Name: 과일 플라이의 면역 염색과 Steroidogenic 기관 및 그들의 상호 작용하는 장기를 시각화하기위한 프로토콜 노랑 초파리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: 학습하세요 Drosophila melanogaster의 스테로이드 생성 기관 면역 염색법을 통해 곤충 스테로이드 호르몬 생합성과 신경 조절 메커니즘을 시각화하는 방법을 배우세요.

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우리는이 작품에 대한 자신의 기술 지원 레이코 키세 및 Tomotsune Ameku 감사합니다. 우리는 또한 케이 이토, 올가 알렉시앙코, 아키코 고토 마사유키 미우라, 블루밍턴 초파리 증권 센터, 교토 증권 센터 (DGRC)과 주식 및 시약의 발달 연구 하이 브리 도마 은행에 감사하고 있습니다. 이 작품은 JSPS KAKENHI 허가 번호 16K20945, 나이토 재단, 그리고 이노우에 과학 연구 상에서 YSN 보조금에 의해 지원되었다; 및 문부 과학성 KAKENHI 허가 번호 16H04792에서 RN에 그랜트.

참고 : 프로토콜의 전체 구조는 그림 1과 같다. 1. 애벌레 링 선의 해부 (RG) 참고 : D에서. cyclorrhaphous 파리목에 속하는 melanogaster의는 상기 PG는 복합 내분비 장기 링 마개 (RG,도 2D)라는 조건. PG는 수술 (후술하는) 다른 유형의 세포로부터 분리하는 것이 실행할 수 없게되기 때문에, 실제 타겟 절개하여 그대로 손상 RG를 분리하는 것이다. <ol><li> 적절한 발달 단계에서 유충의 준비 참고 : D. melanogaster의 유충의 발달 단계를 동기화하기 위해서는 좁은 시간 창 내에서 계란을 수집하고 적절한 시간에 유충을 수집하는 것이 필요하다. <ol><li> 25 ° C에서 포도 주스 한천 플레이트에 2 시간 동안 계란을 수집합니다. </li><li> 수집 한 새로 부화 <sup&gt; 번째 령 집게로 해부 현미경 유충과 으깬 표준 효모 / 옥수수 가루 플라이 음식을 포함하는 작은 유리 병에 전송할 수 있습니다. 참고 : 유충의 연령에 의해 표현된다, &quot;시간 달걀 누워 (하엘) 후&quot; &quot;시간 후에 부화 (HAH)&quot;또는 &quot;L3의 탈피 (hAL3E) 후 시간&quot;. </li><li> 적절한 시점에서, 바람직하지 않은 부상을 방지하기 위해 일회용 플라스틱 루프를 단계적 애벌레를 수집합니다. 3 번째의 령 유충 발달 진행 차이를 최소화하기 위해 70 하엘 (HAH 48)의 2 차의 령 유충을 수집하고 2 개 시간 간격에서 탈피 할 수있다. 그 다음, L3의 탈피 후 2 시간 내에 3 차 령 유충을 수집하고; 이 절차는 0-2 hAL3E 유충을 제공합니다. </li><li> 인산 완충 식염수 (PBS)로 채워진 접시 단계적 유충을 이동. </li><li> 몸에서 잔류 음식을 제거하기 위해 PBS와 유충을 씻어. </li></ol></li><li> 아래에있는 A 유충의 거친 해부해부 현미경 <ol><li> 집게로 유충의 입 후크를 잡습니다. 마이크로 가위를 사용하여 상기 본체의 전방 길이 1/3에서 애벌레 몸을 절단. </li><li> 포셉 한 쌍의 전방 애벌레 신체의 절단 끝을 잡고. 집게의 다른 쌍을 사용하여 부드럽게 본체의 내측을 향하여 상기 헤드의 선단을 밀어; 이 절차는 밖으로 내부의 애벌레 몸을집니다. 참고 :이 단계는 1 차 령 유충의 해부에 대한 건너 뛸 수 있습니다. </li><li> 단계를 반복 1.2.1-1.2.2 추가 유충으로 5 ~ 10 분. 참고 : 유충의 수는 해부 시간을 저장 같거나 20보다 작아야합니다. </li></ol></li><li> 유충의 필렛 해부 참고 :이 방법은 조직의 위치를 ​​유지하는 것은 그대로 유지 할 수 있습니다. <ol><li> 단 1 시간 동안 물에 유충을 둡니다. 유충은 질식에 의한 고정된다. </li><li> 실리콘 코팅에 PBS의 드롭 유충의 등쪽을 넣어요리의 등쪽면을 위로. 주 : 등쪽면은 길이 방향으로 실행이 개 기관 튜브가 있습니다. </li><li> 해부 현미경, 집게를 사용하여 유충의 앞쪽 끝으로 곤충 핀을 삽입한다. 후방 측으로 애벌레 신체 스트레칭 및 유충의 후방 팁에 제 2 핀을 넣어. 주 : 곤충 핀 외에도 텅스텐 와이어로 만들어진 바늘 (21)이 유용 할 수있다. 바늘은 해부 바늘로서 사용하기위한 가열에 피펫 팁에 내장 될 수있다. </li><li> 해부 현미경, 마이크로 가위로 꼬리 근처의 작은 절개를합니다. 절개에서 머리를 향해 지느러미 중간 선을 따라 길이 방향 등의 표피를 잘라. 표피 아래 조직이 손상되지 않도록주의하십시오. </li><li> 양쪽의 bodywall 표피 스트레치와 해부 bodywall의 각 모서리 (4) 핀을 배치했다. </li><li> , 집게와 전방 지방 신체의 일부를 제거하고 뇌 RG의 C를 노출표면 상에 노출 될 omplex. 필요한 경우, 침샘 한 쌍을 제거합니다. </li></ol></li><li> 고정과 함께 면역 조직 염색 <ol><li> 500 μL (PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드) 수정 용액으로 충전 된 150 mL의 마이크로 튜브에 유생 체 (단계 1.2.2)의 앞쪽 1/3을 넣어. 정착액의 불리한 희석 발생할 수도 그렇지 PBS가 고정 된 샘플에 부착 한 번에 20 개 미만의 샘플을 고정한다. 필렛 해부를 들어, PBS 한 방울을 제거한 다음 수정 솔루션의 한 방울을 추가합니다. 참고 : 수정 솔루션의 경우, 3.7 %의 포름 알데히드 또는 4 % 파라 포름 알데히드 중 하나를 사용할 수있다. </li><li> 39 ° C에서 대안 2 시간 동안 실온 (RT) 또는 30 분 동안 수정 용액 해부 조직을 인큐베이션. </li><li> 500 μL PBS와 수정 솔루션을 교체하고 신속하게 샘플을 3 회 씻어. R에 로커에 15 분 동안 500 μL, 0.3 %의 PBT (PBS + 0.3 % 옥틸 페놀에 톡실 레이트)와 함께 샘플을 씻어T. 필릿 해부 곤충 핀을 제거하고 1.5 ㎖의 마이크로 튜브에 시료를 옮긴다. 주 : 조직에 대한 항체의 투과성을 증가시키기 위해, 샘플을 RT에서 로커에 1-2 시간 동안 500 μL 2.0 % PBT를 처리한다. </li><li> 용액 (PBT의 2 % 소 혈청 알부민)를 500 μL로 블로킹 PBT 바꾸기. RT에서 로커에서 1.5 시간 동안 샘플을 인큐베이션. </li><li> 50 μL 차 항체 용액을 블로킹 용액으로 희석 한 항체 즉 블로킹 용액을 대체. </li><li> 밤새 4 ℃에서 로커에 샘플을 인큐베이션. </li><li> 500 μL 0.3 % PBT와 차 항체 용액을 장착하고 신속하게 샘플 5 회 헹군다. RT에서 15 분간 로커 각 500 μL 0.3 % PBT와 샘플 3 회 반복한다. </li><li> 50 μL 차 항체 용액 (블로킹 용액으로 희석 한 염료 복합 항체)를 0.3 % PBT 바꾸기. 핵 염색 0.5 μL 4 &#39;, 6-diamidino- 들어2- 페닐 -은 (DAPI 0.1 mg의 / ㎖ 원액) 50 μL를 첨가한다. RT에서 또는 선택적으로 밤새 4 ℃에서 2 시간 동안 로커에 샘플을 인큐베이션. 참고 : 어둠 속에서 샘플을 보관하십시오. </li><li> 500 μL 0.3 % PBT와 항체 용액을 덮고 5 회 헹군다. RT에서 15 분마다 500 μL 0.3 % PBT와 샘플 3 회 반복한다. </li></ol></li><li> 뇌-RG 복합체의 미세 해부 PG를 포함하고 장착 <ol><li> 0.3 % PBT 가득 접시에 면역 염색 샘플을 전송하는 일회용 피펫을 사용합니다. 참고 : 해부 및 장착시 불편 거품을 방지하기 위해, 0.3 % PBT PBS로 교체 할 수 있습니다. </li><li> 해부 현미경, 포셉 한 쌍의 표피 입 후크를 누르고 있습니다. 는 &quot;칼날&quot;로 1 ml 주사기에 부착 된 27 G 바늘을 사용하여 신체 표피의 뇌 RG 눈 디스크 착물을 제거 식도 눈 디스크의 앞쪽 끝 부분을 잘라. </li><li> SEPA집게로 뇌-RG-눈 디스크 단지에서 식도와 장 평가. 식도 복부 신경 코드 (VNC) 상기 뇌를 통과하기 때문에, 후방 측의 용기를 꺼내. 참고 : 샘플에서 추가 성충 디스크를 제거 바늘 칼로 뇌, 눈 디스크, 다리 디스크 사이의 연결을 차단합니다. </li><li> 다른 샘플 단계를 1.5.1-1.5.4 반복합니다. 참고 : 샘플에 달라 붙는 조직 파편을 방지 0.3 % PBT 또는 PBS로 채워진 다른 깨끗한 접시에 각각의 완성 된 샘플을 전송합니다. </li><li> 마이크로 피펫 깨끗한 유리 슬라이드의 중심에 샘플을 전송합니다. 참고 : 2 차 또는 3 차 령 유충의 경우, 마이크로 피펫 팁의 끝이 면도날을 절약 할 수. </li><li> 해부 현미경, 집게를 사용하여 자신의 등쪽면이 위로 개별 샘플을 맞 춥니 다. 참고 : RG는 그림 2A (뇌의 등쪽에 위치). 이 정렬은 촬영하는 동안 각각의 샘플의 사양을 용이하게합니다. </li><li> 유리 슬라이드를 기울이고 가능한 한 많은 초과 PBT를 닦아. 슬라이드 측에 장착 시약의 방울을 넣어. 드롭의 다른 측으로부터 커버 슬립의 가장자리에 놓고 집게 천천히 시료의 커버 슬립을 넣어. 참고 :이 절차는 커버 슬립 외부 이동 샘플을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 4 ℃에서 샘플을 저장합니다. 어둠 속에서 샘플을 보관하십시오. </li></ol></li></ol> 2. 난소의 해부에 성인 여성 <ol><li> 성인 여성의 준비 <ol><li> 3-4일가 난소를 풍부하게하는 피드 여성 표준 효모 / 옥수수 가루 플라이 음식을 날아. 25 ° C에서 유지한다. </li></ol></li><li> 성인 여성 난소의 해부 <ol><li> 여성은 CO 2 가스 파리 마취와 자신의 머리를 잘라. </li><li> 3 센티미터 접시에 플라이 몸을 이동PBS로 가득. </li><li> 해부 현미경, 집게를 사용하여 등쪽 측의 가슴을 누르고 있습니다. 다른 집게 복부 세그먼트 또는 A5 A6를 잡고 후방 측으로 복부 표피를 벗겨. 포셉의 끝에서 끈적 끈적한 표피를 닦아냅니다. </li><li> 난관을 조이고 몸에서 난소를 꺼내. </li><li> 빗과 집게와 난소의 팁을 확산. 참고 :이 작업은 면역 염색의 효율성을 향상시킨다. </li></ol></li><li> 성인 여성의 뇌, VNC 및 생식 기관의 해부. 참고 :이 방법은 난소의 신경 분포가 그대로 유지 될 수 있습니다. <ol><li> 여성은 CO 2 가스 파리 마취하고 PBS로 가득 실리콘 코팅 접시로 전송. </li><li> 해부 현미경 하에서, 코를 잡고 집게로 뇌를 노출 머리의 표피를 벗겨. 뇌에 부착 된 기관을 제거합니다. 참고 : 꼰 로프n은 백색 둥근 구조이다. 뇌는 흉부에 VNC에 연결합니다. </li><li> 등쪽 측의 가슴을 잡고 포셉 한 쌍의 다리와 날개를 잘라. 포셉의 다른 쌍을 사용하여 다리의 기지에서 흉부 복부 표피를 벗겨. VNC를 노출되면, VNC 사용하는 집게에 부착 된 잔류 등의 표피와 근육을 제거합니다. 뇌와 VNC 사이의 연결이 손상되지 않도록주의하십시오. </li><li> 복부 표피를 벗겨과 난소 및 신경 세포, 작물, 창자, 난관, 자궁, 그리고 악세사리 글 랜드를 비롯한 대화 형 장기 노출 집게를 사용합니다. </li><li> 기관과 집게를 사용하여 지방을 몸을 포함한 잔여 조직을 제거합니다. </li></ol></li><li> 고정과 함께 면역 조직 염색 <ol><li> 250 μL로 채워진 1.5 ㎖의 마이크로 튜브에 고정 용액 난소 약 8-10 쌍 트랜스퍼 (4 % paraformaPBS에서 ldehyde) 및 RT에서 30 분 동안 샘플을 배양한다. </li><li> 500 μL PBS와 수정 솔루션을 교체하고 신속하게 샘플을 3 회 씻어. </li><li> RT에서 5 분마다 샘플을 500 μL의 0.1 % PBT 2 회 반복한다. </li><li> 차단 솔루션 50 μL와 PBT를 교체합니다. RT에서 로커에서 1 시간 동안 샘플을 인큐베이션. </li><li> 50 μL 차 항체 용액으로 블로킹 용액을 대체. </li><li> 밤새 4 ℃에서 로커에 샘플을 인큐베이션. </li><li> 500 μL 0.1 % PBT와 차 항체 용액을 대체. RT에서 15 분간 로커 각 500 μL 0.1 % PBT와 샘플 3 회 반복한다. </li><li> 50 μL 차 항체 용액 0.1 % PBT 바꾸기. 핵 염색을 위해, 50 μL 용액 0.5 μL를 추가 DAPI. RT에서 로커에서 2 시간 동안 샘플을 인큐베이션. </li><li> 500 μL 0.1 % PBT와 이차 항체 용액을 대체. 500 μL 0.1 % PBT로 시료를 3 회 반복<html> RT에서 15 분간 로커마다. 참고 : 세척 절차를 4 ° C에서 하룻밤을 수행 할 수 있습니다. 어둠 속에서 샘플을 보관하십시오. </li></ol></li><li> 유리 슬라이드에 샘플을 장착 <ol><li> 0.1 % PBT는 마이크로 피펫을 이용하여 유리 슬라이드에 시료를 옮긴다. 참고 : 해부 및 장착시 불편 거품을 방지하기 위해, 0.1 % PBT PBS로 교체 할 수 있습니다. </li><li> 난소를 들어, 해부 현미경 집게 서로로부터 ovarioles의 문자열을 분리한다. germaria를 포함하는 ovarioles의 팁을 손상하지 마십시오. 뇌-VNC-생식 기관의 복잡한 경우, 잔류 표피를 제거하고 유리 슬라이드의 위치를 ​​배열합니다. </li><li> 가능한 한 많은 초과 PBT를 닦아 및 샘플의 중앙에 장착 시약 한 방울을 넣어. 천천히 집게를 사용하여 커버 슬립을 놓습니다. </li><li> 4 ℃에서 샘플을 저장합니다. 어둠 속에서 샘플을 보관하십시오. </li></ol></li></ol>공 초점 레이저 주사 현미경과 함께 &quot;&gt; 3. 영상 <ol><li> 현미경으로 샘플을 관찰하고보기의 필드에 steroidogenic 기관을 가지고. 뷰가 고정되면, 화상 취득 모드로 촬상 시스템을 전환. 참고 : 10-20X의 대물 렌즈는 뇌-RG의 복잡하거나 전체 난소의 이미지를 얻기 위해 사용된다. 이와 달리, 대물 렌즈 40-63X (물 또는 오일 침지) GSC를 또는 PG 및 난소 신경 신경 밀도 단백질의 세포 내 위치 파악 시각화 사용된다. </li><li> 첨부 된 소프트웨어 이미지 수집의 매개 변수를 설정합니다. 형광의 조합 (예 : GFP 및 RFP)를 선택합니다. 고속 스캔 절차에 의해, 레이저 파워 검출기의 감도 (이득 / 오프셋), 및 핀 홀의 크기를 조절한다. 주 : 고품질의 이미지를 획득하기 위해, 주사 레이저 파워 검출기 (게인)의 감도는 각각의 샘플에 대해 최적화되어야한다. 모양을 간략하게 설명합니다조직에, 전송 된 광 화상을 형광 영상에 더하여 수행 될 수있다. </li><li> 이미지의 Z 스택을 가져 가라. 연속 빠른 스캔하는 동안, 현미경의 초점 거리와 초점면을 이동하고 시작 위치와 종료 위치를 설정합니다. 슬라이스의 수와 조각 사이의 간격 거리를 적절하게 조정된다. </li><li> 스캔 속도, 스캔 방법 및 양방향 스캔 모드를 선택합니다. </li><li> 이미지 수집을위한 &quot;실제 스캔을 시작합니다.&quot; </li><li> 첨부 된 소프트웨어의 형식으로 이미지를 저장합니다. 참고 : 원본 이미지 파일은 이미지 수집 매개 변수와 비늘의 정보가 포함되어 있습니다. 보낸 이미지는 컴퓨터 (22)에 화상 처리 소프트웨어를 사용하여 처리 될 수있다. </li></ol>

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 ecdysteroid 생합성 및 D. melanogaster의에서의 규제 메커니즘을 연구하고, 해부 및 면역 염색을위한 프로토콜을 고안했다. ecdysteroid 생합성의 타이밍은 신경 입력 큐 (33)의 환경에 의해 영향을받는, 그래서 박리시 뇌 VNC 및 다른 조직과 함께 ecdysteroidogenic 기관의 신경 분포를 유지하기 위해 필수적이다. 전술 한 바와 같이, D. melanogaster의 PG는 코퍼스의 allata (CA) 및 코퍼스에 cardiaca (CC) (도 2d)와 복합체 내분비 장기 RG를 형성한다. PG가 ecdysteroids를 생산하는 동안, CA와 CC는 각각 청소년 호르몬과 adipokinetic 호르몬을 생산하고 있습니다. 이 해부학 적 특성은 D에 ecdysteroido...

다세포 생물에서는 세포의 그룹은 몸 전체에 필수적인 그들의 생체 활동의 전문 기능을 부여한다. 자신의 임무를 완수하기 위해 각 조직이나 기관의 기능과 관련된 유전자의 일련의 표현과 발전의 맥락에서 자신의 활동을 조율하기 위해 다른 조직과 통신한다. 이러한 전문적인 세포 기능과 간 장기 상호 작용을 특성화하기 위해, 우리는 다른 종류의 세포가 다세포 구조에서 그대로 유지되고 함께 세포의 그룹을 지정해야합니다. 이러한 전문 기관의 한 예는 많은 생합성 효소가 활성화 스테로이드 호르몬 1 콜레스테롤에서 변환 단계를 중재 steroidogenic 기관이다. 이러한 효소 유전자의 대부분은 기관 steroidogenic 구체적으로 표현되고, 생합성 경로 단단히 체액 입력 및 신경 입력을 통해 다수의 외부 자극에 의해 조절된다. 일단합성 스테로이드 호르몬은 체액으로 분비되는 유전자 (2)의 다양한 종류의 발현을 조절하기위한 여러 조직 및 기관을 대상으로한다. 따라서, 스테로이드 호르몬의 작용은 항상성, 성장 및 재생을 유지하기 위해 전신 반응을 유도한다. 스테로이드 호르몬 생합성 기능 및 스테로이드 호르몬의다면 발현 성 행동을 조사, 노랑 초파리은 적합한 모델 시스템으로 사용할 수있다. 애벌레 단계 동안, 곤충 스테로이드 호르몬, ecdysteroid가, 전문 내분비 기관에서 생합성되는 것은 prothoracic 글 랜드 (PG)을 3이라고합니다. PG에서, 여러 ecdysteroidogenic 효소 특히 적절한 발달 단계 4에서 탈피하고 변태 제어하는 에크 디손로 콜레스테롤로부터 여러 전환 단계를 촉매. 따라서 ecdysteroid 역가 동적 변화 규제환경 단서에 따라 많은 신호 전달 경로에 의해. 한편, 성인 단계에서 ecdysteroid은 재생, 수면, 메모리 및 수명 5, 6, 7, 8을 포함하여 생리에 중요한 역할을한다. 이는 적극적 ecdysteroid oogenesis 6, 7, 8, 9, 10, 11의 진행을 조절 난소 생합성하는 것으로 알려져있다. 최근 우리는 배아 줄기 세포 (GSC를)의 개수가 정합에 응답 ecdysteroid 성 펩티드 및 시그널링에 의해 영향을받는 것으로보고 (12)를 자극했다. D.의 강력한 도구가 잘 주석 게놈 정보를 포함 유전학 및 세포 생물학을, melanogaster의 이진 유전자발현 시스템 및 유전자의 RNAi 기술은 PG 및 난소 13, 14, 15 생합성을 ecdysteroid 필수적인 유전자를 식별 할 수있게했다. ecdysteroidogenic 유전자가 식별되면, 이러한 유전자 및 유전자 산물의 동적 지역화의 전사 조절은 생합성 경로 (16)에 조사 될 수있다. 이를 위해, 정량적 역전사 - 중합 효소 연쇄 반응은 동일계 하이브리드 화 및 면역 조직 RNA 분석을 실시한다. 이러한 기술의 적용은 어려운 과제를 포함하고; PG 또는 난소의 정교한 해부. 특히, 초파리의 PG는 다른 곤충에 비해 상대적으로 작은 (예 : 누에와 타격 비행은), 그래서 하나는 과일의 중요한 기술이 샘플링 해부 비행 연습을 할 필요가있다. 또한, 두 ecdysteroidogenic 기관은 신경 분포를받을중추 신경계 (CNS) 17, 18, 19, 20 S. 따라서, 정확한 해부학 적 분석을 위해 상기 장기 ecdysteroidogenic은 CNS 및 다른 기관들은 신경 연결을 방해하지 함께 그대로 유지한다. 여기에서 우리는 해부와 D의 steroidogenic 기관의 시각화를위한 프로토콜을 제공합니다. melanogaster의. 해부 기술을 배우는 것은이 실험에 대한 중요한 출발점이 될 것입니다. 또한, 하나는 성공적으로 여러 항체 및 GAL4 드라이버 라인으로 steroidogenic 기관뿐만 아니라 상호 작용하는 기관에 레이블을 지정할 수 있습니다. 이러한 기술, 재료 및 유전학을 활용, 하나는 스테로이드 호르몬 생합성의 포괄적 인 메커니즘을 연구 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>egg collection</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>tissue culture dish (55 mm)</td><td>AS ONE</td><td>1-8549-02</td><td>&nbsp; 포도 주스 한천 플레이트</td></tr><tr><td>회수 컵</td><td>HIKARI KAGAKU</td><td></td><td></td></tr><tr><td>효모 페이스트</td><td>동양 건조 효모, 도쿄</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% 포도 주스</td><td>Welch Food Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>사육용 유충</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>small 바이알 (12ml, 40회; 23.5 mm, PS)</td><td>SARSTEDT</td><td>58.487</td><td></td></tr><tr><td>일회용 루프</td><td>AS ONE</td><td>6-488-01</td><td></td></tr><tr><td>표준 플라이 식품</td><td></td><td></td><td>&nbsp; Blooington 주식 센터의 웹 사이트에서 우리를 recipi.</td></tr><tr><td><강>해부</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Leica</td><td>S8 AP0</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 접시(35 x 10mm, 미처리)</td><td>IWAKI</td><td>1000-035</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>TORAY</td><td></td><td>코팅 실리콘 내부 접시</td></tr><tr><td>테루모 바늘(27G, 0.40 x 19mm)&nbsp;</td><td>TERUMO</td><td>NN-2719S</td><td>조직 겸자를 "칼"</td></tr><tr><td>, Inox, # 5</td><td>Dumont, Switzerland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>곤충 핀 (직경 0.18 mm)</td><td>시가 브랜드</td><td></td><td>필레 해부</td></tr><tr><td>마이크로 가위</td><td>NATSUME SEISAKUSHO CO LTD.&nbsp;</td><td>MB-50-10</td><td></td></tr><tr><td><강력>고정</강력></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>초순수</td><td>머크 밀리포어</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드</td><td>Nacalai 테스크</td><td>16222-65</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Nacalai 테스크</td><td>02890-45</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Nacalai tesque</td><td>35501-15</td><td></td></tr><tr><td>microtubes (1.5 ml)</td><td>INA OPTIKA</td><td>CF-0150</td><td></td></tr><tr><td>Incubation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>As one swist mixer TM-300 (rocker)</td><td>As one</td><td>TM-300</td><td></td></tr><tr><td>rocker Bovine Serum Albumin</td><td>SIGMA</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>primary antibody</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-Sro (기니피그), 1:1000</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-GFP (토끼), 1:1000</td><td>Molecular Probes</td><td>A6455</td><td>Shimada-Niwa ans Niwa, 2014</td></tr><tr><td>anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100</td><td>Nakarai tesque</td><td>04363-66</td><td></td></tr><tr><td>anti-5HT (rabbit), 1:500</td><td>SIGMA</td><td>S5545</td><td></td></tr><tr><td>anti-Hts 1B1 (mouse)</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td><td>1B1</td><td></td></tr><tr><td>anti-DE-cadherin (rat), 1:20</td><td>DSHB</td><td>DCAD2</td><td></td></tr><tr><td>anti-nc82 (mouse), 1:50</td><td>DSHB</td><td>nc82</td><td></td></tr><tr><td>secondary 항체</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>goat anti-Rabbit IgG (H+L) 2차 항체, Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) 2차 항체, Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Rat IgG (H+L) 2차 항체, Alexa Fluor 546 conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>A-11081</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) 2차 항체, Alexa Fluor 555 conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>A-21435</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin</td><td>Life 기술</td><td>A-22283</td><td></td></tr><tr><td><강력>장착 시약</강력></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로 슬라이드 유리</td><td>Matsunami Glass Ind.,Ltd.</td><td>SS7213</td><td></td></tr><tr><td>사각 현미경 커버 유리</td><td>Matsunami Glass Ind., Ltd.</td><td></td><td></td>C218181</tr><tr><td>FluorSave 시약 (마운팅 시약)</td><td>Calbiochem</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipette 1 ml (일회용 스포이드)</td><td>WATSON</td><td>5660-222-1S</td><td></td></tr><tr><td>imaging</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM700 레이저 스캐닝 현미경 시스템</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>inverted Axio Observer. Z1 SP 왼쪽</td></tr><tr><td>image processing</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM700 ZEN</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>64비트 Microsoft Windows7 운영 체제</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fly stocks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>w를 기반으로 하는 특수 사용자 인터페이스입니다<td>. GMR45C06-갈4</td><td></td><td></td><td>&nbsp; 블루밍턴 초파리 주식 센터에서. (#46260)</td></tr><tr><td>UAS&ndash; GFP; UAS&ndash; mCD8::도쿄</td><td>대학의 K. Ito로부터의</td> GFP <td></td><td></td> 선물.</tr><tr><td>w[1118]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>w; 팬텀-GAL4#22/UAS-turboRFP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4</td><td></td><td></td>는 <td>Ref29, Alekseyenko, O.V, Lee, C. & 크라비츠, E.A.(2010)</td></tr><tr><td>w; UAS-mCD8::GFP</td><td></td><td></td><td>&nbsp; 블루밍턴 초파리 주식 센터에서. (#32188)</td></tr><tr><td>yw;; nSyb-GAL4</td><td></td><td></td><td>&nbsp; 블루밍턴 초파리 주식 센터에서. (#51941)</td></tr></tbody></table>

과일 플라이의 면역 염색과 steroidogenic 기관 및 그들의 상호 작용하는 장기를 시각화하기위한 프로토콜<em&gt; 노랑 초파리</em

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

다세포 생물에있어서, 세포의 작은 그룹은 성장과 재생에 대한 조직 반응을 유도하는 그들의 생물학적 활성의 특수한 기능을 부여한다. 곤충, 애벌레 prothoracic 글 랜드 (PG) 및 ecdysteroids라는 주요 스테로이드 호르몬 생합성에있는 성인 여성의 난소 플레이 필수적인 역할. 이러한 기관은 ecdysteroidogenic 생합성 타이밍 큐 환경에 의해 영향을 받는다되는 신경계에서 신경 지배된다. 여기에서 우리는 스테로이드 호르몬 생합성과 규제 메커니즘을 연구하기위한 적절한 모델 시스템을 제공 초파리 melanogaster의를 비행 ecdysteroidogenic 기관과 유충에서의 대화 형 기관과 과일의 성인을 시각화하는 프로토콜을 설명합니다. 숙련 된 해부은 우리가 뇌, 복부 신경 코드 및 다른 조직을 포함하여 ecdysteroidogenic 기관의 위치와 그들의 상호 작용하는 기관을 유지할 수 있습니다. 로모그래퍼 면역 염색ecdysteroidogenic 효소에 대한 ntibodies는 조직 - 특이 적 프로모터에 의해 구동 형질 전환 형광 단백질과 함께 ecdysteroidogenic 세포를 레이블을 사용할 수 있습니다. 또한, ecdysteroidogenic 기관의 신경 밀도는 특정 항체 또는 신경의 여러 유형에 GAL4 드라이버의 집합으로 분류 될 수있다. 따라서 ecdysteroidogenic 기관과 신경 세포의 연결은 면역 염색 및 형질 전환 기술에 의해 동시에 시각화 할 수 있습니다. 마지막으로, 우리는 누구의 증식과 유지 보수 ecdysteroids에 의해 제어되는 배아 줄기 세포를 시각화하는 방법에 대해 설명합니다. 이 방법은 스테로이드 호르몬 생합성과 신경 규제 메커니즘의 포괄적 인 이해에 기여한다.

우리는 steroidogenic 기관 및 D. melanogaster의 유충과 성인 여성에서의 대화 형 장기를 시각화하기 위해 위의 프로토콜을 사용했다. 프로토콜의 전체 구조는 그림 1과 같다. PG (도 2D), 뇌보다 더 작고 더 투명하고, 뇌 (도 2A 및 3A-C-E)의 전방 - 등쪽 측에 위치하고 포함 RG. PG 셀 라벨을 여러 그룹 ecdysteroidogenic 효소에 대한 항체의 다양한 형태를 생성 한 (즉, 버 랜드 (23), 측판 (20), 팬텀 25, 25 맞추기 및 26 그림자 Spookier <sup c...

우리는 해부, 고정, 스테로이드 호르몬 생합성과 규제 메커니즘을 연구하는 초파리 유충과 성인 여성의 steroidogenic 장기의 면역 염색을위한 프로토콜을 설명합니다. steroidogenic 기관뿐만 아니라, 우리는 배아 줄기 세포로 steroidogenic 기관의 신경 분포뿐만 아니라 steroidogenic 표적 세포를 시각화.

과일 플라이의 면역 염색과 Steroidogenic 기관 및 그들의 상호 작용하는 장기를 시각화하기위한 프로토콜<em&gt; 노랑 초파리</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

본 실험 절차의 전반적인 목표는 초파리(Drosophila melanogaster)의 유충 또는 성체 암컷에서 스테로이드 생성 기관과 그 상호작용 기관들을 시각화하는 것입니다. 이 방법은 곤충의 스테로이드 호르몬 생합성과 교미 및 변태의 기저에 있는 신경 조절 메커니즘을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 스테로이드 생성 기관의 신경 분포와 상호작용 기관의 상대적 부분이 온전하게 유지된다는 점입니다.일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 분들은 초파리 유충의 스테로이드 생성 기관이 매우 작고 투명하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 저와 저희 연구실에서 사용 중인 해부 프로토콜을 공유하게 되어 기쁩니다. 그럼, 시작하겠습니다.유충 준비가 완료되면, PBS가 채워진 3cm 디쉬에서 해부 현미경을 이용하여 본격적인 해부를 시작합니다. 먼저, 핀셋으로 입갈고리(mouth hook)를 잡습니다. 그런 다음, 마이크로 가위를 사용하여 전단부로부터 전체 길이의 약 3분의 1 지점에서 몸체를 절단합니다.다음으로, 한 쌍의 포셉으로 앞부분의 길이를 잡고 다른 한 쌍의 포셉을 사용하여 머리 끝부분을 몸통 쪽으로 조심스럽게 밀어 넣어, 최종적으로 유충의 몸통을 뒤집어 줍니다. 이러한 방식으로 10분 이내에 최대 20마리의 유충을 준비한 후, 고정액으로 옮깁니다. 30분 후에 준비물을 세척하고 면역염색을 진행합니다.먼저, 유충을 물에 약 1시간 동안 담가 두어 질식시켜 움직이지 못하게 합니다. 그런 다음, 실리콘 코팅 접시 위에 PBS 한 방울을 떨어뜨리고 유충의 등 쪽이 위를 향하도록 놓습니다. 등 쪽에는 두 개의 기관(tracheal tubes)이 있습니다.해부 현미경 하에서 핀셋을 사용하여 곤충 핀을 앞쪽 끝부분에 삽입합니다. 그다음, 몸통을 뒤쪽으로 늘린 후 두 번째 핀을 뒤쪽 끝부분에 꽂습니다. 이어서 마이크로 가위를 사용하여 꼬리 근처를 작게 절개합니다.절개 부위부터 큐티클 아래의 조직이 손상되지 않도록 주의하며, 머리 방향으로 등쪽 중앙선을 따라 등쪽 큐티클을 세로로 조심스럽게 절개합니다. 절개를 마친 후, 체벽을 양옆으로 벌려 모서리 부분에 곤충 핀으로 고정합니다. 그런 다음 핀셋을 사용하여 전방 지방체와 타액선을 제거하여 표면에 뇌-환상선 복합체가 드러나게 합니다.이제 PBS를 흡입하여 제거하고, 준비물을 고정액에 담급니다. 30분 후, 포셉을 사용하여 곤충 핀을 제거하고 준비물을 0.3% PBT가 채워진 마이크로튜브로 옮깁니다. 그런 다음, 면역염색을 진행합니다.유충의 면역염색 후, 일회용 피펫을 사용하여 샘플을 0.3% PBT가 채워진 접시에 옮깁니다. 해부 현미경 하에서 한 쌍의 포셉으로 큐티클이나 입 갈고리(mouth hook)를 잡습니다. 그런 다음, 1mL 주사기에 연결된 27게이지 바늘을 칼처럼 사용하여 식도의 앞쪽 끝부분과 안구 디스크(eye discs)를 잘라내어, 몸의 큐티클로부터 뇌-링샘-안구 디스크 복합체(brain-ring gland eye disc complex)를 제거합니다.다음으로, 핀셋을 사용하여 식도와 장을 뇌-환상선-눈 원반 복합체에서 조심스럽게 분리합니다. 식도가 복측 신경삭 위쪽의 뇌를 통과하므로, 장을 후측으로 당겨 뺍니다. 마지막으로, 뇌-환상선 복합체를 분리하기 위해 니들 나이프로 뇌 원반, 눈 원반 및 다리 원반 사이의 연결 부위를 조심스럽게 절단합니다.해부 과정 중에는 날카로운 가장자리를 가진 미세 핀셋을 사용하는 것이 매우 중요합니다. 핀셋의 끝부분에 틈이 없도록 숫돌 조각으로 갈아서 정교하게 맞추는 것을 강력히 권장합니다. 샘플을 옮길 때는 입구가 넓은 팁이 장착된 마이크로 피펫을 사용하십시오.샘플을 유리 슬라이드 중앙에 놓습니다. 그다음, 핀셋을 사용하여 샘플을 복측(ventral side)이 위로 오도록 배치하여 뇌의 배측(dorsal side)에 위치한 환상선(ring gland)을 촬영할 수 있게 합니다. 이어서 슬라이드를 기울여 과량의 PBT를 최대한 닦아냅니다.그 다음, 샘플 근처에 마운팅 시약 한 방울을 떨어뜨리고 핀셋을 사용하여 커버슬립을 시약 위로, 이어서 샘플 위로 천천히 내립니다. 성체 암컷의 난소를 해부하려면 이산화탄소 가스로 초파리를 마취하십시오. 그 후 머리를 절단하고 몸체를 PBS가 채워진 3 cm 접시에 옮깁니다.다음으로, 해부 현미경 하에서 핀셋으로 흉부의 등쪽을 잡고, 다른 핀셋으로 복부 마디 A-5 또는 A-6를 잡습니다. 그런 다음, 복부 큐티클을 후방 쪽으로 벗겨냅니다. 다음 단계로 넘어가기 전, 핀셋에 묻은 끈적거리는 큐티클을 닦아냅니다.다음으로, 수란관을 꼬집어 묶고 난소를 분리합니다. 그런 다음 핀셋을 사용하여 난소의 끝부분을 빗질하듯 풀어 넓게 폅니다. 넓게 펴진 난소를 고정액에 30분 동안 담가 염색 준비를 합니다.난소의 신경 지배를 유지하는 표본을 만들기 위해, 마취된 암컷 초파리를 PBS가 채워진 실리콘 코팅 접시에 옮깁니다. 해부 현미경 하에서 구강침을 잡고, 머리 큐티클을 벗겨 뇌를 노출시킵니다. 뇌에서 부착된 기관을 제거하며, 이때 뇌가 복부 신경삭과 연결된 상태를 유지하도록 합니다.그 다음, 흉부의 등쪽을 잡고 다리와 날개를 제거합니다. 이어서 각 다리의 기저부부터 시작하여 흉부의 배쪽 큐티클을 벗겨냅니다. VNC가 노출되면 핀셋을 사용하여 VNC에 붙어 있는 잔여 등쪽 큐티클과 근육을 매우 조심스럽게 제거합니다.뇌와 VNC 사이의 연결 부위가 손상되지 않도록 주의하십시오. 다음으로, 핀셋을 사용하여 복부 큐티클을 벗겨내어 난소와 그 주변 기관(지지 구조, 장, 난관, 자궁, 부속샘 포함)을 노출시킵니다. 마지막으로 기관과 지방체를 포함한 잔여 조직을 모두 제거하십시오.그 다음, 면역염색을 준비하기 위해 샘플을 고정액에 30분 동안 담급니다. 면역염색 후, 마이크로 파이펫을 사용하여 샘플을 0.1% PBT가 들어 있는 유리 슬라이드로 옮깁니다. 그런 다음, 현미경으로 슬라이드를 관찰하고 핀셋을 사용하여 난소관의 가닥들을 서로 분리합니다.이 과정 중에 난소 소관의 끝부분이 손상되지 않도록 주의하십시오. 이곳에는 생식낭이 포함되어 있습니다. 뇌-생식기관 복합체를 준비할 때, 남아 있는 큐티클을 모두 제거하고 구조물들이 슬라이드 위에 넓게 퍼지도록 하십시오.다음으로, 과도하게 도포된 PBT의 대부분을 닦아낸 후, 시료에 봉입제 한 방울을 떨어뜨립니다. 그다음 핀셋을 사용하여 커버 슬립을 슬라이드 위에 천천히 덮고, 슬라이드를 4°C의 암소에 보관합니다. 이후 현미경으로 시료를 관찰하여 스테로이드 생성 기관이 시야에 들어오게 합니다.시야가 고정되면, 이미징 시스템을 이미지 획득 모드로 전환합니다. 유충 단계 동안 전흉선은 anti-shroud 항체를 포함하여 엑디스테로이드 생성 효소에 대한 항체로 표지되었습니다. 전흉선과 뇌 사이의 신경 연결을 시각화하기 위해, 뇌-환상선 복합체를 해부하였습니다.필레 해부법은 세로토닌성 뉴런 그룹이 전흉선, 전위 및 인두 근육으로 투사되는 위장 신경계를 보여줍니다. 성체 암컷의 경우, 난소의 엑디스테로이드는 GSC 증식과 같은 난자 형성의 여러 측면에 영향을 미칩니다. GSC는 난소 내 각 난소 소관 끝의 생식관에 위치합니다.생식소(germarium) 내에서 GSC는 1B1 및 DE-cadherin의 두 가지 항체를 사용하여 특이적으로 표지되었습니다. 난소의 신경 분포를 시각화하기 위해 난소를 뇌, VNC, 장, prop, 자궁 및 수정낭과 함께 적출하였습니다. 뉴런은 n-Synaptobrevin GAL4 드라이버의 제어하에 있는 mCD8:GFP를 통해 시각화되었습니다.또한, 이중 접합 phalloidin을 사용하여 근육 구조를 염색하였습니다. 스테로이드 생성 기관의 해부는 처음에는 어렵게 느껴질 수 있으나, 본 영상을 통해 조직의 절단 지점을 익혀 기관의 손상 없이 더 쉽게 분리하는 방법을 배우시기 바랍니다. 본 프로토콜이 초보자뿐만 아니라 숙련된 연구자분들에게도 유용한 정보가 되기를 바랍니다.이 절차를 숙달한 후에는 귀하의 연구에 적용하고 필요에 맞게 수정하여 사용할 수 있습니다. 본 프로토콜이 스테로이드 호르몬 생합성에 대한 포괄적인 이해에 도움이 되기를 바랍니다. 더 자세한 단계별 프로토콜은 원고에서 확인하실 수 있습니다.확인해 주시기 바랍니다.

protocols-for-visualizing-steroidogenic-organs-their-interactive

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

틈새와 줄기 세포를 개발하는 동안 양식 얼마나 실용적인 의미가있는 중요한 질문이다.

해부 그리고 스테 이닝 Drosophila 애벌레 난소

의 유충과 pupae에 chordotonal 장기 immunostain하고 시각화하는...

의 Proprioceptors의 시각화<em&gt; Drosophila</em&gt; 애벌레와 Pupae

이 동영상은 생합성과 엑디스테로이드 및 기타 호르몬 분비에 중요한 복잡한 내분비 구조인 초파리 고리샘에 대해 설명합니다. 주요 프로토콜은 해부, 고정 및 면역 염색을 보여줍니다.

유충 고리 분비선 박리: 초파리에서 발달 내분비 기관의 분리

이 비디오는 돌연변이 초파리 뇌의 버섯체에서 표현형 결함을 시각화하기 위한 상세한 면역염색 프로토콜을 보여줍니다. 이 프로토콜은 버섯 몸체의 적절한 형태학적, 기능적 발달을 촉진하는 축삭 유도에 관여하는 단백질인 Fas2에 대한 항체를 사용하는 것입니다.

Immunostaining을 통한 초파리 뇌의 버섯체 뉴런 시각화

면역염색은 조직 내의 특정 세포 유형과 단백질을 시각화하는 효과적인 기술입니다. 초음파 처리를 활용함으로써, 여기에 설명된 프로토콜은 면역 염색 전에 후기 단계의 배아와 유충에서 Drosophila melanogaster 조직을 해부해야 할 필요성을 완화합니다. 우리는 포름알데히드가 고정된 전체 산 유충의 면역 염색을 위한 효율적인 방법론을 제공합니다.

늦게 단계 배아와 애벌레의 초음파 - 촉진 면역 형광 염색<em&gt; 초파리</em&gt; 조직<em&gt; 제자리에서</em

초파리의 성체 구조는 상상 원반이라고 하는 주머니와 같은 구조에서 파생됩니다. 이러한 디스크의 분석은 조직 결정, 구획 경계 설정, 세포 증식, 세포 운명 사양 및 평면 세포 극성을 포함한 많은 발달 과정에 대한 통찰력을 제공합니다. 이 프로토콜은 광/형광 현미경 검사를 위해 가상 디스크를 준비하는 데 사용됩니다.

해부하고, 상상 디스크의 면역 염색에서 초파리

이 프로토콜 설명 해 부와 성인 초파리 melanogaster 의 immunostaining 뇌 조직. 특히,이 프로토콜은 신경 개발의 많은 측면을 기본 일반적인 원리를 밝히기 위해 정확 하 게 사용할 수 있는 예제 신경 하위 집합으로 초파리 버섯 몸과 포토 리셉터 뉴런의 사용을 강조 표시 합니다.

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

Drosophila 난소 줄기 세포 틈새 시장 개발을 공부 하는 우수한 모델 시스템입니다. 애벌레와 성인 난소를 해 부 방법 출판 되었습니다 비록 번데기 난소 해 자세히 게시 되지 않은 다른 기술이 필요 합니다. 여기 우리는 해 부, 얼룩, 번데기 난소를 장착 한 프로토콜 개요.

해 부와 초파리 번데기 난소의 얼룩

우리는 여기에 공초점 현미경 검사법에 적합하고 재현 가능하고 신뢰할 수있는 라벨을 허용 Drosophila 고환의 전체 마운트 준비 및 면역 스테인링을위한 향상된 프로토콜을 제시합니다. 우리는 대형 S4-S5 정자 세포에 대한 공동 지역화 실험의 3D 표현 및 정량화에 의해이 프로토콜을 설명합니다.

대형 정자 세포의 3D 공초점 분석을 위한 전산 Drosophila 고환의 면역 염색

초기 초파리 배아에서는 많은 소기관이 운동성입니다. 원칙적으로, 그들은 특정 형광 프로브를 통해 실시간으로 이미징 될 수 있지만, 달걀 껍질은 배아에 직접 적용하는 것을 방지합니다. 이 프로토콜은 미세주입을 통해 이러한 프로브  를 도입한 다음 입자 이미지 속도측정법을 통해 벌크 소기관 움직임을 분석하는 방법을 설명합니다.

초파리 배아에서 지질 함유 소기관의 세포 골격 의존성 밀매 시각화

학습하세요 Drosophila melanogaster의 스테로이드 생성 기관 면역 염색법을 통해 곤충 스테로이드 호르몬 생합성과 신경 조절 메커니즘을 시각화하는 방법을 배우세요.

과일 플라이의 면역 염색과 Steroidogenic 기관 및 그들의 상호 작용하는 장기를 시각화하기위한 프로토콜

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