje todavía contiene algunas células c-Kit negativas, pero estas células se eliminarán en los siguientes pasos de activación de la citometría de flujo. Los rendimientos de los progenitores después de la clasificación FACS pueden variar dependiendo de la configuración del clasificador utilizada, pero debería ser posible obtener entre una y cuatro veces 10 a la cuarta celdas por fracción de cada ratón con una pureza posterior a la clasificación superior al 95% para cada fracción.

Una buena tinción es fundamental para una separación limpia de las poblaciones. Es posible que deba ajustar la dosis de los anticuerpos o elegir diferentes fluoróforos para garantizar una separación óptima. Este protocolo se puede utilizar para identificar células progenitoras para evaluar las diferencias en la composición de la médula ósea entre muestras, para aislar progenitores para análisis moleculares o para evaluar su capacidad para producir células mieloides.