산탄 프로테오믹스 자세하게 특성화 LERLIC-MS / MS 및 글루타민 정량 아스파라긴 탈 아미드

이 절차의 전반적인 목표는 샷건 단백질체학을 사용하여 복합 단백질체에서 내인성 글루타민 및 아스파라긴 탈아미드화 산물을 특성화하고 정량화하는 것입니다. 이 방법은 글루타민 및 아스파라짐 탈아미노화의 등척성 산물 대둔지에 대한 자발적 및 반마틱 프로세서의 영향과 같은 생화학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 글루타민 탈아미노화 이성질체가 긴 길이의 이온 변화 모세관 컬럼에서 분리되어 이성질체 점으로 펩타이드를 분리하는 능력을 극대화한다는 것입니다.

컬럼 구성을 시작하려면 50mg의 약한 음이온 교환 충전재를 3.5ml의 90% 이소프로판올에 현탁합니다. 내경이 200마이크로미터인 50cm 길이의 피크 튜빙의 한쪽 끝에 암-암 피팅, 미세동물 및 암나사 너트를 고정합니다. 마이크로페럴 내부의 튜브 끝에 1마이크로미터 기공이 있는 1/16인치 스크린을 맞춥니다.

4, 500psi로 설정된 압력 펌프를 사용하여 재료가 상단에서 보일 때까지 음이온 교환을 모세관에 패킹합니다. 다른 암-암 피팅(female-to-female fitting), 미세동물(microferal) 및 암나사(female nut)를 반대쪽 끝에 있는 패킹된 모세관 상단에 부착하여 컬럼 조립을 마칩니다. 50-100mg의 조직을 인산염 완충 식염수로 5분 동안 세척합니다.

이 세척을 두 번 반복 한 다음 세척 된 조직을 안전 캡이있는 튜브에 넣으십시오.각 튜브에 스테인레스 스틸 비드 1 중량 상당량과 1 % 나트륨 데 옥시 콜레이트가 함유 된 100 밀리 몰 암모늄 아세테이트 수용액의 부피 2.5 당량을 추가하십시오. 섭씨 4도에서 5분 동안 최대 강도로 조직을 균질화합니다.

다음, 10, 000 x g 및 4 섭씨 온도에 10 분 동안 균질산염을 분리기. 상등액을 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 조직 펠릿을 균질화하고 원심분리를 계속하여 펠릿이 관찰되지 않을 때까지 매번 상등액을 결합합니다.

bicinchoninic acid assay를 사용하여 결합된 상등액의 단백질 농도를 정량화합니다. 다음으로, 100 밀리 몰 암모늄 아세테이트에 디티 오 트레이톨 (dithiothreitol)의 1 몰 용액을 균질화하여 샘플에서 10 밀리 몰 디티 오 트레이톨 농도를 얻는다. 균질산염을 섭씨 60도의 수조에서 30분 동안 배양합니다.

균질화에 100 밀리몰 암모늄 아세테이트에 1 몰 용액의 요오드 아세트아미드 용액을 첨가하여 샘플에서 20 밀리몰의 요오드 아세트아미드 농도를 얻습니다. 균질산염을 빛이 없는 실온에서 45분 동안 배양합니다. 그런 다음 균질액을 100 밀리 몰 암모늄 아세테이트에 10 밀리 몰 용액의 2 부피 당량으로 희석합니다.

균질산염을 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 균질액에 100 밀리몰 암모늄 아세테이트에 충분한 부피의 염기서열분석 등급 변형 트립신을 첨가하여 샘플에서 1 - 50 단백질 효소 비율을 달성합니다. 균질산물을 소화하기 위해 섭씨 30도에서 밤새 샘플을 배양합니다.

포름산의 샘플 중량의 0.5 %로 소화를 담궈내고, 나트륨 데 옥시 콜레이트 염을 침전시킨다. SDC 염을 함유 한 샘플을 부드럽게 와류로 만든 다음 12, 000 x g 및 섭씨 4도에서 10 분 동안 샘플을 원심 분리하십시오. 상등액을 새 튜브에 디캔팅하고 SDC 염 펠릿을 방해하지 않도록 주의하십시오.

염을 수산화 암모늄의 0.5 % 부피 수용액에 재용해시키고 격렬하게 와류화합니다. 1g의 C-18 흡착제 카트리지에 5ml의 아세토니트릴을 넣은 다음 물에 0.1%트리플루오로아세트산 5ml를 넣습니다. 그런 다음 분해된 샘플을 카트리지에 로드합니다.

0.1%TFA의 5밀리리터 부분으로 샘플을 3-5회 세척합니다. 그런 다음 펩타이드를 75% 아세토니트릴과 0.1% 포름산의 수용액 5밀리리터로 희석합니다. 진공 농축기에서 유체를 건조시킵니다.

200 마이크로 리터의 75 % 아세토 니트릴을 첨가하고 0.1 % 포름산을 잔류 물에 첨가하십시오. 혼합물을 최소 10분 동안 와류화한 다음 혼합물을 최소 30분 동안 초음파 처리하여 건조 펩티드를 재구성합니다. 주입된 샘플에 1-3마이크로그램의 단백질이 포함되도록 필요에 따라 샘플을 희석합니다.

LAX 모세관 컬럼을 초고압 액체 크로마토그래피 기기에 연결합니다. 물과 아세토니트릴에 0.1% 포름산 용액을 준비합니다. 유속을 분당 0.4마이크로리터로 설정하고 1, 200분 경사도를 설정합니다.

질량 분석기 스캔 이벤트를 구성하여 전체 푸리에 변환 질량 분석기와 푸리에 변환 탠덤 질량 분석기 사이에서 데이터 수집을 번갈아 가며 수행할 수 있습니다. LERLIC MS/MS를 수행하여 펩타이드를 분리하고 특성화합니다. 결과 데이터 및 단백질체학 소프트웨어를 사용하여 단백질 데이터베이스 검색을 수행합니다.

데이터베이스 검색 결과를 스프레드시트 소프트웨어로 내보냅니다. 탈아미드화된 펩타이드 목록과 해당 비탈아미드화된 펩타이드를 식별하고 추출합니다. 이러한 각 펩타이드의 이온 크로마타그램을 5ppm의 질량 허용 오차로 추출합니다.

추출된 이온 크로마타그램에서 이성질체 산물의 분리된 이중 피크 환상을 검사합니다. LERLIC MS/MS를 사용하여 글루타민과 아스파라긴의 탈아미드화된 동형을 분리하고 두 가지 다른 머무름 시간으로 단백질 샘플에서 식별했습니다. 반전된 감마 알파 글루타밀 비율을 나타내는 트랜스아미드화의 효소 변형 중간 글루타민 잔기를 확인하였다.

아스파라긴 잔류물 내의 숙신이미드 중간체도 이 방법으로 확인되었습니다. 약산성 시료 처리 조건으로 숙신이미드 중간체를 안정화합니다. 이는 LERLIC MS/MS 기법이 숙신이미드 중간체에 대한 단백질체 광범위한 연구에 적용될 수 있음을 시사합니다.

개발 후 이 기술은 생화학 연구자들이 고고학에서 생물 의학 연구에 이르기까지 다양한 맥락에서 단백질 탈아미드화를 특성화할 수 있는 길을 열었습니다.