스펙트럼 유동 세포 계측법에 의해 고체 조직에서 분리 한 세포 현탁액의 분석

이 분광 세포 분석 기술의 전반적인 목표는 각 형광색소의 전체 방출 스펙트럼을 이용하여 서로 다른 형광색소를 구별하는 것입니다. 또한, 이 프로토콜은 자가형광을 독립적인 파라미터로 구현할 수 있게 하여, 고형 장기에서 분리한 세포를 적절하게 분석할 수 있도록 합니다. 이 방법은 희귀 세포군을 식별하는 방법과 같이 면역학 및 줄기세포 생물학 발달 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 수많은 파라미터를 동시에 분석하고 고체 조직의 자가형광을 관리할 수 있는 독특한 능력에 있습니다. 이 방법은 장과 심장에서 유래한 단일 세포 현탁액 조제에 사용되지만, 폐, 골격근, 간, 지방 및 신장과 같은 다른 장기에도 적용할 수 있습니다. 먼저, 성체 마우스에서 소장을 분리하여 세척하십시오.

그런 다음, 조직을 페이퍼 타월 위에 놓고 날카로운 가위를 사용하여 파이어판(Peyer's patches)을 조심스럽게 제거합니다. 장을 세로 방향으로 절개하여 열고 1 cm 크기의 조각으로 나눕니다. 그 후, 조직을 10% FCS가 보충된 30 mL의 HBSS가 담긴 비커로 옮기고, 37 °C에서 지속적으로 교반하며 30분 동안 배양합니다.

배양이 완료되면 세포 현탁액을 15 milliliter 플라스틱 튜브로 옮기고 5분 동안 강하게 볼텍싱합니다. 그런 다음, 해리되지 않은 큰 파편들이 가라앉을 수 있도록 현탁액을 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다. 이후 상층액을 새 튜브로 옮기고 세포를 120 ×g에서 7분 동안 원심 분리합니다.

세포를 펠렛으로 만든 후, 1% FCS가 포함된 HBSS 10mL에 세포를 부유시키고 Neubauer 챔버를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 세포 염색 전, 음성 대조군을 준비하기 위해 1x10⁶개의 장 세포를 5mL 튜브로 옮깁니다. 샘플을 준비하려면, 새로운 5mL 튜브에 1x10⁶개의 장 세포를 넣고 1% FCS가 포함된 HBSS 2mL를 추가한 다음, 4°C에서 120×g로 5분간 원심분리합니다.

상층액을 제거한 후, 50 µL의 항체 용액에 세포를 현탁합니다. 튜브를 알루미늄 호일로 감싸고 4 °C에서 20분 동안 세포를 배양합니다. 배양이 완료되면, 시료에 1% FCS가 포함된 HBSS 2 mL를 추가하고 4 °C에서 120 ×g로 5분 동안 원심분리합니다.

상층액을 버리고 펠릿을 0.5 µg/mL propidium iodide 용액 200 µL에 재현탁합니다. 마우스 배아의 머리를 제거한 후, 미리 적신 페이퍼 타월을 깐 페트리 접시에 1% FCS가 포함된 HBSS 50 mL를 채우고 배아의 몸통을 담급니다. 실체현미경 하에서 배아 흉부의 우측을 절개하고, 심장에 손상을 주지 않도록 주의하며 흉강을 조심스럽게 엽니다.

대혈관을 잡아 폐 및 흉선과 연결된 심장을 적출합니다. 1% FCS가 포함된 HBSS 2 mL가 채워진 35 mL 페트리 접시에 장기를 옮깁니다. 그 다음, 주변 장기 및 결합 조직으로부터 심장을 분리합니다.

심장을 세척한 후, 미리 데워둔 효소 용액 1 mL에 담그고, 실체 현미경 하에서 미세 핀셋과 메스를 사용하여 조직을 1 mm³ 크기의 조각으로 잘게 다집니다. 미리 데워둔 효소 용액 1 mL를 추가로 넣고, 분쇄된 조직을 뚜껑이 있는 5 mL 튜브로 옮깁니다. 샘플을 수평 상태로 37 °C에서 15분 동안 배양합니다.

배양이 완료되면 P1000 피펫으로 현탁액을 반복적으로 피펫팅하여 조직을 균질화합니다. 그 후, 소화되지 않은 조직 파편들이 가라앉을 때까지 샘플을 수직으로 세워 둡니다. 상층액을 50 milliliters 튜브로 옮깁니다.

HBSS에 포함된 10% FCS 2mL를 첨가하고 분리된 세포를 얼음 위에 보관하십시오. 다음으로, 소화되지 않은 조직 침전물이 담긴 5mL 튜브에 미리 데운 효소 용액 2mL를 첨가하고, 남은 조직이 관찰되지 않을 때까지 앞서 설명한 대로 조직 소화를 계속 진행하십시오. 얻어진 세포 현탁액을 120 ×g에서 10분 동안 원심분리하십시오.

그런 다음, 상층액을 제거하고 칼슘 및 마그네슘 양이온이 없는 HBSS 내 1% FCS 1 mL에 세포를 재현탁합니다. 심장 세포를 염색하려면, 세포 현탁액 200 µL를 라운드 바텀 96-well 플레이트의 웰로 옮깁니다. 플레이트를 480 ×g에서 1분 동안 원심 분리하고 상층액을 제거합니다.

다음으로, 심장 세포를 100 µL의 항체 용액에 재부유시킵니다. 플레이트를 알루미늄 호일로 감싸고 4 °C에서 20분 동안 배양합니다. 배양이 완료되면, calcium 및 magnesium free HBSS에 1% FCS가 포함된 용액 200 µL로 심장 세포를 세척하고, 현탁액을 480 ×g에서 1분 동안 원심분리합니다.

그 다음, 칼슘과 마그네슘 이온이 없는 HBSS 내의 1% FCS 200 µL로 세포를 재부유시키고, 이 현탁액을 칼슘과 마그네슘이 없는 HBSS 내의 1% FCS 200 µL가 미리 채워진 5 mL 튜브로 옮깁니다. 마지막으로, 0.5 µg/mL propidium iodide를 포함하는 칼슘 및 마그네슘 양이온이 없는 HBSS 내의 1% FCS 400 µL를 추가하고, 세포 현탁액을 70 µm 나일론 메쉬로 여과합니다. 세포를 시각화하려면 염색된 샘플을 유세포 분석기에 로드하고 preview를 클릭한 다음, acquire를 클릭하여 샘플에서 최대 2×10⁶ 개의 이벤트를 기록합니다.

분석 탭에서 색상 팔레트 창을 열고, 각 파라미터에 해당하는 형광색소와 마커를 추가하여 연구 대상인 모든 파라미터를 등록하십시오. 이때 자가형광 및 생존율 파라미터가 반드시 포함되어야 합니다. 컨트롤 창의 튜브 목록에서 보정 비드를 포함하는 첫 번째 단일 염색 샘플을 분석하십시오.

그런 다음, 워크시트에서 다각형 디자인 도구를 클릭하고 FSC SSC 플롯에서 비드 집단을 게이팅합니다. 게이트를 더블 클릭하여 게이팅된 비드의 자식 플롯을 생성합니다. 그 후 양성 비드와 음성 비드를 각각 별도로 게이팅합니다.

각 양성 및 음성 분획에서 순차적인 게이팅과 이상치 제거를 통해 선택된 딸세포 집단을 검증하십시오. 그런 다음, 언믹싱(un-mixing) 창에 음성 및 양성 게이트를 업로드하십시오. 다음으로, 튜브 목록에서 염색되지 않은 세포 샘플을 선택하고 자가형광 세포와 비자가형광 세포를 구분하는 별도의 게이트를 설계하십시오.

자가형광 및 생존능을 포함한 모든 파라미터에 대해 음성 및 양성 게이트가 정의되면 계산(calculate)을 클릭합니다. 그런 다음, 분석된 샘플에 언믹싱(un-mixing)을 적용합니다. 데이터를 분석하려면 SSC 대 FSC 플롯에서 세포를 게이팅하고 propidium iodide가 염색된 사멸 세포를 제외합니다.

마지막으로, 모든 관심 세포 집단에 대한 게이트를 설정합니다. 여기 제시된 결과는 태아 심장에서 분리하여 anti-TER119, anti-CD45 및 anti-Sca-1 항체로 염색한 세포를 유세포 분석 및 스펙트럴 분석법으로 분석한 결과입니다. 두 대의 일반 유세포 분석기에서는 자가형광 세포의 하위 집단이 검출되었으나, 스펙트럴 분석에서는 이 세포들이 자가형광 세포로 정의되지 않고 CD45 TER119 음성 집단에 포함되었습니다.

일반적인 유세포 분석법으로는 자가형광을 띠지만 CD31 양성 세포는 아닌 것으로 확인된 세포들을 대상으로 심근세포 특이적 전사체의 발현을 분석하였습니다. 자가형광 세포군에서 높은 수준의 cardiac troponin 및 심방 심근세포 유사 전사체가 발견되었으며, 이를 통해 일반적인 유세포 분석법에서는 상당수의 심근세포가 누락된다는 점이 확인되었습니다. 이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 약 8시간 이내에 완료할 수 있습니다.

이 실험 절차를 수행할 때는 세포의 생존력을 보장하기 위해 모든 단계를 얼음 위에서 신속하게 진행해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에 세포 내 단백질 및 추가적인 표면 마커 분석을 수행하여 특정 분자 경로에 관한 의문에 답할 수 있습니다. 이 기술은 면역학 및 발생학 또는 줄기세포 생물학 분야의 연구자들이 다양한 장기에서 희귀 세포군을 탐색하고 분리할 수 있는 길을 열어주었습니다.

이 영상을 시청한 후, 세포 조직에서 세포를 분리 및 염색하는 방법과 세포 자가형광으로 인한 한계를 극복하는 스펙트럼 유세포 분석법을 통해 표면 마커 발현을 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 프로피듐 아이오다이드(propidium iodide)를 사용하는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안 항상 개인 보호 장구(PPE) 착용과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.