산탄 프로테오믹스 자세하게 특성화 LERLIC-MS / MS 및 글루타민 정량 아스파라긴 탈 아미드

본 절차의 전반적인 목표는 샷건 프로테오믹스(shotgun proteomics)를 사용하여 복잡한 프로테옴 내의 내인성 글루타민 및 아스파라긴 탈아미드화 생성물을 특성화하고 정량화하는 것입니다. 이 방법은 글루타민 및 아스파라긴 탈아미드화의 이성질체 생성물에 미치는 자발적 및 항매틱 프로세서의 영향과 같은 생화학의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 글루타민 탈아미드화 이성질체가 긴 길이의 이온 교환 모세관 컬럼에서 분리되어, 이소매틱 포인트(isomatic points)에 따라 펩타이드를 분리하는 능력을 극대화한다는 점입니다.

컬럼 제작을 시작하려면, 50 mg의 약음이온 교환 충전물을 3.5 mL의 90% isopropanol(수용액)에 현탁합니다. 내경이 200 µm인 50 cm 길이의 peak 튜빙 한쪽 끝에 암-암 피팅, 마이크로페룰 및 암너트를 고정합니다. 마이크로페룰 내부의 튜빙 끝단에 1 µm 공극의 1/16인치 스크린을 장착합니다.

4,500 psi로 설정된 압력 펌프를 사용하여, 물질이 상단에 보일 때까지 모세관에 음이온 교환 수지를 충진하십시오. 충진된 모세관의 반대편 상단에 또 다른 암-암 피팅, 마이크로페룰 및 암너트를 부착하여 컬럼 조립을 완료하십시오. 50~100밀리그램의 조직을 인산염 완충 식염수로 5분 동안 세척하십시오.

이 세척 과정을 두 번 반복한 후, 세척된 조직을 안전 캡이 달린 튜브에 넣습니다. 각 튜브에 조직 무게와 동일한 양의 스테인리스강 비드와, 부피 기준 2.5배의 1% sodium deoxycholate가 함유된 100 millimolar ammonium acetate 수용액을 추가합니다. 4°C에서 최대 강도로 5분 동안 조직을 균질화합니다.

그런 다음, 균질액을 10,000 x g, 4 °C에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 1.5 mL 튜브로 옮깁니다. 펠릿이 더 이상 관찰되지 않을 때까지 조직 펠릿의 균질화와 원심분리 과정을 반복하며, 매회 상층액을 합칩니다.

bicinchoninic acid 분석법을 사용하여 혼합 상층액의 단백질 농도를 정량합니다. 다음으로, 샘플 내 dithiothreitol 농도가 10 mM이 되도록 100 mM ammonium acetate에 녹인 1 M dithiothreitol 용액을 균질액에 첨가합니다. 균질액을 60 °C 항온수조에서 30분 동안 배양합니다.

균질액에 100 millimolar 아세트산 암모늄에 녹인 1 molar iodoacetamide 용액을 첨가하여 시료 내 iodoacetamide 농도가 20 millimolar가 되도록 합니다. 균질액을 빛이 없는 상온에서 45분 동안 배양합니다. 그 다음, 100 millimolar 아세트산 암모늄에 녹인 10 millimolar dithiothreitol 용액을 균질액 부피의 2배량으로 첨가하여 희석합니다.

균질물을 37 °C에서 30분 동안 배양합니다. 샘플 내 단백질 대 효소의 중량비가 1:50이 되도록 100 mM 초산 암모늄에 희석된 시퀀싱 등급의 변형 트립신을 적정량 첨가합니다. 균질물을 소화시키기 위해 샘플을 30 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.

시료 무게의 0.5%에 해당하는 formic acid를 첨가하여 소화를 중단시키고, sodium deoxycholate 염을 침전시킵니다. SDC 염이 포함된 시료를 가볍게 vortexing한 후, 12,000 x g, 4 °C에서 10분 동안 원심분리합니다. SDC 염 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하며 상층액을 새 튜브에 옮깁니다.

염을 0.5% (v/v) 암모늄 하이드록사이드 수용액에 다시 녹이고 격렬하게 볼텍싱합니다. 1 g C-18 흡착 카트리지를 5 mL의 아세토니트릴과 이어서 5 mL의 0.1% 트리플루오로아세트산 수용액으로 컨디셔닝합니다. 그 다음, 소화된 샘플을 카트리지에 로딩합니다.

0.1% TFA 5 mL로 샘플을 3~5회 세척합니다. 그 후, 75% acetonitrile과 0.1% formic acid 수용액 5 mL로 펩타이드를 희석합니다. 진공 농축기로 액체를 건조시킵니다.

잔류물에 0.1% formic acid가 포함된 75% acetonitrile 200 microliters를 첨가합니다. 혼합물을 최소 10분 동안 vortexing하고, 이어서 최소 30분 동안 sonication하여 건조된 펩타이드를 재용해합니다. 주입되는 시료에 protein이 1~3 micrograms 포함되도록 필요에 따라 시료를 희석합니다.

LAX 모세관 컬럼을 초고성능 액체 크로마토그래피 장비에 연결하십시오. 물과 아세토니트릴에 0.1% 포름산을 첨가하여 용액을 준비합니다. 유속을 0.4 µL/min으로 설정하고, 1,200분 동안의 기울기 용리(gradient run)를 설정하십시오.

질량 분석기의 스캔 이벤트를 전체 푸리에 변환 질량 분석(full Fourier transform mass spectrometry)과 푸리에 변환 탠덤 질량 분석(Fourier transform tandem mass spectrometry) 사이에서 데이터 획득이 교대로 이루어지도록 설정하십시오. LERLIC MS/MS를 수행하여 펩타이드를 분리하고 특성화하십시오. 결과 데이터와 프로테오믹스 소프트웨어를 사용하여 단백질 데이터베이스 검색을 수행하십시오.

데이터베이스 검색 결과를 스프레드시트 소프트웨어로 내보냅니다. 탈아미드화된 펩타이드 목록과 그에 대응하는 비탈아미드화 펩타이드를 식별하여 추출합니다. 5 ppm의 질량 허용 오차 내에서 각 펩타이드의 이온 크로마토그램을 추출합니다.

추출된 이온 크로마토그램을 검토하여 이성질체 생성물로 인한 이중 피크의 착시 현상이 있는지 확인합니다. LERLIC MS/MS를 사용하여, 단백질 시료로부터 두 가지 서로 다른 머무름 시간에서 글루타민과 아스파라긴의 탈아미드화 동형 단백질을 분리하고 식별하였습니다. 역전된 감마 알파 글루타밀 비율을 보이는 전이아미드화의 효소적으로 변형된 중간 글루타민 잔기가 식별되었습니다.

이 방법으로 아스파라긴 잔기 내의 숙신이미드 중간체 또한 확인되었습니다. 약산성의 시료 처리 조건이 숙신이미드 중간체를 안정화하기 때문입니다. 이는 LERLIC MS/MS 기술이 프로테옴 전체의 숙신이미드 중간체 연구에 적용될 수 있음을 시사합니다.

이 기술의 개발 이후, 생화학 연구자들은 고고학에서 생의학 연구에 이르기까지 다양한 분야에서 단백질 탈아미드화를 특성화할 수 있는 길이 열렸습니다.