Name: 스펙트럼 유동 세포 계측법에 의해 고체 조직에서 분리 한 세포 현탁액의 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: 배우세요 고체 조직에서 분리한 세포 현탁액을 스펙트럼 유동 세포 계측법으로 분석하는 방법입니다. 자가형광을 독립 변수로 처리하여 희귀 세포 집단을 정확히 식별할 수 있습니다.

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우리는 또한 비판적으로 원고를 수정 K. 타무라의 스펙트럼 세포 계측법의 기술적, 이론적 기여를 인정합니다. 우리는 C. AIT-만수르, P.-H.에도 빚 비판적 원고를 읽기위한 끝없는 기술 자문 및 지원을위한 Commere, A. Bandeira, 그리고 P. 페레이라. 우리는 또한 안티 Vγ7-APC와 Vδ4 - 비오틴 표지 항체의 선물 P 페레이라합니다. 우리는 환영하고 촬영 물류를 지원하는 파스퇴르 연구소 센터 디부 Enseignements을 aknowledge. 이 작품은 파스퇴르 연구소, 연구소 국립 드 라 상테 등 드 라 공들인 MEDICALE (INSERM)에 의해 지원되었다; 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation)과 파스퇴르 증권 거래소 루 (SS); Fundação 파라 Ciência의 개 TECNOLOGIA - SFRH / BD / 2,010분의 74,218 (MV); 및 대학 파리 디드로의 회사 직원 국립 드 라 공들인 (ANR) 프로젝트 Twothyme의 ANR 및 프로그램은 (미래를위한 투자를 REVIVE) (AC).

모든 실험은 파스퇴르 연구소 윤리 헌장과 유럽 연합 (EU) 지침에 따라 수행되었고, 프랑스 농업 장관에 의해 승인되었다. 성인 마우스 기관에서 1. 세포 현탁액을 준비 <ol><li> 비장 세포의 분리 <ol><li> 자궁 전위에 의해 성인 쥐를 안락사. 복부 정중선에서 절개를하고 가위로 피부를 엽니 다. 집게로 비장을 수확. </li><li> 2 유리 현미경의 비장 세포를 해리하고 1 % 소 태아 혈청을 함유하는 행크의 균형 소금 용액 5 ㎖ (HBSS) (FCS)에이를 희석 슬라이드 크러시. </li><li> 120 XG에서 10 분, 39 ° C 원심 분리기. 상층 액을 버린다. </li><li> HBSS 1 % FCS 5ml에 펠렛을 재현 탁. 트리 판 블루 중요한 얼룩을 사용하여 노이 바 우어 챔버와 세포를 계산합니다. 참고 : 80,000,000 세포는 성인의 비장에서 얻을 수 있습니다. </li></ol></li><li> Isolati세포에 소장에서 <ol><li> 자궁 전위에 의해 성인 쥐를 안락사. 가위를 사용하여 복부 중간 선에 피부 절개를합니다. 한 손에 집게로 소장을 잡고 양쪽 끝을 잘라 가위를 사용 : 바로 대장 전에, 바로 위 후 다음 소장의 끝에서 첫째. 바늘 2 mL를 주사기를 사용하여 1X 둘 베코 인산염 완충 염수 (DPBS)를 소장 플러시. </li><li> 종이 타월에 소장을두고 신중하게 날카로운 가위로 페 이어의 패치를 제거합니다. </li><li> 장 내부의 가위의 한 지점을 삽입하여 긴 측면에 장을 엽니 다 가위를 사용합니다. 예리한 가위를 사용하여 1 cm 조각으로 개방 된 부위를 잘라. </li><li> 10 % FCS와 HBSS 30 ㎖ 일정 교반하에 37 ℃에서 30 분 동안 인큐베이션. </li><li> 50 mL의 나머지 비 - 해리 된 단편과 세포 현탁액을 놓고플라스틱 튜브, 고속에서 5 분 동안 소용돌이. 참고 : 조직의 더 해리가 없습니다. </li><li> 대형, 비 - 해리 된 단편 펠렛 있도록 얼음 위에서 10 분 동안 인큐베이션. </li><li> 상청액을 수집하여 120 × g으로 7 분 동안 원심 분리하여 농축시켰다. </li><li> 상층 액을 제거하고 1 %의 FCS와 HBSS 10ml에 펠렛을 재현 탁. 트리 판 블루 중요한 얼룩을 사용하여 노이 바 우어 챔버와 세포를 계산합니다. 참고 : ~ 6000 만 내 상피 세포 (IELs은) 성인 소장에서 얻을 수 있습니다. </li></ol></li><li> 패널 설계 전략 <ol><li> 직접 형광 색소와 결합 항체 패널을 준비한다. 주 : 모든 항체 이전 세포 집단의 최적 정의를 획득하기 위해 적정된다 (적정 항체가 배치에 따라 달라질 수 있음). 비장 세포를 염색 19 컬러 패널에 사용되는 항체는 표 1에 나열되어있다. </li><li> 멀티 콜로 구축세포 계측법에 대한 R 패널. 이 어려운 작업이 될 수 있듯이, 패널을 최적화하기 위해 다음 지침을 따르십시오 <ol><li> 스펙트럼 구성 및 기기에 사용할 수있는 형광 염료를 확인합니다. </li><li> 제조업체가 제공하는 밝기 색인 / 염색 색인 정보를 사용합니다. 참고 : 밝기 색인 / 염색 지수는 각각 형광 색소 배경 대 형광 강도의 상대적 지표입니다. </li><li> 아래의 규칙에 따라 항체를 선택 : <ol><li> 약하게 발현되는 단백질 밝은 형광 색소 등 고도로 발현 된 단백질에 대한 가장 어두운 형광 색소를 선택. 참고 : 예를 들어, CD45, CD4 및 CD8가 높은 표현하고 희미한 형광 색소와 함께 사용할 수 있습니다. </li><li> 먼저 적은 형광 염료의 가능성과 항체를 선택하여 패널을 설계 시작합니다. </li><li> 가능하면, 발광 스펙트럼의 F의 작은 오버랩 형광 염료를 선택마커 또는 동일한 세포 유형에서 발현. 주 : 빛의 노출에 의한 분해에 더 취약으로 탠덤 (예를 들어, PE-Cy5에, PE-Cy7과를 PerCP-Cy5.5)는,주의해서 사용해야합니다. </li></ol></li></ol></li></ol></li><li> 세포 계측법 분석을위한 세포의 염색 <ol><li> 음성 대조군으로 사용하기 위해 염색 그들을 유지 1 × 106 비장 세포를 1 × 106 세포 및 장 한 5 ㎖ 튜브 한 5 ㎖ 튜브를 준비한다. </li><li> 준비하고, 표 1에있어서 시료 당 패널 당 5 ㎖ 튜브 라벨. HBSS 1 % FCS에, 표 1에있어서, 항체의 혼합물을 준비한다. </li><li> 전송 1 × 106 세포 - 하나 또는 비장 장 세포 - 각 5 ㎖ 튜브에. 39 ° C에서 5 분, 120 × g으로 2 ㎖의 HBSS의 1 % FCS 및 원심 분리기를 추가한다. 상층 액을 제거하고, 항체의 혼합물 50 μL에 펠렛을 재현 탁. </li><li> 의 S 레이블2 단계 plenocytes. 먼저, 5 ㎖ 튜브에 PE-시아닌 5를 PerCP-시아닌 5.5를 PerCP 및 표지 항체를 함유하는 혼합물을 50 μL (Fc 수용체 차단으로)를 사용한다. 4 ℃에서 어둠 속에서 20 분 동안 배양 한 후, 5 ㎖ 튜브에 다른 모든 항체를 함유하는 혼합물의 50 μL를 추가한다. 참고 :이 전략은 입체 장애를 제한합니다. </li><li> 4 ℃에서 어둠 속에서 20 분 동안 인큐베이션. </li><li> 39 ° C에서 5 분, 120 × g으로 2 ㎖의 HBSS의 1 % FCS 및 원심 분리기를 추가한다. 상층 액을 제거하고, 0.5 ㎍ / ㎖의 프로피 디움 요오다 이드 (PI)를 HBSS 1 % FCS 200 μL에 펠렛을 재현 탁. </li></ol></li></ol> (예 UltraComp eBeads) 상용 보상 비드 마이크로 스피어 각 형광 색소에 대한 단일 염색 2. 제조는 이하 비드라고도 <ol><li> 준비하고 패널에 사용되는 항체의 수만큼 5 개 ㎖ 튜브 라벨. 각 튜브에 구슬 1 방울을 넣고 1 &amp; # 추가(181), 튜브 당 항체 L. 참고 : 여기에 사용 된 비즈 (재료의 표 참조) (긍정적) 및 염색 (음) 구슬 스테인드 들어 있습니다. 항체는 각 염료에 대해 이렇게 명확한 스펙트럼 서명을 밝은 신호를 보장하기 위해 구슬을 초과 넣고있다. 이것은 정확한 unmixing을 할 수 있도록 소프트웨어가 필요합니다. </li><li> 4 ℃에서 어둠 속에서 20 분 동안 인큐베이션. </li><li> g (X) (120)에서 5 분 동안 HBSS 1 % FCS 및 원심 2 mL를 넣고. 상층 액을 제거하고 HBSS 1 % FCS 100 μL에 펠렛을 재현 탁. </li></ol> 배아 마우스 마음 3. 세포 현탁액을 준비 <ol><li> 배아의 해부 <ol><li> (17 및 19 시간 사이)의 날 끝 (항상 남성의 장에) 한 수컷과 암컷을 교배 2에 의해 미리 타이밍 된 임신 여성을 수득 할 계획이다. 다음날 아침은 질 플러그 여성은 후 교미 0.5 일 것으로 판단된다. </li><li> E17.5 임신 femal를 안락사자궁 경관 탈구로 말야. 마우스 발을 단단히 눌러 동물이 반응하지 않는지 확인하십시오 (발가락 핀치 반사). 복부를 70 % 에탄올로 적셔 살균하고 마우스 모피의 퍼짐을 예방하십시오. </li><li> 가위로 복부의 중앙에있는 피부를 절개하고 손가락으로 피부를 당겨냅니다. </li><li> 복부 근육을 끌어 당기고 복부 근육을 중앙에서 복부의 양쪽면으로 절개하여 전체 복부와 가위를 사용하여 복강을 엽니 다. 참고 : 복막 근육 바로 아래에있는 소장을 손상시키지 않도록주의하십시오. </li><li> 자궁 뼈와 자궁의 수준에서 절단하여 자궁 뿔 (배아)을 수집하십시오. DPBS 50 ML와 90 X 15 밀리미터 2 페트리 접시에 그들을 담그십시오. </li><li> 각 decidua 사이에 절단하여 각 배아를 분리, 자궁 근육 벽과 미세한 집게와 가위와 함께 내장 난황낭. 배아 int 가져 오기행위. 마지막으로, 탯줄을 잘라. </li><li> 해부를 시작하기 전에 가위 (참수)와 E17.5 배아의 머리를 잘라. </li></ol></li><li> 마음의 컬렉션 <ol><li> 젖은 종이 타월 접시 바닥 침구 1 % FCS와 HBSS 50 ㎖를 함유하는 90 X 15mm 2 페트리 접시에 배아를 참수 담근다. </li><li> 복부 측이 위로 오도록 실체 현미경 하에서 총 집게 각 배아를 잡아. </li><li> 조심스럽게 심장의 손상을 방지하기 위해 가위로 가슴의 오른쪽을 절단하여 흉부 그리드를 엽니 다. </li><li> 총 집게로 흉곽을 잡고 마음을 노출. </li><li> (IN-의 밖으로 흐름 마음의 큰 혈관을 포함하는) 큰 혈관을 잡고 (여전히 폐와 흉선 조립) 마음을 떨어져 당겨 HBSS 2 mL의 35 X 15mm 2 페트리 접시에 배치 FCS와 1 %. </li><li> 주변 기관에서 마음을 분리하고미세 집게와 메스와 결합 조직. </li><li> HBSS 1 % FCS의 2 mL를 새로운 35 X 15mm 페트리 접시에 마음을 씻고 마음이 챔버 내부의 혈액을 펌프 할 수 있도록 20 분 동안 얼음에 보관하십시오. </li></ol></li><li> 심장 세포 현탁액의 준비 <ol><li> 37 ° C로 HBSS + / + (이하 효소 용액이라고 함)에 200 ㎍ / ㎖의 콜라게나 제를 미리 가온. 주 : HBSS에서 콜라게나 희석 + / + 효소 활성을 최대화하기 위해 (칼슘 및 마그네슘 양이온 2+)와; 콜라게나 제 활성은 일괄 사이 안정적이다. </li><li> 예열 효소 용액 1 ㎖와 하트 (HBSS 1 % FCS)를 담글 세정액을 교체. </li><li> 실체 현미경 하에서 1 mm으로 미세 겸자 메스를 사용하여 3 개 마음 말하다. 예열 된 효소 용액의 또 다른 1 mL를 첨가하고, 뚜껑을 5 ㎖ 튜브에 다진 조직 옮긴다. 참고 : 최적의 소화를 들어, 배치효소 용액 2 mL의 5 개 E17.5 하트 최대. 더 하트 동시에 분해되는 경우, 다른 5 개 ㎖ 튜브로 분할. </li><li> 37 ° C에서 15 분 동안 인큐베이션 다진 하트. 주 : 용액 따라 조직을 확산 인큐베이터에 5 개 ㎖ 튜브 (제대로 닫혀)에 누워. <ol><li> 인큐베이션의 끝에, P1000 피펫 아래로 약 20 배를 피펫 팅에 의해 동일한 효소 용액 조직을 균질화. 나머지 조직 단편 침전물 (약 3 분)의 수직 위치에 5 ㎖ 튜브를 넣고하자. </li><li> , 50 ㎖의 튜브 (현탁액에서 소화 세포를 포함) 상층 액을 모아서 추가 2를 계속하면서, 10 % FCS (효소 용액의 부피와 동일한 부피의 조직 단편을 첨가) 및 얼음에 그들을 유지 HBSS ㎖의 소화 과정. 참고 : HBSS 10 % FCS 솔루션과 얼음이 남아있는 조직이있는 동안 효소 작용을 비활성하는 것이 중요합니다소화. </li><li> 나머지 조직 절편을 가진 5 ㎖ 튜브에 미리 가온 된 효소 용액 2 ㎖를 첨가하고 조직이 더 이상 관찰되지 않을 때까지 단계 3.3.4을 반복하여 분해를 계속한다. 참고 : 소화의 약 4 사이클이 완전히 심장 조직 (효소 용액 2 mL를 5 E17.5 마음을) 해리하기에 충분하다. </li></ol></li><li> 300 XG에서 10 분 동안 현탁 세포와 함께 50 mL의 튜브를 원심 분리 상층 액을 제거한다. </li><li> 상기 세포 펠렛을 재현 탁 HBSS 1 mL의 추가 - / - 1 % FCS를하고, 70 ㎛의 나일론 메쉬 비록 세포 현탁액을 필터. 트리 판 블루 중요한 얼룩을 사용하여 노이 바 우어 챔버와 세포를 계산합니다. 주 : - / - (칼슘 및 마그네슘 양이온 2+)없이 최소화 세포 응집 HBSS로 세포를 재현 탁. 80 사이에 1,000,000 세포는 하나의 E17.5 마음에서 얻을 수 있습니다. </li></ol></li><li> 형광 항체 심장 세포 염색 참고 : 모든 antibodIES는 이전 세포 집단 (적정 항체가 배치와 다를 수 있음)를 중심 패널에 사용 국지적 항체가 표 1에 나와있는 최적의 정의를 획득하기 위해 적정한다. <ol><li> 96 웰 플레이트 (환저)를 통해 현탁액의 심장 세포를 분산. 필요한 모든 웰 (웰 당 200 μL)에 걸쳐 균등하게 분배 짧은 스핀 원심 480 XG에서 1 분 동안 96 웰 플레이트, 상청액을 버린다. 참고 : 96 웰 플레이트 (둥근 바닥)의 모든 웰을 사용할 수있다. </li><li> 펠렛을 재현 탁하고 항체 칵테일 100 μL (즉, CD45-PE, TER119-PE, CD31-알렉사 647 및 무서 -1- PE-Cyanine5 4 ℃에서 어둠 속에서 20 분 동안 심장 세포를 배양 )에 희석 HBSS - / - 1 % FCS. </li><li> HBSS 200 μL를 첨가하여 과량의 항체로부터 심근 세포를 워시 - / - 1 % FCS 및 480 × g으로 1 분간 원심 분리하여 세포를 짧은 스핀. </li><li> 뜨는 반복 폐기짧은 스핀 원심 분리 (단계 3.4.3). </li><li> - / - HBSS 200 μL에 재현 탁 세포를 1 % FCS 및 이미 HBSS 200 μL 함유하는 5 ㎖ 튜브로 전송 - / - 1 % FCS를. </li><li> 0.5 ㎍ / mL로 된 PI로 1 % FCS 및 70 ㎛의 나일론 메쉬 비록 세포 현탁액을 필터 - / - 취득 전에 HBSS 400 μL를 추가한다. </li></ol></li></ol> 스펙트럼 흐름 사이토와 레이블 비장, 창자, 심장 세포의 4. 취득 <ol><li> 데이터의 수집하기 전에 자동으로 제조업체의 지침에 따라 사이토 스펙트럼을 교정. 실험의 매일 매일 월간 품질 관리 절차를 수행합니다. </li><li> 세포 계수기가 준비되면, 모든 항체로 표시된 세포 현탁액을 포함하는 샘플의 미리보기를 시작합니다. 참고 : 취득하지 마십시오. </li><li> 모든 레이저는 필요에 있는지 확인하십시오. 모든 셀 각각에 표시되도록 상기 FSC 게인을 조정플롯. 게이트 세포군 및 488 nm의 상기 405분의 638 nm의 레이저에 대응하는 두 개의 스펙트럼 플롯이 게이트를 적용한다. 주 : 형광 색소는 638 nm의 레이저에 의해 여기되는 경우 (638 nm의 레이저에있을 때, 즉,), 보호막이 PMT에 빛나는에서 638 nm의 레이저를 방지 617-662 nm의 빛을 마스크가있다. 이 스펙트럼의 부분의 손실을 유발하므로 이러한 발광 파장에 가까운 염료의 하부 분리시킨다. 그러나, 전체 신호가 획득을 위해 필요하지 않은 경우, 638 nm의 레이저를 전환하여 회수 할 수있다. </li><li> 모든 형광 색소는 488 nm 내지 638분의 405를 표시하는 두 개의 다른 스펙트럼 플롯에서 y- 축 (1-10 6)에 표시되는 휘도의 범위 내에 있는지 (PMT) 전압 (%) 예 32 채널 사진 배율을 조정 나노 기진. 참고 : 교육은 사용 된 모든 형광 색소의 스펙트럼을 인식해야합니다. </li><li> 샘플을 획득하기 시작합니다. 클릭 &quot;; 미리보기 &quot;화면에 세포를 시각화하고 다음을 클릭합니다&quot;샘플을 기록하는 &quot;취득 각각의 샘플에서 2 × 10 6 이벤트까지 저장합니다.. </li><li> 스테인드 샘플을 획득 한 후, 다음 생체 염료 개별적으로 사용 된 모든 항체로 염색 보상 비드 물들 샘플을 획득. 화면의 세포를 시각화하기 위해 &quot;미리보기&quot;를 클릭 한 후 &quot;획득&quot;에 샘플을 기록 할 수 있습니다. 참고 : 모든 샘플 및 컨트롤 (즉, 구슬과 염색 샘플)에 대해 동일한 PMT 전압을 유지; 5000 이벤트는 크게 충분하다. </li><li> 마지막으로, 흠없는 세포 현탁액의 데이터를 취득. 화면의 세포를 시각화하기 위해 &quot;미리보기&quot;를 클릭 한 후 &quot;획득&quot;에 샘플을 기록 할 수 있습니다. 참고 : 실험의 끝에서 흠없는 샘플을 획득 형광 세포의 이월을 최소화한다. </li><li> 제조업체의 지침 다음 사이토를 청소포착 폴더에서 실험을 닫을 거라고. 참고 : 실험을 닫은 후 그것을 저장하고 분석 할 수. </li></ol> 스펙트럼 FCM 소프트웨어와 데이터의 5 분석 <ol><li> 은 &quot;분석&quot;탭의 &quot;색상 표&quot;창에서 사용 된 각 형광 색소와 해당 마커를 추가하여 패널에 모든 매개 변수를 등록 (사용 가능한 목록에서 선택하거나 새 매개 변수를 추가). 또한, 자동 형광과 생존 매개 변수를 포함; 선택한 모든 매개 변수는 &quot;unmixing&quot;창에 표시됩니다. </li><li> 은 &quot;분석&quot;탭에서이 실험의 &quot;튜브 목록&quot;에서 &quot;컨트롤&quot;창에서 (보상 구슬 완료) 첫 싱글 스테인드 샘플을 선택합니다. 워크 시트에서 &quot;다각형 디자인 도구&quot;를 클릭하고 FSC / SSC 플롯에서 비드 인구에 게이트를 설계합니다. 스펙트럼 또는 도트 플롯을 열 게이트의 상단을 두 번 클릭딸 플롯의 게이트 구슬을 시각화합니다. <ol><li> 정극에 대한 하나 개의 게이트 및 스펙트럼 또는 도트 플롯상의 어느 음극 비드 하나의 게이트 디자인. 각각의 양 및 음의 부분에 대한 두 세트의 레이저에 대응하는 전체의 스펙트럼을 확인하고 연속적 게이팅 및 도터 인구를 확인하는 게이트 클릭하여 특이점을 제거한다. 은 &quot;Unmixing&quot;창에서 부정과 긍정적 인 게이트를 입력합니다. </li><li> 각 단일 스테인드 샘플 단계를 반복 5.2. 참고 :이 모든 샘플에 위치하는 프로그램이 수 있지만, 양극과 음극 게이팅 전략 분석되고있는 샘플에 해당하는주의하십시오. 대신, 각각의 단일 염색 표본 부정적인 부분을 결정하는, 보편적 제외를 설정할 흠 비드 샘플을 사용한다. </li></ol></li><li> 은 &quot;튜브 목록&quot;및 autofluorescent을위한 디자인 게이트 및 비 autofluorescent 세포의 흠없는 세포 샘플을 선택합니다. </li> &lt;자동 형광 및 생존 능력을 포함한 모든 매개 변수에 대한 모든 부정과 긍정적 인 게이트가의 &quot;Unmixing&quot;창에서 선택하면 리&gt;에 &#39;계산&#39;버튼을 눌러주십시오. 샘플에 unmixing을 적용하는 분석한다. </li><li> 게이트 설계와 두 파라미터의 플롯을 작성하여 데이터를 분석한다. <ol><li> 먼저, FSC 대 SSC하는 게이트를 설계하고 생존 마커 (CD45 대 PI)로 표시된 모든 셀을 제외한 죽은 세포를 제거한다. 전지의 나머지 부분에서, 각각의 세포 현탁액에 기재된 전략에 따라 관심있는 모든 집단 디자인 게이트 (도 1-3). 참고 : 필요한 경우에 보상 조정 &quot;기준 스펙트럼 조정을.&quot; 이 알고리즘이 완벽하게 할 수없는 경우 각 형광 색소의 양 인구의 중간을 다시 조정하는 unmixing 후 사용할 수있는 도구입니다. </li></ol></li></ol>

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<li>Valente, M., Nascimento, D. S., Cumano, A., Pinto-do-Ó, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sca-1%2B+cardiac+progenitor+cells+and+heart-making%3A+a+critical+synopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Sca-1+ cardiac progenitor cells and heart-making: a critical synopsis.</a> Stem Cells Dev. 23 (19), 2263-2273 (2014).</li>
</ol>

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종래 FCM은 형광 물질의 여기 광을 방출 광자의 검출에 기초한다. 다른 형광 색소로부터의 신호를 측정하기위한 검출기에서 검출 한 형광 색소의 형광 방출은 물리적 오버랩을 유발한다. 방출 스펙트럼 사이에서이 파급은 보상에 의해 수정 될 필요가있다. unmixing의 디콘 볼 루션 알고리즘 FCM 스펙트럼 데이터 처리는 다른 스펙트럼 형상을 갖는 것을 제공하는 추가의 보정없이 가까운 발광 피크와 형광 색소의 결합을 허용한다. 분석을 위해 사용되는 알고리즘은 견고한 조직 세포 현탁액에서 비특이적 형광 감산 독립 변수로 자동 형광을 취급한다. 형광 색소 (19)의 패널은 두 개의 레이저 (488 nm 내지 405 nm 인)를 사용하여 면역 세포를 분석하여 조립 하였다. 638 nm의 레이저에있을 때 실제로, 32 채널의 PMT 섹션 대응이 레이저의 여기 파장에 사용할 수 없습니다. PMT를 최대 탐지 능력을 얻으려면 적색 레이저가...

지난 수십 년에서 유동 세포 계측법 (FCM)은 세포 표현형 연구에 필수적인 널리 사용되는 분석 방법이되었다. 특히 바이올렛 레이저 (405 ㎚) (예를 들어, 브릴리언트 바이올렛 새로운 Q 점 염료)에 의해 여기 된 형광 색소 가능한 형광 염료의 실질적인 증가가 있었다. 그러나 가능한 형광 염료의 성장은 중복 배출의 위험을 증가시키고 노동 집약적 보상 행렬을 필요로한다. FCM 고형 조직에서 세포 현탁액을 분석하기 위해 널리 사용되었지만, 자동 - 형광 세포의 존재는 특히 표지 집단의 차별을 제한한다. 스펙트럼 FCM의 기본 원리는 타무라 등에 상세히보고되어있다. 1,2. 간략하게, 여기서 사용되는 스펙트럼 FCM은 (재료의 테이블 참조) 405, 488, 및 638 nm의 레이저를 구비한다. 스펙트럼 FCM 모든 출사 F 캡처800 내지 500 nm이고, 종래의 대역 통과 필터를 교체 420 nm의 각각 내지 469 nm 내지 440 450 2 개 독립의 PMT에 대한 32 채널 선형 어레이 PMT (32 채널의 PMT)의 스펙트럼과 같은 luorescence. 405 nm 내지 638 nm의 레이저 스폿은 공동 선형 동안 488 및 638분의 405 nm의 레이저 반점은 공간적으로 분리된다. 각각의 입자를 들어, 405 nm의 여기에 의해 형광의 데이터를 66 개 채널과 488 nm의 레이저까지 스펙트럼 FCM 측정. 세포가 638 nm의 레이저에 의해 여기되는 경우, 마스크가 PMT에 빛나는에서 638 nm의 레이저를 방지하기 위해 삽입되기 때문에, 상기 스펙트럼은 형광 FCM 데이터 채널 (58)을 측정한다. FCM 분광 형광 스펙트럼 중첩의 분리를 가능하게 가중 최소 제곱 법 (WLSM)에 기초한 알고리즘을 사용하여 획득 된 전체 스펙트럼 데이터를 분석한다. 단일 염색 염색 된 샘플로부터 유도 된 스펙트럼은 기본 기준 스펙트럼으로서 인식된다. 멀티 스테인드 샘플을 수학적으로 장착된다비 혼합 및 혼합 된 형광 라벨 샘플의 스펙트럼 ND는 스펙트럼 성분의 집합으로 분해된다. unmixing는 분광 기술 3, 4에서는, 특정 염료를 측정 제외한 모든 검출기로부터의 신호를 제거하는 보정을 대체한다. 본 연구에서는 결합 마우스 비장에서 발견 된 주요 조혈 부분 집합을 특징으로 한, 21 매개 변수 분석 (19) 형광 색소를 테스트했다. 또한, 우리는 스펙트럼 세포 계측법 따라서 장 내 상피 림프구 및 배아 심장의 특성을 개선, 자동 형광 신호를 관리 할 수 ​​있음을 보여 주었다. 사실,이 조직에서 자동 형광 관리는 기존의 FCM의 분석에서 제외 될 세포에 특정 형광의 할당을 허용했다.

<table><tbody><tr><td>Mice</td><td>Janvier Labs</td><td>CD45.2</td><td>세포 소스</td></tr><tr><td>에탄올 70%</td><td>VWR</td><td>83801.36</td><td>살균</td></tr><tr><td>DPBS (Ca2+, Mg2+)</td><td>GIBCO ThermoFisher</td><td>14040-174</td><td>배아 수집</td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution (+Ca2+ +Mg2+) (HBSS+/+)</td><td>GIBCO 생명 ThermoFisher</td><td>14025092</td><td>해리, 분해 및 염색 용액</td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution (-Ca2+, -Mg2+) (HBSS-/-)</td><td>GIBCO Life ThermoFisher</td><td>14175095</td><td>Dissociation, digestion and staining solutions</td></tr><tr><td>Fetal calf serum (FCS)</td><td>EUROBIO</td><td>CVFSVF00-0U</td><td>Dissociation, digestion and staining solutions</td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Sigma</td><td>C2139</td><td>효소 용액</td></tr><tr><td>90 x 15mm, 플라스틱 조직 배양 페트리 접시.</td><td>TPP</td><td>T93100</td><td>배아 및 심장 수집</td></tr><tr><td>35 x 15 mm, 플라스틱 조직 문화 페트리 접시.</td><td>TPP</td><td>T9340</td><td>하트 컬렉션</td></tr><tr><td>파인 아이리스 시저</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>14090-09</td><td>해부 도구</td></tr><tr><td>총 펜치 (좁은 패턴 펜치, 곡선 12cm)</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>11003-12</td><td>해부 도구</td></tr><tr><td>파인 펜치 (Dumont no. 7 펜치)</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>11272-30</td><td>해부 도구</td></tr><tr><td>메스&nbsp;</td><td>VWR</td><td>21909-668</td><td>해부 도구</td></tr><tr><td>LEICA MZ6 해부 현미경</td><td>LEICA</td><td>MZ6 10445111</td><td>샘플링; Occular W-Pl10x/23</td></tr><tr><td>콜드 램프 소스</td><td>SCHOTT VWR</td><td>KL1500 컴팩트</td><td>샘플링; 두 개의 거위 목 섬유 적응</td></tr><tr><td>FACS 튜브</td><td>VWR</td><td>60819-310</td><td>소화 셀</td></tr><tr><td>96 웰 플레이트 (둥근 바닥)</td> <td>VWR</td><td>10861-564</td><td>염색 셀</td></tr><tr><td>나일론 메쉬 볼트 천 살균, 50/50 mm 조각.</td><td>SEFAR NITEX</td><td>SEFAR NITEX</td><td>세포 여과</td></tr><tr><td>UltrasComp eBeads</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>형광 표지 항체</td><td>Biolegend</td><td>카탈로그 번호 아래 표 참조</td> 염색 <td>세포</td></tr></tbody></table>

스펙트럼 유동 세포 계측법에 의해 고체 조직에서 분리 한 세포 현탁액의 분석

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

유동 세포 계측법 정의하고 림프 및 기타 조혈 세포의 표현형을 분석하기 위해 지난 40 년 동안 사용되어왔다. 처음 몇 형광 색소의 분석으로 제한, 현재 다른 형광 염료 수십있다, 최대 14-18 다른 염료는 한 번에 결합 할 수 있습니다. 그러나 다음과 같은 몇 가지 제한 사항이 여전히 분석 기능을 손상. 이 때문에 형광 프로브의 다수의 데이터 분석 인해 대형 멀티 파라미터 보정 행렬들의 필요성 점점 복잡해지고있다. 고형 장기에 의한 자동 형광 세포 현탁액 (유동 세포 계측법에 의하여) 분석이 필요하므로 또한, 검출 및 다른 조직에서 특정 세포 유형을 추적 형광 단백질을 운반하는 돌연변이 마우스 모델은, 가능하게되었다. 연속적인 파장의 넓은 범위에 따라 발광 스펙트럼의 형상을 구분하는 유세포 스펙트럼, 이러한 문제를 해결한다. 데이터는 분석 승보상 행렬을 대체하고 독립적 인 매개 변수로 자동 형광을 처리하는 알고리즘 i 번째. 따라서, 스펙트럼 유세포 유사한 발광 피크와 형광 색소를 판별 할 수 있어야 보상 요구없이 다중 파라미터 분석을 제공 할 수있다. 이 프로토콜은 작은 모집단 검출 높은 해상도를 제공하는 파라미터 (21) (19 형광 프로브) 특성 및 자동 형광 신호의 관리를 허용 계측법 분석 스펙트럼의 흐름을 설명한다. 여기에 제시된 결과는 스펙트럼 유동 세포 계측법 같은 심장과 소장 등 계측법 종래 흐름 특성화하기 어려운 조직으로부터 세포 집단의 분석에 이점을 제공 보여준다. 유동 세포 계측법에 따라서 보상 없이도 계측법 종래 플로우를 실행 가능하고 높은 자동 형광 관리의 다중 파라미터 분석 능력을 보여주는 스펙트럼.

21 파라미터 비장 세포를 분석 스펙트럼 FCM 패널 CD45 모든 조혈 유핵 세포를 라벨 동안도 1, T, B, NK 수지상 및 골수 세포의 서브 세트를 인식하는 다른 항체를 포함하는 비장 세포에 적용되는 19 형광 항체 패널로 얻은 결과를 나타낸다. 패널은 또한 생존 염료 (PI)뿐만 아니라 크기 (FSC)와 단위 (SSC) 파라미터를 포함한다. 도 1a는 기준 형광 색소의 스펙트럼을 나타낸다. CD45 + 게이트 (도 1b)에서 죽은 세포의 제거 후, 분석은 CD3 + T 세포가 TCRβ 쇄를 발현 및 CD4 T 세포의 CD25 + 세포의 예상 CD4 / CD8 분포 비율을 보여준다. CD8 T 세포는 CD44-...

이 문서 분광 계측법, 형광 색소를 구별하는 발광 스펙트럼의 형상을 사용하여 유동 세포 계측법에서의 새로운 접근 방식을 설명한다. 알고리즘은 보상을 대체하고 독립적 인 매개 변수로 자동 형광을 처리 할 수 ​​있습니다. 이 새로운 접근 방식은 고체 기관에서 분리 된 세포의 적절한 분석을 할 수 있습니다.

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

이 분광 세포 분석 기술의 전반적인 목표는 각 형광색소의 전체 방출 스펙트럼을 이용하여 서로 다른 형광색소를 구별하는 것입니다. 또한, 이 프로토콜은 자가형광을 독립적인 파라미터로 구현할 수 있게 하여, 고형 장기에서 분리한 세포를 적절하게 분석할 수 있도록 합니다. 이 방법은 희귀 세포군을 식별하는 방법과 같이 면역학 및 줄기세포 생물학 발달 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 수많은 파라미터를 동시에 분석하고 고체 조직의 자가형광을 관리할 수 있는 독특한 능력에 있습니다. 이 방법은 장과 심장에서 유래한 단일 세포 현탁액 조제에 사용되지만, 폐, 골격근, 간, 지방 및 신장과 같은 다른 장기에도 적용할 수 있습니다. 먼저, 성체 마우스에서 소장을 분리하여 세척하십시오.그런 다음, 조직을 페이퍼 타월 위에 놓고 날카로운 가위를 사용하여 파이어판(Peyer's patches)을 조심스럽게 제거합니다. 장을 세로 방향으로 절개하여 열고 1 cm 크기의 조각으로 나눕니다. 그 후, 조직을 10% FCS가 보충된 30 mL의 HBSS가 담긴 비커로 옮기고, 37 °C에서 지속적으로 교반하며 30분 동안 배양합니다.배양이 완료되면 세포 현탁액을 15 milliliter 플라스틱 튜브로 옮기고 5분 동안 강하게 볼텍싱합니다. 그런 다음, 해리되지 않은 큰 파편들이 가라앉을 수 있도록 현탁액을 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다. 이후 상층액을 새 튜브로 옮기고 세포를 120 ×g에서 7분 동안 원심 분리합니다.세포를 펠렛으로 만든 후, 1% FCS가 포함된 HBSS 10mL에 세포를 부유시키고 Neubauer 챔버를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 세포 염색 전, 음성 대조군을 준비하기 위해 1x10⁶개의 장 세포를 5mL 튜브로 옮깁니다. 샘플을 준비하려면, 새로운 5mL 튜브에 1x10⁶개의 장 세포를 넣고 1% FCS가 포함된 HBSS 2mL를 추가한 다음, 4°C에서 120×g로 5분간 원심분리합니다.상층액을 제거한 후, 50 µL의 항체 용액에 세포를 현탁합니다. 튜브를 알루미늄 호일로 감싸고 4 °C에서 20분 동안 세포를 배양합니다. 배양이 완료되면, 시료에 1% FCS가 포함된 HBSS 2 mL를 추가하고 4 °C에서 120 ×g로 5분 동안 원심분리합니다.상층액을 버리고 펠릿을 0.5 µg/mL propidium iodide 용액 200 µL에 재현탁합니다. 마우스 배아의 머리를 제거한 후, 미리 적신 페이퍼 타월을 깐 페트리 접시에 1% FCS가 포함된 HBSS 50 mL를 채우고 배아의 몸통을 담급니다. 실체현미경 하에서 배아 흉부의 우측을 절개하고, 심장에 손상을 주지 않도록 주의하며 흉강을 조심스럽게 엽니다.대혈관을 잡아 폐 및 흉선과 연결된 심장을 적출합니다. 1% FCS가 포함된 HBSS 2 mL가 채워진 35 mL 페트리 접시에 장기를 옮깁니다. 그 다음, 주변 장기 및 결합 조직으로부터 심장을 분리합니다.심장을 세척한 후, 미리 데워둔 효소 용액 1 mL에 담그고, 실체 현미경 하에서 미세 핀셋과 메스를 사용하여 조직을 1 mm³ 크기의 조각으로 잘게 다집니다. 미리 데워둔 효소 용액 1 mL를 추가로 넣고, 분쇄된 조직을 뚜껑이 있는 5 mL 튜브로 옮깁니다. 샘플을 수평 상태로 37 °C에서 15분 동안 배양합니다.배양이 완료되면 P1000 피펫으로 현탁액을 반복적으로 피펫팅하여 조직을 균질화합니다. 그 후, 소화되지 않은 조직 파편들이 가라앉을 때까지 샘플을 수직으로 세워 둡니다. 상층액을 50 milliliters 튜브로 옮깁니다.HBSS에 포함된 10% FCS 2mL를 첨가하고 분리된 세포를 얼음 위에 보관하십시오. 다음으로, 소화되지 않은 조직 침전물이 담긴 5mL 튜브에 미리 데운 효소 용액 2mL를 첨가하고, 남은 조직이 관찰되지 않을 때까지 앞서 설명한 대로 조직 소화를 계속 진행하십시오. 얻어진 세포 현탁액을 120 ×g에서 10분 동안 원심분리하십시오.그런 다음, 상층액을 제거하고 칼슘 및 마그네슘 양이온이 없는 HBSS 내 1% FCS 1 mL에 세포를 재현탁합니다. 심장 세포를 염색하려면, 세포 현탁액 200 µL를 라운드 바텀 96-well 플레이트의 웰로 옮깁니다. 플레이트를 480 ×g에서 1분 동안 원심 분리하고 상층액을 제거합니다.다음으로, 심장 세포를 100 µL의 항체 용액에 재부유시킵니다. 플레이트를 알루미늄 호일로 감싸고 4 °C에서 20분 동안 배양합니다. 배양이 완료되면, calcium 및 magnesium free HBSS에 1% FCS가 포함된 용액 200 µL로 심장 세포를 세척하고, 현탁액을 480 ×g에서 1분 동안 원심분리합니다.그 다음, 칼슘과 마그네슘 이온이 없는 HBSS 내의 1% FCS 200 µL로 세포를 재부유시키고, 이 현탁액을 칼슘과 마그네슘이 없는 HBSS 내의 1% FCS 200 µL가 미리 채워진 5 mL 튜브로 옮깁니다. 마지막으로, 0.5 µg/mL propidium iodide를 포함하는 칼슘 및 마그네슘 양이온이 없는 HBSS 내의 1% FCS 400 µL를 추가하고, 세포 현탁액을 70 µm 나일론 메쉬로 여과합니다. 세포를 시각화하려면 염색된 샘플을 유세포 분석기에 로드하고 preview를 클릭한 다음, acquire를 클릭하여 샘플에서 최대 2×10⁶ 개의 이벤트를 기록합니다.분석 탭에서 색상 팔레트 창을 열고, 각 파라미터에 해당하는 형광색소와 마커를 추가하여 연구 대상인 모든 파라미터를 등록하십시오. 이때 자가형광 및 생존율 파라미터가 반드시 포함되어야 합니다. 컨트롤 창의 튜브 목록에서 보정 비드를 포함하는 첫 번째 단일 염색 샘플을 분석하십시오.그런 다음, 워크시트에서 다각형 디자인 도구를 클릭하고 FSC SSC 플롯에서 비드 집단을 게이팅합니다. 게이트를 더블 클릭하여 게이팅된 비드의 자식 플롯을 생성합니다. 그 후 양성 비드와 음성 비드를 각각 별도로 게이팅합니다.각 양성 및 음성 분획에서 순차적인 게이팅과 이상치 제거를 통해 선택된 딸세포 집단을 검증하십시오. 그런 다음, 언믹싱(un-mixing) 창에 음성 및 양성 게이트를 업로드하십시오. 다음으로, 튜브 목록에서 염색되지 않은 세포 샘플을 선택하고 자가형광 세포와 비자가형광 세포를 구분하는 별도의 게이트를 설계하십시오.자가형광 및 생존능을 포함한 모든 파라미터에 대해 음성 및 양성 게이트가 정의되면 계산(calculate)을 클릭합니다. 그런 다음, 분석된 샘플에 언믹싱(un-mixing)을 적용합니다. 데이터를 분석하려면 SSC 대 FSC 플롯에서 세포를 게이팅하고 propidium iodide가 염색된 사멸 세포를 제외합니다.마지막으로, 모든 관심 세포 집단에 대한 게이트를 설정합니다. 여기 제시된 결과는 태아 심장에서 분리하여 anti-TER119, anti-CD45 및 anti-Sca-1 항체로 염색한 세포를 유세포 분석 및 스펙트럴 분석법으로 분석한 결과입니다. 두 대의 일반 유세포 분석기에서는 자가형광 세포의 하위 집단이 검출되었으나, 스펙트럴 분석에서는 이 세포들이 자가형광 세포로 정의되지 않고 CD45 TER119 음성 집단에 포함되었습니다.일반적인 유세포 분석법으로는 자가형광을 띠지만 CD31 양성 세포는 아닌 것으로 확인된 세포들을 대상으로 심근세포 특이적 전사체의 발현을 분석하였습니다. 자가형광 세포군에서 높은 수준의 cardiac troponin 및 심방 심근세포 유사 전사체가 발견되었으며, 이를 통해 일반적인 유세포 분석법에서는 상당수의 심근세포가 누락된다는 점이 확인되었습니다. 이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 약 8시간 이내에 완료할 수 있습니다.이 실험 절차를 수행할 때는 세포의 생존력을 보장하기 위해 모든 단계를 얼음 위에서 신속하게 진행해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에 세포 내 단백질 및 추가적인 표면 마커 분석을 수행하여 특정 분자 경로에 관한 의문에 답할 수 있습니다. 이 기술은 면역학 및 발생학 또는 줄기세포 생물학 분야의 연구자들이 다양한 장기에서 희귀 세포군을 탐색하고 분리할 수 있는 길을 열어주었습니다.이 영상을 시청한 후, 세포 조직에서 세포를 분리 및 염색하는 방법과 세포 자가형광으로 인한 한계를 극복하는 스펙트럼 유세포 분석법을 통해 표면 마커 발현을 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 프로피듐 아이오다이드(propidium iodide)를 사용하는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안 항상 개인 보호 장구(PPE) 착용과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

뇌 종양 세포 시작 (BTICs), 이기종 종양이 가진 줄기 세포의 속성 내에있는 희귀 한 세포의 식별은 인간의 뇌 종양의 pathogenesis에 새로운 통찰력을 제공합니다. 우리는 BTICs에 풍부하게 특정 문화 조건을 정제 한, 우리는 정기적으로 더 이러한 인구 풍부 유동 세포 계측법을 사용합니다. 단일 셀 RT-PCR에 의한 자기 갱신 assays 및 성적표 분석은 이후 이러한 절연 셀에 수행 할 수 있습니다.

정렬 줄기 세포 Assays 및 흐름에 대한 기본 뇌 종양 조직의 처리

효소 세제를 피 설치류 자료에서 고환 세포 현탁액의 기계적 준비를위한 새로운 프로토콜이 설명되어 있습니다. 방법은 매우 간단하고 빠르고, 재현성 및 흐름 정렬 및 RNA 추출에 적합한 좋은 품질의 세포 현탁액을 렌더링합니다.

고환 세포 현탁액의 준비를 위해 간단하고 효율적인 기술

신경 세포 유형에서 표면 항원 및/또는 세포 내 항원의 유세포 분석을 위한 프로토콜에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 신경생물학자가 이 강력한 기술을 활용할 수 있도록 실험 계획의 중요한 측면, 단계별 방법론적 절차 및 유세포 분석의 기본 원리를 설명합니다.

신경 세포 유형의 표면에 대한 유동 세포 계측법 프로토콜 및 세포 내 항원 분석

흐름 cytometric 분석은 순수 문화 조사 및 미생물 지역 사회 역학을 모니터링 귀중 한 입증 했다. 우리는 순수한 문화 및 도전 행렬에서 명확한 매체 뿐만 아니라 복잡 한 사회에 대 한 데이터 분석, 샘플링에서 세 개의 포괄적인 워크플로 각각 제시.

특성화 미생물 역학-Cytometry 워크플로 순수 문화에서 자연 커뮤니티를 기반으로

여기, 선물이 murine thymus, 림프절, 비장 추가 연구를 cytometry를 사용 하 여 이러한 셀을 배출 췌 장에서 단일 셀을 준비 하는 프로토콜. 또한,이 프로토콜 cytometry 사용 규제 T 세포의 하위 집합을 결정 하는 데 사용 되었다.

Murine Thymus, 림프절, 비장 Cytometry 사용 하 여 배출 췌 장 하위 집합 규제 T 세포의 결정

고형 종양 세포주에서 측면 집단 세포의 비율을 측정하는 편리하고 빠르며 비용 효율적인 방법이 제시된다.

고형 종양 세포주에서 측면 인구의 분석

절개된 임플란트에서 세포를 분리하고 유세포 분석을 통한 세포 특성 분석은 임플란트에 대한 면역 반응 패턴을 이해하는 데 크게 기여할 수 있습니다. 이 논문은 절개된 임플란트에서 세포를 분리하고 유세포 분석을 위한 염색을 위한 정확한 방법을 설명합니다.

절개된 임플란트 조직의 면역 기능 분석을 위한 고차원 유세포 분석

이 프로토콜은 가래를 단일 셀 서스펜션으로 분리하고 표준 흐름 세포 측정 플랫폼에서 셀룰러 하위 집합의 후속 특성화를 결합하는 효율적인 방법을 설명합니다.

유동 세포측정에 의한 품질 제어 가래 분석

특정 조직 유형의 세포를 Dissociating하면 조직 aggitation에 대한 특정 매개 변수가 가능한, culturable 세포의 높은 볼륨을 얻기 위해 필요합니다. Miltenyi gentleMACS Dissociator은 간단하고 실용적인 프로토콜이 작업을 최적화합니다. 이 발행물에서 nerual 조직이 장치의 사용이 설명되어 있습니다.

마우스 신경 조직에서 단일 셀 Suspensions의 생성

유전 공학 또는 큰 샘플 크기를 요구하지 않고, 고유의 단백질 - 단백질 상호 작용의 구분, 강력하고, 생화학 평가를 허용하는 IP - FCM 방식은 제공됩니다.

IP - FCM : 유동세포계측법에 의해 감지 Immunoprecipitation

배우세요 고체 조직에서 분리한 세포 현탁액을 스펙트럼 유동 세포 계측법으로 분석하는 방법입니다. 자가형광을 독립 변수로 처리하여 희귀 세포 집단을 정확히 식별할 수 있습니다.

스펙트럼 유동 세포 계측법에 의해 고체 조직에서 분리 한 세포 현탁액의 분석

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