스펙트럼 유동 세포 계측법에 의해 고체 조직에서 분리 한 세포 현탁액의 분석

이 스펙트럼 세포 분석 기술의 전반적인 목표는 전체 방출 스펙트럼을 사용하여 다양한 형광 색소를 구별하는 것입니다. 또한 이 프로토콜을 통해 자가형광을 독립적인 매개변수로 구현할 수 있으므로 고형 장기에서 분리된 세포를 적절하게 분석할 수 있습니다. 이 방법은 희귀 세포 집단을 식별하는 방법과 같은 줄기 세포 생물학의 면역학 및 개발 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 많은 수의 매개변수를 동시에 분석하고 고형 조직의 자가형광을 관리할 수 있는 고유한 능력입니다. 이 방법은 장과 심장에서 유래한 단세포 현탁액을 준비하는 데 사용되지만 폐, 골격, 근육, 간, 지방 및 신장과 같은 다른 장기에도 적용할 수 있습니다. 시작하려면 성인 쥐에서 소장을 분리하고 씻으십시오.

그런 다음 종이 타월에 티슈를 놓고 날카로운 가위를 사용하여 Peyer의 패치를 조심스럽게 제거합니다. 장을 세로로 잘라 열고 1cm 조각으로 나눕니다. 그런 다음 10% FCS가 보충된 HBSS 30ml로 채워진 비커에 조직을 옮기고 섭씨 37도에서 30분 동안 계속 저어주면서 배양합니다.

배양이 완료되면 세포 현탁액을 15ml 플라스틱 튜브로 옮기고 5분 동안 격렬하게 와류를 일으킵니다. 그런 다음 얼음 위에서 10분 동안 현탁액을 배양하여 해리되지 않은 큰 조각이 침전될 수 있도록 합니다. 그 후, 상등액을 새 튜브로 옮기고 7분 동안 120배 G로 세포를 회전시킵니다.

펠릿화되면 HBSS에서 1% FCS 10밀리리터에 세포를 현탁시키고 Neubauer 챔버를 사용하여 세포를 계수합니다. 세포를 염색하기 전에 10배에서 6번째 장 세포를 5ml 튜브로 옮겨 음성 대조군을 준비합니다. 샘플을 준비하려면 장 세포의 6분의 1에 10을 1회 첨가한 다음 새 5ml 튜브에 1% FCS가 함유된 HBSS 2ml를 첨가하고 현탁액을 섭씨 4도에서 120배 G로 5분 동안 원심분리합니다.

상등액을 버린 후, 우리는 항체 용액의 50 마이크로 리터에 세포를 현탁시킵니다. 튜브 알루미늄 호일을 감싸고 섭씨 4도에서 20분 동안 세포를 배양합니다. 배양이 완료되면 HBSS의 1% FCS 2ml를 샘플에 첨가하고 120배 G, 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리합니다.

상등액을 버리고 펠릿을 밀리리터당 0.5마이크로그램 프로피듐 요오드화물 용액 200마이크로리터에 재현탁합니다. 쥐 배아의 목을 베인 후, 미리 적신 종이 타월을 깔고 HBSS에서 1% FCS 50ml를 채운 페트리 접시에 시체를 담급니다. 실체현미경으로 배아의 가슴 오른쪽을 절개하고 심장이 손상되지 않도록 조심스럽게 흉부를 엽니다.

큰 혈관을 잡고 폐와 흉선에 연결된 심장을 뽑아내십시오. HBSS에서 2밀리리터의 1% FCS로 채워진 35밀리리터 페트리 접시에 장기를 옮깁니다. 그런 다음 심장을 주변 장기 및 결합 조직과 분리한다.

심장을 씻은 후 미리 데워진 효소 용액 1ml에 심장을 담그고 가는 집게와 메스를 사용하여 실체 현미경으로 장기를 1입방 밀리미터 조각으로 다집니다. 예열된 효소 용액 1ml를 추가로 첨가하고 단편화된 조직을 뚜껑이 있는 5ml 튜브로 옮깁니다. 샘플을 섭씨 37도의 수평 위치에서 15분 동안 배양합니다.

배양이 완료되면 P1000 피펫으로 현탁액을 반복적으로 피펫팅하여 조직을 균질화합니다. 그런 다음 소화되지 않은 조직 조각이 침전될 때까지 샘플을 수직으로 놓으십시오. 상등액을 50ml 튜브로 옮깁니다.

HBSS에 2밀리리터의 10% FCS를 첨가하고 분리된 세포를 얼음 위에 유지합니다. 다음으로, 소화되지 않은 조직 침전물이 들어 있는 5밀리리터 튜브에 예열된 효소 용액 2밀리리터를 넣고 남아 있는 조직이 관찰되지 않을 때까지 앞서 표시된 것처럼 조직을 계속 소화합니다. 얻어진 세포 현탁액을 120배 G에서 10분 동안 원심분리한다.

그런 다음 상층액을 버리고 칼슘과 마그네슘 양이온이 없는 HBSS에서 1% FCS 1밀리리터로 세포를 재현탁합니다. 심장 세포를 염색하려면 200마이크로리터의 세포 현탁액을 둥근 바닥 96웰 플레이트의 웰로 옮깁니다. 플레이트를 480배 G에서 1분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.

다음으로, 100 마이크로리터의 항체 용액에 심장 세포를 재현탁시킵니다. 접시를 알루미늄 호일로 싸서 섭씨 4도에서 20분 동안 배양합니다. 배양이 완료되면 칼슘 및 마그네슘이 없는 HBSS가 함유된 1% FCS 200마이크로리터로 심장 세포를 세척하고 480배 G에서 1분 동안 현탁액을 원심분리합니다.

그런 다음 칼슘 및 마그네슘 이온이 없는 HBSS의 1% FCS 200마이크로리터에 세포를 재현탁하고 칼슘 및 마그네슘이 없는 HBSS의 1% FCS 200마이크로리터로 미리 채워진 5밀리리터 튜브로 현탁액을 옮깁니다. 마지막으로, 칼슘 및 마그네슘 양이온이 없는 HBSS에 1% FCS 400마이크로리터를 첨가하고 밀리리터 프로피듐 요오드화물을 함유하고 70마이크로 나일론 메쉬를 통해 세포 현탁액을 여과합니다. 세포를 시각화하려면 염색된 샘플을 유세포 분석법에 로드하고 preview를 클릭한 다음 acquire를 클릭하여 샘플의 10번째부터 6번째 이벤트까지 최대 2배까지 기록합니다.

Analysis 탭에서 컬러 팔레트 창을 열고 해당 마커와 함께 형광 색소를 추가하여 연구된 모든 매개변수를 등록합니다. 자가형광 및 생존력 매개변수를 포함해야 합니다. control window의 tube list 내에서 compensation beads가 포함된 첫 번째 단일 염색 샘플을 분석합니다.

그런 다음 워크시트에서 polygon design 도구를 클릭하고 FSC SSC 플롯에서 비드 모집단을 게이트합니다. 게이트를 두 번 클릭하여 게이트 비드의 딸 플롯을 만듭니다. 그런 다음 양극과 음극 비드를 별도로 게이트합니다.

각 양수 및 음수 분수에서 이상치를 연속적으로 게이팅하고 제거하여 선택한 딸 모집단을 확인합니다. 그런 다음 un-mixing 창에 음극 및 양수 게이트를 업로드합니다. 다음으로, 튜브 목록에서 염색되지 않은 세포 샘플을 선택하고 자가형광 및 비자가형광 세포를 위한 별도의 게이트를 설계합니다.

자가형광 및 생존력을 포함한 모든 매개변수에 대해 negative 및 positive gate가 정의되면 calculate를 클릭합니다. 그런 다음 분석된 샘플에 불혼합을 적용합니다. 데이터를 분석하기 위해 SSC 대 FSC 플롯에서 세포를 게이트하고 프로피듐 요오드화물로 염색된 죽은 세포를 제외합니다.

마지막으로, 관심 있는 모든 모집단에 대한 게이트를 결정합니다. 다음은 태아 심장에서 분리되고 anti-TER119, anti-CD45 및 anti-Sca-1 항체로 염색된 세포의 유세포 분석 및 스펙트럼 세포 분석 결과입니다. 자가형광 세포의 하위 집합은 두 개의 기존 세포분석기에 의해 검출된 반면, 스펙트럼 세포분석에서 이러한 세포는 자가형광으로 정의되지 않았으며 CD45 TER119 음성 집단으로 구성되었습니다.

기존의 유세포 분석법으로 CD31 양성 세포가 아닌 자가형광 세포로 확인된 세포를 심근세포에 특이적인 전사체의 발현에 대해 분석했습니다. 자가형광 세포 집단에서 높은 수준의 심장 트로포닌 및 기차 전사체와 같은 심방 근세포가 발견되었으며, 이는 기존 유세포 분석에서 심근세포의 많은 하위 집합이 누락되었음을 확인했습니다. 일단 숙달되면 이 기술은 제대로 준비된다면 약 8시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 세포가 생존할 수 있도록 모든 단계를 얼음 위와 적시에 장원에서 수행해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이러한 절차에 따라 세포 내 단백질 및 추가 표면 마커 분석을 수행하여 특정 분자 경로에 관한 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술은 면역학 및 발달 또는 줄기 세포 생물학 분야의 연구자들이 다른 장기에서 희귀 집단을 탐색하고 분리할 수 있는 길을 열었습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 세포 조직에서 세포를 분리하고 염색하는 방법과 세포 자가형광으로 인한 한계를 극복하는 스펙트럼 유세포 분석으로 표면 마커 발현을 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 요오드화프로피듐으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 PPE 사용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.