과일 플라이의 면역 염색과 Steroidogenic 기관 및 그들의 상호 작용하는 장기를 시각화하기위한 프로토콜 노랑 초파리

이 절차의 전반적인 목표는 초파리인 Drosophila melanogaster의 유충 또는 성인 암컷에서 스테로이드 유발 기관과 상호 작용 기관을 시각화하는 것입니다. 이 방법은 곤충 스테로이드 호르몬 생합성과 짝짓기 및 변태의 기초가 되는 신경 조절 메커니즘을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 스테로이드 유발 기관의 신경 분포와 상호 작용 기관의 상대적인 부분이 그대로 유지된다는 것입니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 파리 유충의 스테로이드 유발 기관이 매우 작고 투명하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 저와 제 연구실은 해부 프로토콜을 공유하게 되어 기쁩니다. 자, 시작하겠습니다.

유충을 준비한 후 PBS로 채워진 3cm 접시에 담아 해부 현미경으로 해부 과정을 시작합니다. 먼저 집게로 입 고리를 잡습니다. 그런 다음 마이크로 가위를 사용하여 앞쪽 끝에서 길이의 약 1/3 지점에서 몸을 절단합니다.

다음으로, 한 쌍의 집게로 앞쪽 길이를 잡고 두 번째 쌍을 사용하여 머리 끝을 몸 안으로 부드럽게 밀어 넣어 궁극적으로 애벌레 몸을 뒤집습니다. 이런 식으로 10분 이내에 최대 20마리의 유충을 준비한 다음 고착 용액으로 옮깁니다. 30분 후 제제를 세척하고 면역염색을 진행합니다.

시작하려면 유충을 약 1시간 동안 물에 담가 두어 유충을 질식시켜 움직이지 못하게 합니다. 그런 다음 실리콘으로 코팅된 접시에 PBS 한 방울에 유충 등쪽이 위로 향하게 놓습니다. 등쪽에는 두 개의 기관관이 있습니다.

해부 현미경으로 집게를 사용하여 곤충 핀을 앞쪽 끝에 삽입합니다. 그런 다음 몸을 뒤쪽으로 늘리고 뒤쪽 끝에 두 번째 핀을 넣습니다. 그런 다음 마이크로 가위를 사용하여 꼬리 근처를 작게 절개합니다.

절개 부위에서 등쪽 표피를 등쪽 정중선을 따라 머리 쪽으로 세로로 조심스럽게 자르되 표피 아래 조직은 손상시키지 않도록 합니다. 절개 후 몸벽을 벌리고 모서리에 곤충 핀으로 고정합니다. 그런 다음 겸자를 사용하여 전방 지방체와 타액선을 제거하여 뇌 고리 복합체를 표면의 노출시킵니다.

이제 PBS를 흡인하고 제제를 고착 용액에 담그십시오. 30분 후 집게를 사용하여 곤충 핀을 제거하고 0.3%PBT로 채워진 마이크로튜브에 제제를 옮깁니다. 그런 다음 면역염색을 진행합니다.

유충을 면역염색한 후 일회용 피펫을 사용하여 샘플을 0.3%PBT로 채워진 접시에 옮깁니다. 해부 현미경으로 큐티클이나 입 고리를 집게 한 쌍으로 잡습니다. 그런 다음 1ml 주사기에 칼처럼 부착된 27게이지 바늘을 사용하여 식도와 안구 디스크의 앞쪽 끝을 잘라내어 신체 큐티클에서 뇌고리 안구 디스크 복합체를 제거합니다.

다음으로, 겸자를 사용하여 식도와 장을 뇌고리 안구 디스크 복합체에서 조심스럽게 분리합니다. 식도는 복부 신경삭 위의 뇌를 통과하기 때문에 장을 뒤쪽으로 당깁니다. 마지막으로, 뇌-고리 복합체를 분리하기 위해 바늘 칼로 뇌 디스크, 안구 디스크 및 다리 디스크 사이의 연결을 조심스럽게 잘라냅니다.

해부하는 동안 날카로운 모서리가 있는 가는 집게를 사용하는 것이 매우 중요합니다. 나는 당신이 숫돌 조각으로 집게를 날카롭게 하여 틈 없이 가장자리를 함께 모으는 것이 좋습니다. s를 옮기려면ample, 넓은 구멍 팁이 있는 마이크로 피펫을 사용하십시오.

샘플을 유리 슬라이드 중앙에 놓습니다. 그런 다음 집게를 사용하여 샘플을 복부 쪽에 배치하여 뇌의 등쪽에 위치한 고리샘을 이미지화할 수 있습니다. 그런 다음 슬라이드를 기울여 여분의 PBT를 최대한 닦아냅니다.

그런 다음 샘플 근처에 장착 시약 한 방울을 놓고 집게를 사용하여 시약 위로 커버 슬립을 천천히 내린 다음 샘플 위로 내립니다. 성인 여성의 난소를 해부하기 위해 이산화탄소 가스로 파리를 마취합니다. 그런 다음 머리를 자르고 PBS로 채워진 3cm 접시에 시체를 옮긴다.

다음으로, 해부 현미경으로 집게로 흉부의 등쪽을 잡고 두 번째 집게로 복부 분절 A-5 또는 A-6을 잡습니다. 그런 다음 복부 큐티클을 뒤쪽으로 벗겨냅니다. 계속하기 전에 집게에서 끈적끈적한 큐티클을 청소하십시오.

다음으로, 난관을 꼬집고 난소를 분리합니다. 그런 다음 집게를 사용하여 난소 끝을 빗질하고 펴십시오. 펴 바르면 난소를 고정액에 30분 동안 담가 염색을 준비합니다.

난소의 신경 분포를 유지하는 제제를 만들기 위해, 마취된 암컷 파리를 PBS로 채워진 실리콘으로 코팅된 접시에 옮깁니다. 해부 현미경 아래에서 코를 잡고 머리 표피를 벗겨내어 뇌를 노출시킵니다. 뇌에서 부착된 기관을 제거하고 뇌는 복부 신경삭에 연결된 상태로 둡니다.

그런 다음 흉부의 등쪽을 잡고 다리와 날개를 제거합니다. 다음으로, 각 다리의 기저부부터 시작하여 흉부의 복부 큐티클을 벗겨냅니다. VNC가 노출되면 겸자를 사용하여 VNC에 부착된 잔여 등쪽 표피와 근육을 매우 조심스럽게 제거합니다.

뇌와 VNC 사이의 연결을 손상시키지 마십시오. 다음으로, 겸자를 사용하여 복부 표피를 벗겨내어 난소와 소품, 장, 난관, 자궁 및 부속샘을 포함한 상호 작용 기관을 노출시킵니다. 마지막으로 기관과 지방체를 포함한 잔여 조직을 제거합니다.

그런 다음 샘플을 고정 용액에 30분 동안 담가 면역 염색을 준비합니다. 면역염색 후 마이크로 피펫을 사용하여 0.1%PBT의 유리 슬라이드로 샘플을 옮깁니다. 그런 다음 현미경으로 슬라이드를 보고 집게를 사용하여 난소의 끈을 서로 분리합니다.

이 과정에서 난소 끝을 다치지 마십시오. 그들은 germaria를 포함합니다. 뇌가 생식 기관 복합체를 형성할 수 있도록 준비할 때, 잔여 큐티클을 모두 제거하고 구조를 슬라이드에 펼쳐 놓는다.

다음으로, 여분의 PBT를 대부분 닦아낸 다음 시료에 장착 시약 한 방울을 바릅니다. 다음으로, 집게를 사용하여 덮개 슬립을 슬라이드에 천천히 놓고 슬라이드를 어두운 곳에서 섭씨 4도에서 보관하십시오. 나중에, 현미경으로 샘플을 관찰하고 스테로이드 유발 기관을 시야에 가져옵니다.

보기가 고정되면 이미징 시스템을 이미지 획득 모드로 전환합니다. 유충 단계에서 흉부선은 항슈라우드 항체를 포함한 엑디스테로이드생성 효소에 대한 항체로 표지되었습니다. 흉선과 뇌 사이의 신경 연결을 시각화하기 위해 뇌-고리 복합체를 해부했습니다.

필레 해부법은 구상위신경계(ssaintgastric nervous system)를 보여주는데, 이 신경계에서는 세로토닌성 뉴런 그룹이 흉부샘(prothoracic gland), 복측근(proventriculus) 및 인두근(pharyngeal muscle)으로 돌출되어 있습니다. 성인 여성의 경우, 난소 엑디스테로이드는 GSC 증식과 같은 난자 형성의 여러 측면에 영향을 미칩니다. GSC는 난소의 각 난소 끝에 있는 생식세포에 있습니다.

germarium 내에서 GSC는 1B1 및 DE-cadherin의 두 가지 항체를 사용하여 특이적으로 표지되었습니다. 난소의 신경 분포를 시각화하기 위해 난소와 뇌, VNC, 장, 소품, 자궁 및 정자를 해부했습니다. 뉴런은 n-Synaptobrevin GAL4 드라이버의 제어 하에 mCD8:GFP에 의해 시각화되었습니다.

또한, 근육 구조는 diconjugated phalloidin을 사용하여 염색했습니다. 스테로이드 유발 장기의 해부는 처음에는 어렵게 느껴질 수 있지만, 이 동영상을 사용하여 조직의 절단 지점을 파악하여 부상 없이 장기를 보다 쉽게 분리할 수 있습니다. 우리는 우리의 프로토콜이 초보자뿐만 아니라 경험 많은 연구자에게도 유익하기를 바랍니다.

마스터하면 이 절차를 연구에 적용하고 필요에 맞게 연마할 수 있습니다. 우리는 이 프로토콜이 스테로이드 호르몬 생합성에 대한 포괄적인 이해에 도움이 되기를 바랍니다. 보다 자세한 단계별 프로토콜은 원고에서 확인할 수 있습니다.

꼭 체크해 보세요.