과일 플라이의 면역 염색과 Steroidogenic 기관 및 그들의 상호 작용하는 장기를 시각화하기위한 프로토콜

본 실험 절차의 전반적인 목표는 초파리(Drosophila melanogaster)의 유충 또는 성체 암컷에서 스테로이드 생성 기관과 그 상호작용 기관들을 시각화하는 것입니다. 이 방법은 곤충의 스테로이드 호르몬 생합성과 교미 및 변태의 기저에 있는 신경 조절 메커니즘을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 스테로이드 생성 기관의 신경 분포와 상호작용 기관의 상대적 부분이 온전하게 유지된다는 점입니다.

일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 분들은 초파리 유충의 스테로이드 생성 기관이 매우 작고 투명하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 저와 저희 연구실에서 사용 중인 해부 프로토콜을 공유하게 되어 기쁩니다. 그럼, 시작하겠습니다.

유충 준비가 완료되면, PBS가 채워진 3cm 디쉬에서 해부 현미경을 이용하여 본격적인 해부를 시작합니다. 먼저, 핀셋으로 입갈고리(mouth hook)를 잡습니다. 그런 다음, 마이크로 가위를 사용하여 전단부로부터 전체 길이의 약 3분의 1 지점에서 몸체를 절단합니다.

다음으로, 한 쌍의 포셉으로 앞부분의 길이를 잡고 다른 한 쌍의 포셉을 사용하여 머리 끝부분을 몸통 쪽으로 조심스럽게 밀어 넣어, 최종적으로 유충의 몸통을 뒤집어 줍니다. 이러한 방식으로 10분 이내에 최대 20마리의 유충을 준비한 후, 고정액으로 옮깁니다. 30분 후에 준비물을 세척하고 면역염색을 진행합니다.

먼저, 유충을 물에 약 1시간 동안 담가 두어 질식시켜 움직이지 못하게 합니다. 그런 다음, 실리콘 코팅 접시 위에 PBS 한 방울을 떨어뜨리고 유충의 등 쪽이 위를 향하도록 놓습니다. 등 쪽에는 두 개의 기관(tracheal tubes)이 있습니다.

해부 현미경 하에서 핀셋을 사용하여 곤충 핀을 앞쪽 끝부분에 삽입합니다. 그다음, 몸통을 뒤쪽으로 늘린 후 두 번째 핀을 뒤쪽 끝부분에 꽂습니다. 이어서 마이크로 가위를 사용하여 꼬리 근처를 작게 절개합니다.

절개 부위부터 큐티클 아래의 조직이 손상되지 않도록 주의하며, 머리 방향으로 등쪽 중앙선을 따라 등쪽 큐티클을 세로로 조심스럽게 절개합니다. 절개를 마친 후, 체벽을 양옆으로 벌려 모서리 부분에 곤충 핀으로 고정합니다. 그런 다음 핀셋을 사용하여 전방 지방체와 타액선을 제거하여 표면에 뇌-환상선 복합체가 드러나게 합니다.

이제 PBS를 흡입하여 제거하고, 준비물을 고정액에 담급니다. 30분 후, 포셉을 사용하여 곤충 핀을 제거하고 준비물을 0.3% PBT가 채워진 마이크로튜브로 옮깁니다. 그런 다음, 면역염색을 진행합니다.

유충의 면역염색 후, 일회용 피펫을 사용하여 샘플을 0.3% PBT가 채워진 접시에 옮깁니다. 해부 현미경 하에서 한 쌍의 포셉으로 큐티클이나 입 갈고리(mouth hook)를 잡습니다. 그런 다음, 1mL 주사기에 연결된 27게이지 바늘을 칼처럼 사용하여 식도의 앞쪽 끝부분과 안구 디스크(eye discs)를 잘라내어, 몸의 큐티클로부터 뇌-링샘-안구 디스크 복합체(brain-ring gland eye disc complex)를 제거합니다.

다음으로, 핀셋을 사용하여 식도와 장을 뇌-환상선-눈 원반 복합체에서 조심스럽게 분리합니다. 식도가 복측 신경삭 위쪽의 뇌를 통과하므로, 장을 후측으로 당겨 뺍니다. 마지막으로, 뇌-환상선 복합체를 분리하기 위해 니들 나이프로 뇌 원반, 눈 원반 및 다리 원반 사이의 연결 부위를 조심스럽게 절단합니다.

해부 과정 중에는 날카로운 가장자리를 가진 미세 핀셋을 사용하는 것이 매우 중요합니다. 핀셋의 끝부분에 틈이 없도록 숫돌 조각으로 갈아서 정교하게 맞추는 것을 강력히 권장합니다. 샘플을 옮길 때는 입구가 넓은 팁이 장착된 마이크로 피펫을 사용하십시오.

샘플을 유리 슬라이드 중앙에 놓습니다. 그다음, 핀셋을 사용하여 샘플을 복측(ventral side)이 위로 오도록 배치하여 뇌의 배측(dorsal side)에 위치한 환상선(ring gland)을 촬영할 수 있게 합니다. 이어서 슬라이드를 기울여 과량의 PBT를 최대한 닦아냅니다.

그 다음, 샘플 근처에 마운팅 시약 한 방울을 떨어뜨리고 핀셋을 사용하여 커버슬립을 시약 위로, 이어서 샘플 위로 천천히 내립니다. 성체 암컷의 난소를 해부하려면 이산화탄소 가스로 초파리를 마취하십시오. 그 후 머리를 절단하고 몸체를 PBS가 채워진 3 cm 접시에 옮깁니다.

다음으로, 해부 현미경 하에서 핀셋으로 흉부의 등쪽을 잡고, 다른 핀셋으로 복부 마디 A-5 또는 A-6를 잡습니다. 그런 다음, 복부 큐티클을 후방 쪽으로 벗겨냅니다. 다음 단계로 넘어가기 전, 핀셋에 묻은 끈적거리는 큐티클을 닦아냅니다.

다음으로, 수란관을 꼬집어 묶고 난소를 분리합니다. 그런 다음 핀셋을 사용하여 난소의 끝부분을 빗질하듯 풀어 넓게 폅니다. 넓게 펴진 난소를 고정액에 30분 동안 담가 염색 준비를 합니다.

난소의 신경 지배를 유지하는 표본을 만들기 위해, 마취된 암컷 초파리를 PBS가 채워진 실리콘 코팅 접시에 옮깁니다. 해부 현미경 하에서 구강침을 잡고, 머리 큐티클을 벗겨 뇌를 노출시킵니다. 뇌에서 부착된 기관을 제거하며, 이때 뇌가 복부 신경삭과 연결된 상태를 유지하도록 합니다.

그 다음, 흉부의 등쪽을 잡고 다리와 날개를 제거합니다. 이어서 각 다리의 기저부부터 시작하여 흉부의 배쪽 큐티클을 벗겨냅니다. VNC가 노출되면 핀셋을 사용하여 VNC에 붙어 있는 잔여 등쪽 큐티클과 근육을 매우 조심스럽게 제거합니다.

뇌와 VNC 사이의 연결 부위가 손상되지 않도록 주의하십시오. 다음으로, 핀셋을 사용하여 복부 큐티클을 벗겨내어 난소와 그 주변 기관(지지 구조, 장, 난관, 자궁, 부속샘 포함)을 노출시킵니다. 마지막으로 기관과 지방체를 포함한 잔여 조직을 모두 제거하십시오.

그 다음, 면역염색을 준비하기 위해 샘플을 고정액에 30분 동안 담급니다. 면역염색 후, 마이크로 파이펫을 사용하여 샘플을 0.1% PBT가 들어 있는 유리 슬라이드로 옮깁니다. 그런 다음, 현미경으로 슬라이드를 관찰하고 핀셋을 사용하여 난소관의 가닥들을 서로 분리합니다.

이 과정 중에 난소 소관의 끝부분이 손상되지 않도록 주의하십시오. 이곳에는 생식낭이 포함되어 있습니다. 뇌-생식기관 복합체를 준비할 때, 남아 있는 큐티클을 모두 제거하고 구조물들이 슬라이드 위에 넓게 퍼지도록 하십시오.

다음으로, 과도하게 도포된 PBT의 대부분을 닦아낸 후, 시료에 봉입제 한 방울을 떨어뜨립니다. 그다음 핀셋을 사용하여 커버 슬립을 슬라이드 위에 천천히 덮고, 슬라이드를 4°C의 암소에 보관합니다. 이후 현미경으로 시료를 관찰하여 스테로이드 생성 기관이 시야에 들어오게 합니다.

시야가 고정되면, 이미징 시스템을 이미지 획득 모드로 전환합니다. 유충 단계 동안 전흉선은 anti-shroud 항체를 포함하여 엑디스테로이드 생성 효소에 대한 항체로 표지되었습니다. 전흉선과 뇌 사이의 신경 연결을 시각화하기 위해, 뇌-환상선 복합체를 해부하였습니다.

필레 해부법은 세로토닌성 뉴런 그룹이 전흉선, 전위 및 인두 근육으로 투사되는 위장 신경계를 보여줍니다. 성체 암컷의 경우, 난소의 엑디스테로이드는 GSC 증식과 같은 난자 형성의 여러 측면에 영향을 미칩니다. GSC는 난소 내 각 난소 소관 끝의 생식관에 위치합니다.

생식소(germarium) 내에서 GSC는 1B1 및 DE-cadherin의 두 가지 항체를 사용하여 특이적으로 표지되었습니다. 난소의 신경 분포를 시각화하기 위해 난소를 뇌, VNC, 장, prop, 자궁 및 수정낭과 함께 적출하였습니다. 뉴런은 n-Synaptobrevin GAL4 드라이버의 제어하에 있는 mCD8:GFP를 통해 시각화되었습니다.

또한, 이중 접합 phalloidin을 사용하여 근육 구조를 염색하였습니다. 스테로이드 생성 기관의 해부는 처음에는 어렵게 느껴질 수 있으나, 본 영상을 통해 조직의 절단 지점을 익혀 기관의 손상 없이 더 쉽게 분리하는 방법을 배우시기 바랍니다. 본 프로토콜이 초보자뿐만 아니라 숙련된 연구자분들에게도 유용한 정보가 되기를 바랍니다.

이 절차를 숙달한 후에는 귀하의 연구에 적용하고 필요에 맞게 수정하여 사용할 수 있습니다. 본 프로토콜이 스테로이드 호르몬 생합성에 대한 포괄적인 이해에 도움이 되기를 바랍니다. 더 자세한 단계별 프로토콜은 원고에서 확인하실 수 있습니다.

확인해 주시기 바랍니다.