Name: 생체 외에서 마우스 시뮬레이션된 Microgravity에서 Preantral 모 낭의 성장 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: 학습하세요 마우스 전낭포를 회전 배양 시스템을 이용한 모의 미중력 조건에서 배양하는 방법을. 이 기술은 수정란 및 과립막세포 발달 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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저자는 Yilong 왕 및 동물 유지에 있는 그들의 도움에 대 한 Yanlin Zhao, 조직학 샘플을 준비 하 고 있는 그녀의 원조에 대 한 찬 장 및 박사 Songtao 그가 비판적으로이 원고를 읽고에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 자연 과학 재단의 강성에 의해 지원 되었다 (허가 번호: LY13C120002).

이 연구에 대 한 윤리적인 승인은 동물 연구 윤리 위원회의 Wen Zhou 의학 대학에서 얻은 했다.
1. 문화 미디어와 Alginate 하이드로 겔의 준비
<ol>
	<li>난소 조직 및 여 포 처리 중간 10% 태아 둔감 한 혈 청, 100 IU/mL 페니실린와 100 µ g/mL 스 L-15 매체를 사용 하 여 준비 합니다. 2 주 동안 4 ° C에서 저장 합니다.</li>
	<li>난소 조직 및 알파 최소한의 필수적인 매체 [α-MEM] 5% 태아 둔감 한 혈 청 [FBS] 보충 구성 된 뿌리 배양 준비 1% 인슐린-셀레늄-올려진다, 10 mIU/ml rFSH, 100 IU/mL 페니실린, 및 100 µ g/mL 스. 2 주 동안 4 ° C에서 저장 합니다.</li>
	<li>준비 alginate 히드로 살 균 PBS에 0.8% (w/v) 나트륨 alginate 솔루션을 사용 하 여 다음 alginate 구슬을 만들려고 캡슐화 솔루션 (140 m m NaCl /50 m m CaCl2)에이 솔루션의 10 µ L를 드롭. 참고: alginate 구슬의 크기는 직경 약 3 m m 이었다.</li>
</ol>
2. 마우스 뿌리 격리 및 캡슐화
<ol>
	<li>Aseptically가 위와 집게를 사용 하 여 제거 난소 자 궁 경부 전위에 의해 14 일 된 ICR 여성 쥐를 추려 고 난소의 중간 처리 2 mL에 넣어.</li>
	<li>메스를 사용 하 여 반으로 난소를 잘라. 절반 크기의 난소 조직 문화 매체에 문화에 대 한 약 1 m m 두께 했다.</li>
	<li>수동으로 2-4 X stereomicroscope에서 26 1/2 게이지 바늘을 사용 하 여 난소에서 난 포를 분리 하 고 선택한 낭 문화 매체에 문화에 대 한 수집. 참고: 여 포 선택 기준: 1) 낭 했다 라운드 중간에 2-3 레이어 2 oocytes를 둘러싼 granulosa 셀의 oocytes) 낭 일부 티크 셀과 연결 된 그대로 기저 막도 있었고 3) 뿌리 크기 90-100 µ m 직경</li>
	<li>1.3 단계 당 alginate 구슬 만들기 Alginate 솔루션 낭을 세척 하 고 특정 모든 구슬 포함 한 stereomicroscope에서 하나의 뿌리를 각 alginate 구슬의 중간에 하나의 뿌리를 플라스틱. 35 ×에서 문화 매체의 150 µ L에 구슬 문화 매체, 문화는 alginate rinsing 후 10 mm 접시 또는 RWV 장치를 문화.</li>
</ol>
3. 난소 조직 또는 시뮬레이션된 Microgravity에서 뿌리 문화
<ol>
	<li>RWV 장치를 사용 하 여 시뮬레이션된 microgravity 생성. 라이트 파라핀 기름 (~ 10 mL)으로 배를 채우기, 물방울, 기름으로 문화 매체의 150 µ L 에서도 다음 난소 조직에의 한 조각 또는 캡슐화 된 여 포와 3 alginate 구슬 중간 물방울으로 전송. 선박 포트 뚜껑 닫고 장치의 회전 기초에 배를 해결 합니다.</li>
	<li>컨트롤에서 그룹 장소 alginate 구슬 낭을 포함 하 또는 난소 조직 문화 매체 물방울에서의 150 µ L로 덮여 라이트 파라핀 오일 35 ×에서 10 m m 문화 요리.</li>
	<li>문화 요리와 5% CO2 공기에서 37 ° C에서 습도 인큐베이터에서 RWV 장치 모두를 품 어.</li>
	<li>문화 매체 RWV 장치를 변경 하려면: 150 × 20 m m 문화 접시에 석유와 혈관에서 매체를 부 어, 난소 조직 또는 alginate 구슬 문화 매체와 문화 접시에 전송. 다시 단계 3.1 당 선박 문화 시스템을 설정 합니다.</li>
</ol>
4. decapsulation 및 여 포 검색
<ol>
	<li>경작의 4 일 후 150 × 20 m m 문화 접시에 석유와 혈관에서 매체를 붓는 다. 37 ° c.에 30 분 동안 10 U/mL alginate lyase 보충 매체 처리에 잠복기 여 alginate 구슬 및 decapsulate 낭 alginate 구슬에서 선택</li>
	<li>낭을 수집 하 고 처리는 stereomicroscope 아래 중간에 그들을 씻어.</li>
</ol>
5. 난소 조직 및 여 포 평가
<ol>
	<li>세포 생존 능력 분석 실험
	<ol>
		<li>D-PBS에 decapsulated 낭 세 번 세척 하 고 다음 결합된 세포 생존 능력 분석 실험 시 약의 150 µ L에 그들을 품 어 (2 µ M calcein 오전 및 4 µ M EthD-1) 45 분 동안 실내 온도에.</li>
		<li>깨끗 한 현미경 슬라이드 10 낭 전송 µ L D-PBS는 coverslip로 커버 하 고 다음 분명 손톱 폴란드어와 인감.</li>
		<li>수 그린 고 confocal 형광 현미경 (400 X) 슬라이드에 레드 셀. 참고:이 생존 능력 분석 결과에서 녹색 세포는 살아있는 세포, 고 붉은 세포는 죽은 세포. 10% 레드 셀 (죽은)과 낭 살아남은 모 낭으로 간주 됩니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>되며 고 오신 (H &#38; E) 난소 조직 및 여 포의 얼룩
	<ol>
		<li>신선한 14 일 된 마우스 난소와 0 샘플으로 Bouin의 솔루션에 14 일 된 쥐에서 분리 된 preantral 낭 수정. 실험 샘플으로 4 일간 문화 후 2 일 또는 4 일 문화와 alginate 구슬 안에 개별 낭 후 교양된 난소 조직 수정.</li>
		<li>파라핀, 5 µ m 두께에서 직렬 섹션에서에서 모든 샘플을 포함 하 고 다음으로 얼룩 &#38; 전자 제조업체의 지침에 따라.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>여 포 세 고 지름 측정
	<ol>
		<li>난소 조직 단면도 H 물에서 &#38; E, 모든 낭와 (확대 400 X) 현미경 조직 섹션 영역 내에서 건강 한 preantral 낭 계산. Preantral 낭 낭의 총 수로의 수를 분할 하 여 여 포의 밀도 계산 합니다. 참고: 건강 한 preantral 낭 granulosa 셀의 적어도 2 개의 층을 가진 그는.</li>
		<li>하루 0 낭과 교양 4 일 낭의 측정 포 및 oocyte 지름입니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Immunohistochemistry
	<ol>
		<li>4 %paraformaldehyde 난소 조직을 수정, 파라핀, 5 µ m 두께, 섹션에에서 포함 하 고 슬라이드에 조직 단면도 탑재. Dewax 섹션 rehydrate, 시트르산 버퍼 15 분 블록을 위한 그들에 게 3%의 과산화 수소에에서 내 인 성 과산화 효소를 품 어, 정체 5% 염소 혈 청, 항 원 그리고 다음 3 시간 실 온에서 1 차 항 체로 품 어.<ol>
			<li>3 분, PBS에서 씻어 다음 1: 500 희석 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP)와 슬라이드를 품 어-염소-토끼 IgG (H + L) 실 온에서 1 h를 활용. 참고: 기본 항 체 연구에 사용 했다 토끼 안티-GDF-9 항 체 (1: 500 희석)와 토끼 안티 PCNA 항 체 (1: 200 희석).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>3 난소 섹션 슬라이드를 품 어, Diaminobenzidine [DAB] 과산화 효소 활동을 감지 하 여 유리에-3' 수성 장착 매체와 슬라이드.</li>
		<li>난소 섹션 슬라이드에 400 배 확대 현미경으로 관찰 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>전송 전자 현미경 [편]
	<ol>
		<li>실 온에서 3 h 2.5%도 낭 수정 다음 37 ° c.에 1 시간에 1% 오스뮴 tetroxide 포스트 수정</li></ol></li></ol>PBS와 함께 씻으십시오 다음 37 ° c.에 1 %phosphotungstic 산 및 1 시간에 1% 나트륨 uranyl 아세테이트 낭 치료 탈수는 아세톤 시리즈를 사용 하 여 낭: 25, 50, 75, 95, 및 100% (3 회), 그리고 에폭시 수 지-아세톤 혼합물 최종 100% 아세톤 후 37 ° C에 단계와 다음 45 ° c.에 에폭시 수 지에 포함
		<li>1.0 µ m 세미 얇은 섹션으로 포함 된 블록을 잘라내어 지역화는 진영에서 여 포를 1-2 분 1% 메 틸 렌 블루와 섹션을 얼룩. 50 nm ultrathin 섹션에 포함 된 블록을 잘라내어 격자에 가장에 대 한 섹션을 탑재.</li>
	
	

6. 통계 분석
<ol>
	<li>평균 ± SEM 형식의 모든 데이터를 제시. Tukey 다중 비교 테스트 이어서 단방향 분산 분석 (ANOVA)에 의해 그룹 간의 차이 확인 합니다. P 에서 테스트 결과 의미에 대 한 α 임계값 설정 &#60; 0.05.</li>
</ol>

<ol><li>Eppig, J. J., Schroeder, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacity+of+mouse+oocytes+from+preantral+follicles+to+undergo+embryogenesis+and+development+to+live+young+after+growth%2C+maturation%2C+and+fertilization+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Capacity of mouse oocytes from preantral follicles to undergo embryogenesis and development to live young after growth, maturation, and fertilization in vitro.</a> Biol Reprod. 41, 268-276 (1989).</li>
<li>O'Brien, M. J., Pendola, J. K., Eppig, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+protocol+for+in+vitro+development+of+mouse+oocytes+from+primordial+follicles+dramatically+improves+their+developmental+competence%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">A revised protocol for in vitro development of mouse oocytes from primordial follicles dramatically improves their developmental competence.</a> Biol Reprod. 68, 1682-1686 (2003).</li>
<li>Liu, J., Van der Elst, J., Van den Broecke, R., Dhont, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+offspring+by+in+vitro+fertilization+of+oocytes+from+cryopreserved+primordial+mouse+follicles+after+sequential+in+vivo+transplantation+and+in+vitro+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Live offspring by in vitro fertilization of oocytes from cryopreserved primordial mouse follicles after sequential in vivo transplantation and in vitro maturation.</a> Biology of Reproduction. 64, 171-178 (2001).</li>
<li>Parrish, E. M., Siletz, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+in+mouse+ovarian+follicle+development+in+vivo+versus+an+ex+vivo+alginate+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Gene expression in mouse ovarian follicle development in vivo versus an ex vivo alginate culture system.</a> Reproduction. 142, 309-318 (2011).</li>
<li>Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+follicles+produce+live%2C+fertile+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring.</a> Tissue Eng. 12, 2739-2746 (2006).</li>
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<li>Grimm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+responsiveness+of+endothelial+cells+to+vascular+endothelial+growth+factor+and+basic+fibroblast+growth+factor+added+to+culture+media+under+gravity+and+simulated+microgravity%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Different responsiveness of endothelial cells to vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor added to culture media under gravity and simulated microgravity.</a> Tissue engineering Part A. 16, 1559-1573 (2010).</li>
<li>Grimm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+delayed+type+of+three-dimensional+growth+of+human+endothelial+cells+under+simulated+weightlessness%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">A delayed type of three-dimensional growth of human endothelial cells under simulated weightlessness.</a> Tissue engineering. Part A. 15, 2267-2275 (2009).</li>
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<li>Yu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simulated+microgravity+using+a+rotary+cell+culture+system+promotes+chondrogenesis+of+human+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+via+the+p38+MAPK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Simulated microgravity using a rotary cell culture system promotes chondrogenesis of human adipose-derived mesenchymal stem cells via the p38 MAPK pathway.</a> Biochem Biophys Res Commun. 414, 412-418 (2011).</li>
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<li>Zhu, M., Jin, X. W., Wu, B. Y., Nie, J. L., Li, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+simulated+weightlessness+on+cellular+morphology+and+biological+characteristics+of+cell+lines+SGC-7901+and+HFE-145%5BTitle%5D)+AND+%22Genet+Mol+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of simulated weightlessness on cellular morphology and biological characteristics of cell lines SGC-7901 and HFE-145.</a> Genet Mol Res. 13, 6060-6069 (2014).</li>
<li>Dang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simulated+microgravity+increases+heavy+ion+radiation-induced+apoptosis+in+human+B+lymphoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Simulated microgravity increases heavy ion radiation-induced apoptosis in human B lymphoblasts.</a> Life Sci. 97, 123-128 (2014).</li>
<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simulated+microgravity+compromises+mouse+oocyte+maturation+by+disrupting+meiotic+spindle+organization+and+inducing+cytoplasmic+blebbing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Simulated microgravity compromises mouse oocyte maturation by disrupting meiotic spindle organization and inducing cytoplasmic blebbing.</a> PLoS One. 6, e22214(2011).</li>
<li>Dong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+differentiation+factor-9+is+required+during+early+ovarian+folliculogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Growth differentiation factor-9 is required during early ovarian folliculogenesis.</a> Nature. 383, 531-535 (1996).</li>
<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simulated+Microgravity+Using+a+Rotary+Culture+System+Compromises+the+In+Vitro+Development+of+Mouse+Preantral+Follicles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Simulated Microgravity Using a Rotary Culture System Compromises the In Vitro Development of Mouse Preantral Follicles.</a> PLoS One. 11, e0151062(2016).</li>
</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

Preantral 낭의 성공적인 경작을 위한 중요 한 단계는: 1) 제대로 설명 했다 선택 기준에 따라 preantral 낭 프로토콜 텍스트 2.1에서 선택); 2) preforming 회의적인 상태에서 모든 절차 및 유지 메 마른 문화; 그리고 3) 올바르게 RWV 문화 시스템 설정.
유사 하거나 동일한 재료를 사용 하는 복제 실험에서 실험 관찰의 일관성의 보호입니다. 마우스 preantral 낭의 선택에 대 한 기준을 공개는 낭 1 했다) 얇은 zona pellucida; 둘러싸여 germinal 기 고장 (GVBD) 단계에서 건강 한 oocytes 기저 막에 의해 둘러싸인 granulosa 셀의 2) 2-3 층 그리고 3) 일부 thecal 세포 기저 막에 연결 된. 따라서, 낭 선정 했다 뿐만 아니라 모든 oocyte 성장 뿐만 아니라 90-100 µ m의 직경을 가진 유사한 형태학 식별을 지원 하기 위한 난소 여 포의 3 기능 구획.
이것은 3D 시뮬레이션된 microgravity에서 경작 방식에서 마우스 preantral 모 낭 성장에 첫 번째 시도 이다. 여러 문화 시스템 마우스 preantral 낭에 대 한 개발 되었습니다. 배양 접시, 소위 2D 문화의 평평한 표면에 뿌리에서 얻은 oocytes 수정 된 수 하 고 라이브 자손을 생산. 또한, alginate 구슬, 여 포의 문화 같은 3D 문화 유지 조직 구조 시체 높은 비율 meiotically 유능한 oocytes에서 생산 비슷합니다. 그러나, 난소 낭/oocytes 제로 중력 분야에서의 개발 과정 불명 하다. RWV, 조직 공학에 상당한 관심을 모으고 있는 장치 시뮬레이션된 microgravity 환경을 생성할 수 있고 난소 여 포/oocytes 성장에 microgravity 시뮬레이션된의 효과 조사를 위한 이상적인 환경을 제공합니다 생체 외에서.
그것은 세포 배양 RWV 장치를 제대로 설정 해야 합니다. 혈관에 공기 방울을 제거 되어야 합니다. 공기 방울을 제거 하는 방법은 선박, 생성 하는 경우는 다음과 같습니다: 두 개의 주사기 포트의 각 오일의 0.5 mL와 함께 두 개의 주사기를 배치. 주사기 포트를 제어 하는 밸브를 엽니다. 공기 방울이 주사기 포트 아래 책략. 다른 주사기 포트를 통해 미디어의 대략 동일한 볼륨을 주입 하는 동안 주사기로 거품을 당겨. 모든 거품은 제거 후 밸브를 닫고, 주사기, 제거 하 고 주사기 포트 뚜껑 교체. 그것은 또한 중요 한 세포는 일정 한 회전을 통해 정착 하지 못하도록 정확한 회전 속도를. 회전 속도의 최적화는 셀, 액체 밀도 및 점성의 특정 무게에 의해 결정 됩니다.
GDF-9-결핍 마우스 낭16에서 그들과 유사 했다, PCNA와 GDF-9의 식을 프로필 공개 그 시뮬레이션된 microgravity granulosa 셀과 oocytes의 개발에 대 한 해로운 효과 했다. 효율적인 산소와가 될 가능성이 매우 낮은 전단 스트레스를 제공 하는 뒤에 막에 걸쳐 산소와 이산화탄소의 투과 대 한 허용 5% CO2 인큐베이터 안에 수평 축 주위를 돌 다 RWV 장치의 배는 여 포/oocyte 부상의 원인입니다. 최적화 실험 설치 및 추가 분석의 해로운 효과의 메커니즘을 조사 하기 위해 필요 합니다.
더 연구는 생체 외에서 oocytes RWV 문화 시스템에서 파생 된의 발달 잠재력을 조사 필요 합니다. 체 외에서 성숙 MII 단계로 oocytes의 현재 되 고 수행 됩니다. 이 문화 시스템의 최종 유효성 검사 검색된 oocytes의 수정 용량에 의해 시험 될 것 이다.

생체 외에서 난소 여 포 개발과 oocyte 성숙 달성 하 고 접시, 그리고 3 차원 (3D) 매트릭스, alginate와 하이드로 겔1 등의 표면에와 같은 2 차원 문화에 대 한 전통적인 방법을 사용 하 여 2,3. 3D 문화 시스템 효과적으로 낭 조직 같은 구조에서 유지4 낭 vivo에서로 비슷한 유전자 표현 프로 파일을 유지 하 고 생산 meiotically 유능한 oocytes5,6. 3D 문화 시스템 또한 매트릭스 없는 상태에서 설치 될 수 있다, 매달려 펜션과 롤링 용기를 드롭 하는 예를 들어. 국가 항 공학 및 공간 행정 (NASA)에 의해 개발 된 회전 벽 선박 (RWV) 선박7안으로 경작 하는 셀에 대 한 시뮬레이션된 microgravity (s-μg)을 생성 합니다. 이 시뮬레이션된 microgravity 상태 대류에 대 한 침의 부족 때문에 세포 증식 및 분화에 대 한 독특한 문화 시스템을 제공 합니다. 그것은 보였다 그 시뮬레이션된 microgravity 승진 내 피 혈관 내 피 세포8,9, 갑 상선 세포10, 그리고 지방이 많은 파생 된에서 chondrogenesis에서 조립 하는 갑 상선 조직에서 형성 RWV 장치11에서 중간 엽 줄기 세포. 그러나, 다른 연구 시뮬레이션된 microgravity 위 암 세포에 있는 apoptosis를 유도 하 고 B lymphoblasts12,,1314의 효과 제안 세포질 상해에 microgravity 시뮬레이션 셀 형식에 따라 다릅니다 수 있습니다. 시뮬레이션된 microgravity 방해 스핀 들 조직에 보고 된 또한 ultrastructural 수준에서 변화를 일으킬 수와 유도 세포질 blebbing oocytes15에. 최적화 된 시뮬레이션된 microgravity 조건 및 시스템 아래 조직 공학 또는 세포 손상 유발 하는 메커니즘 추가 조사가 필요 합니다. 난소 낭/oocytes RWV 장치를 사용 하 여 성장의 생체 외에서 실험 oocyte 유전자 표현과 oocyte 세포의 ultrastructures에 귀중 한 정보를 제공할 수 있습니다. 이 연구에서는 난소 조직 preantral 낭과 격리 된 preantral 모 낭을 포함 하는 시뮬레이션된 microgravity의 효과 조사 하 사용 되었다여 포 개발 및 oocyte 성숙에.
이 연구에서 난소 조직 preantral 낭과 격리 된 preantral 모 낭을 포함 하 여 포 개발 및 oocyte 성숙에 시뮬레이션된 microgravity의 효과 조사 하기 위해 사용 되었다. 우리의 연구는 RWV 시뮬레이션된 microgravity 장치, 5% CO2 배양 기 안에 가로 축 중심 회전 효율적인 산소와 매우 낮은 전단 응력 시뮬레이션된 microgravity 상태를 제공합니다. 우리 각각 granulosa 셀의 oocytes, 개발에 대 한 지표로 (GDF-9)에 증식 세포 핵 항 원 (PCNA) 및 성장 감 별 법 요인 9 유전자의 식을 분석. 우리가 시연 PCNA와 GDF-9 식이 억제 되었다 granulosa 셀에 oocytes, 각각, RWV 장치에서 경작 하는 경우 그리고 우리 μ s에서 경작 하는 낭에 oocyte microvilli zona pellucida에서의 철수를 보였다 g 상태, GDF-9-결핍 마우스 낭16에서 비슷 했다.

<table><tbody><tr><td>ICR 마우스</td><td>SLRC Laoratory</td><td></td><td>14 일 된 암컷 마우스</td></tr><tr><td>L-15 매체</td><td>시그마</td><td>L1518</td><td>L- 글루타민, 액체, 멸균 여과, 세포 배양</td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td>에 적합 <td>Gibco</td><td>10100147</td><td>원산지 : 호주</td></tr><tr><td>페니실린 V 칼륨</td><td>시그마</td><td>1504503</td><td>미국 약전 (USP) 참조 표준 (USP)</td></tr><tr><td>스트렙토마이신 세스키설페이트 수화물</td><td>시그마</td><td>46754</td><td>분석 표준</td></tr><tr><td>범용&nbsp; 딸깍 하는 소리&nbsp; 펜 바늘</td><td>Penfine</td><td></td><td>12&times; 1/2" 0.33&배; 12mm</td></tr><tr><td>알긴산</td><td>시그마</td><td>W201502</td><td></td></tr><tr><td>알파 최소 필수 매체</td><td>Sigma</td><td>M0894</td><td>알파 변형, L-글루타민 포함, 리보뉴클레오시드, 데옥시리보뉴클레오시드 및 중탄산나트륨 없음, 분말, 세포 배양에 적합</td></tr><tr><td>인슐린-셀레늄-트랜스페린</td><td>인비트로겐</td><td>51500056</td><td>액체, 멸균 필터링, BioReagent, 세포 배양</td></tr><tr><td>에 적합GONAL-F</td><td>Merck Serono</td><td></td><td>주사용 재조합 모폴리트로핀 알파</td></tr><tr><td>일회용 고종횡비 회전 용기</td><td>Synthecon</td><td></td><td>10mL</td></tr><tr><td>배양 오일</td>, <td>Vitrolife</td><td></td><td>멸균 경량 파라핀 오일</td></tr>, <tr><td>알긴산 리아제</td><td>시그마</td><td>A1603</td><td>분말, >10,000 units/g, 고체</td></tr><tr><td>26 1/2 게이지 바늘</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35&회; 10mm 접시</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>생존력/세포 독성 분석 키트</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Bouin' s 용액</td><td>Sigma</td><td>HT10132</td><td></td></tr><tr><td>Horseradish peroxidase (HRP) - 활용 염소 anti-rabbit IgG (H + L)</td> <td>Jackson Immuno-Research Laboratories</td><td>111-035-003</td><td></td></tr><tr><td>3,3N-Diaminobenzidine Tertrahydrochloride</td><td>Beyotime</td><td>P0203</td><td></td></tr><tr><td>수성 장착 매체</td><td>Dako</td><td>C0563</td><td></td></tr><tr><td>토끼 anti-GDF-9 항체</td><td>Beijing Biosynthesis 생명 공학</td><td>BS-175R</td><td></td></tr><tr><td>토끼 항 PCNA 항체</td><td>Proteintech</td><td>24036-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>메틸렌 블루</td><td>시그마</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>투과 전자 현미경</td><td>Hitachi</td><td>H-7500</td><td></td></tr></tbody></table>

생체 외에서 마우스 시뮬레이션된 microgravity에서 preantral 모 낭의 성장

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

14 일 된 마우스 난소 조직과 같은 세 쥐에서 분리 된 preantral 낭 시뮬레이션된 microgravity 문화 시스템에 인 큐베이 팅 했다. 우리는 양적 뿌리 생존, 측정 된 여 포와 oocyte 지름으로 평가 하 고 시스템에서 생산 oocytes의 열 대권 외 시험. 우리 줄된 뿌리 생존을 관찰, 확산의 표현의 downregulation 세포 핵 항 원 및 성장 감 별 법 요인 9, granulosa 셀의 oocytes, 개발에 대 한 지표로 각각, 그리고 oocyte ultrastructural 시뮬레이션된 microgravity 조건 이상입니다. 시뮬레이션된 microgravity 실험 설치 개발 시험관에 oocyte/뿌리에에서 관련 된 메커니즘의 조사에 대 한 모델을 제공 하기 위해 최적화 해야 합니다.

그림 1A 는 선박 내부 오일 RWV는 보여준다. 난소 조직에의 한 조각 또는 캡슐화 된 여 포와 3 alginate 구슬 포함 150 µ L 매체의 물방울 기름에 투입 했다. 중간 방울 방울 생성 시뮬레이션된 microgravity (s-μg)의 상태는 분당 25 회전의 속도로 회전 오일 내에 액체 드래그 인해 터미널 속도의 상태에서 유지 되었다. 제어 실험에 난소 조직 또는 capsulated 낭 35 × 10 m m에 미네랄 오일으로 덮여 150 µ L 매체의 물방울에 교양 있었다 요리 (그림 1B) 생성 1-g 상태.
Preantral 여 포 개발에서 에 시험관에시뮬레이션된 microgravity의 효과 연구, 우리 교양 14 일 된 마우스 난소 조직 아래 1-g (제어 실험) 또는 s-µ g 조건. 우리는 H에서 건강 한 모 낭의 수 계산 &#38; E 문화 (그림 2)의 0, 2, 및 4 일 후 두 조건에서 섹션을 스테인드. 우리는 s-μg 상태에서 치료 하는 난소 조직에 뿌리 생존 1-그 보다 훨씬 낮은 발견 하루 2와 경작의 하루 4g 상태 (p &#60; 0.05, ANOVA). 또한, 우리는 그에 게 아무 PCNA 긍정적인 신호는 s-μg 조건 (그림 3)에서 난소 조직에서 발견 되었습니다을 발견 합니다. Alginate 구슬에 고립 된 preantral 낭의 문화에서 우리는 훨씬 더 많은 낭 살아남았다는 것 아래 1-밝혀g 조건 (76.8% ± 5.3%, n = 227) s-μg 조건 보다 (54.4% ± 6.7%, n = 249) 경작의 날 4 . 또한, oocyte 크기 했다 경작의 4 일 후 크게 증가 하지만 뿌리 크기 모두 중력 조건 (그림 4)에서 크게 증가. 그러나, 10% 죽은 granulosa 셀 (그림 5)와 낭 했다 크게 1-낮은g 조건 (81.5 ± 5%, n = 10) 보다 s-μg 조건 (90 ± 8%, n = 10) (p &#60; 0.05).
Oocyte 기능에 microgravity 시뮬레이션된의 효과 조사, 우리 oocyte 특정 마커 GDF-9의 표현을 검사 합니다. 우리가 시연 GDF-9 식 현저 하 게 다운 s-μg 조건 (그림 6) 난소 조직에 통제 했다. 또한, 우리 s-μg 조건 (그림 7) 문화의 하루 4 캡슐된 낭에 oocyte 세포의 빈번한 ultrastructural 이상 시연.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55641/55641fig1.jpg"> 
그림 1 : S-설치µg 1-g 조건 문화. (A) s-μg 회전 벽 배 고 움직이는 오일 내에서 지속적인 자유 낙하의 상태에서 문화 과목을 유지 하 여 만들었습니다. (B) 1-g 상태 난소 조직이 나 미네랄 오일으로 덮여 페 트리 접시의 표면에 모 낭을 경작 하 여 만들었습니다. 화살표는 매체의 물방울을 나타냅니다. 눈금 막대 = 1 cm. 이 수치는 장 외 에서 수정 17 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55641/55641fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55641/55641fig2.jpg"> 
그림 2 : S-µ g의 효과 난소 조직 문화에. 난소 조직의 (A) 섹션 1-교양g 또는 s-μg 0, 2, 및 4 일에 대 한 조건. 눈금 막대 50 µ m. (B) 뿌리 밀도 난소 조직 섹션에 =. 오차 막대 나타냅니다 1 SEM, *: p &#60; 0.05. 이 수치는 장 외 에서 수정 17 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55641/55641fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55641/55641fig3.jpg"> 
그림 3 : Immunohistochemistry PCNA의. PCNA 단백질 발현 granulosa 셀 난소 조직에 조사 되었다 1-교양g 또는 s-μg 0, 2, 및 4 일에 대 한 조건. 눈금 막대 = 50 µ m. 이 수치는 장 외 에서 수정 17 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55641/55641fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55641/55641fig4.jpg"> 
그림 4 : Alginate 구슬에 캡슐화 된 preantral 낭의 문화에 s-μg 의 효과. Preantral 낭의 (A) 형태 1-교양g 또는g s-μ 0 일 및 4 일에 대 한 조건. 눈금 막대 = 50 µ m. (B) Oocyte 직경 및 (C) 뿌리 직경 1 g와 s-μg 조건 사이의 비교 했다. 오차 막대 나타냅니다 1 SEM, *: p &#60; 0.05. 이 수치는 장 외 에서 수정 17 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55641/55641fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55641/55641fig5.jpg"> 
그림 5 : 세포 생존 능력 분석 실험. 대표 이미지에 400 배 확대 현미경으로 찍은 사진. 녹색에서 얼룩이 분석 결과 사용 Calcein 오전 라이브 셀을 시각화 하 고 EthD-1 죽은 세포의 핵을 시각화 하기 위해 빨간색으로 얼룩진. (A): ~ 100% 라이브 granulosa 셀 (녹색)과 여 포. (B): 10% 죽은 세포 (적색)로 서 라이브 granulosa 셀 (녹색), 여 포. 눈금 막대 = 50 µ m.이 수치는 장 외 에서 수정 17 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55641/55641fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55641/55641fig6.jpg"> 
그림 6 : Immunohistochemistry GDF-9. GDF-9 단백질 표정 난소 조직에 oocytes에서 시험 되었다 1-교양g 또는 s-μg 0, 2, 및 4 일에 대 한 조건. 눈금 막대 = 50 µ m. 이 수치는 장 외 에서 수정 17 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55641/55641fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55641/55641fig7.jpg"> 
그림 7 : 격리 preantral 낭의 ultrastructural 분석 양식 아래 1- g 또는 s-μ g 하루에 4 문화의 조건. (A)는 oocyte zona pellucida로 확장 microvilli (화살표)와 (1-g 조건). (B-F) 큰 그들 (*) multilamellar 시체와 oocytes (#), 지질 작은 물방울 (화살표), vacuolated 미토 콘 드리 아 cristae (화살표), 부족 및 각각 Golgi 기구 (화살표), 분산 (s-μg 조건). 소개할 oocyte; ZP: zona pellucida입니다. 이 수치는 장 외 에서 수정 17 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55641/55641fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

조직을 생성 하는 매우 유망한 기술 없이 문화 셀 시뮬레이션된 microgravity 조건에는 매트릭스를 사용 하 여 구성 합니다. 로타리 문화 시스템을 사용 하 여, 우리 난소 여 포 성장과 oocyte 성숙 여 포 생존, 형태학, 성장, 및 시뮬레이션된 microgravity 조건 oocyte 기능을 검사 합니다.

생체 외에서 마우스 시뮬레이션된 Microgravity에서 Preantral 모 낭의 성장

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

모사 미세중력 환경 하에서의 마우스 전안포 follicle의 인비트로(in vitro) 성장. 전체 과정은 네 단계로 나눌 수 있습니다. 첫 번째 단계에서는 실체현미경 하에서 바늘을 사용하여 난소로부터 follicle을 기계적으로 분리합니다.두 번째 단계로, 단일 난포를 피펫팅하여 각각의 알긴산 비드 중앙에 넣어 캡슐화합니다. 세 번째 단계로, 단일 난포가 포함된 알긴산 비드를 모의 미세중력을 생성하는 회전 배양 시스템의 배양액 방울로 옮깁니다. 네 번째 단계로, 알긴산 비드를 수거하고 Alginate lyase가 첨가된 배지에서 37 °C로 30분 동안 배양하여 알긴산 비드로부터 난포를 탈캡슐화합니다.난포 분리 및 캡슐화. 핸들링 배지(handling medium)를 사용하여 난소를 수집한 후, 난소를 센터드 웰 플레이트(centered well plate)에 놓습니다. 실체 현미경 하에서 두 개의 바늘을 사용하여 난소로부터 난포를 분리합니다.혈관막(vasomembrane)이 손상되지 않도록 주의하십시오. 배지 방울을 떨어뜨린 디쉬를 준비하고 그 위를 오일로 덮습니다. 준비된 디쉬로 난포를 옮깁니다.새 배지로 난포를 세척한 후 배지 방울로 옮깁니다. 배지 한 방울에는 난포 하나가 포함됩니다. 센터드 배양 접시를 준비하고 바깥쪽 원에 캡슐화 용액을 추가합니다.0.8% 알긴산 용액 바이알을 준비합니다. 디쉬 중앙에 알긴산 용액 0.5 µL를 추가합니다. 디쉬의 바깥쪽 원에 있는 캡슐화 용액 속으로 알긴산 용액 방울들을 떨어뜨립니다.난포를 디쉬 중앙에 있는 알긴산 용액으로 옮깁니다. 알긴산 용액으로 난포를 세척합니다. 용액의 부드러운 표면을 통해 각 알긴산 비드의 중앙으로 난포를 이동시킵니다.각 알지네이트 비드는 단일 난포를 포함하고 있습니다. 캡슐화 용액으로 알지네이트 비드를 헹구어 비드를 고형화합니다. 알지네이트 비드를 핸들링 배지가 담긴 새 디쉬로 옮깁니다.모의 미세중력 처리 하에서 캡슐화된 난포의 인 비트로(in vitro) 배양. 대조군의 경우, 새 디쉬에 150 milliliter 배양액을 추가하고 오일로 덮습니다. 알지네이트 비드 3개를 배양액 방울 속으로 옮깁니다.배양을 위해 디쉬를 이산화탄소 배양기에 넣고 배양합니다. 모사 미세중력 처리를 위해, 오일이 담긴 디쉬를 준비하고 포트 캡을 제거한 뒤, 용기가 거의 가득 찰 때까지 열린 포트를 통해 오일을 주입합니다. 오일에 배양액 50 milliter를 1회 추가합니다.알지네이트 비드 3개를 배지 액적 내로 옮깁니다. 개방된 포트 캡을 다시 닫습니다. 용기 내의 기포는 반드시 제거해야 합니다.시린지 포트 캡을 제거합니다. 오일이 채워진 시린지 두 개를 시린지 포트에 장착합니다. 시린지 포트 하단의 기포를 제거합니다.기포를 시린지로 끌어당긴 후, 다른 시린지를 통해 동일한 부피의 오일을 주입하십시오. 용기 내에 기포가 없는지 확인하십시오. 밸브를 닫고 시린지를 제거한 뒤 시린지 포트 캡을 다시 씌우십시오.알지네이트 비드를 포함한 4개의 용기를 이미 준비했습니다. 이제 용기들을 회전 베이스에 고정할 차례입니다. 배양액 방울이 균형 상태가 될 때까지 회전 속도를 조절하십시오.배양을 위해 용기와 베이스 모두를 이산화탄소 배양기로 옮깁니다. 배양액 교체 단계입니다. 개방 포트 캡을 제거하고, 알지네이트 비즈와 오일을 새 디쉬에 수집합니다.알긴산 비드를 찾아 핸들링 배지가 담긴 디쉬로 옮깁니다. 이전과 동일하게 혈관 배양 시스템을 다시 구축합니다. 난포 회수.포트 캡을 제거하고, 알지네이트 비드와 오일을 새 디시에 수집합니다. 알지네이트 리아제(alginate lyase)가 첨가된 핸들링 배지에서 37 °C로 30분 동안 배양하여 알지네이트 비드로부터 비드와 캡슐이 제거된 여포를 회수합니다.결과. 세포 생존율 분석 결과, 정상 중력 조건에서 배양된 단일 여포가 모사 미세중력 조건에서 배양된 여포보다 살아있는 세포가 더 많고 죽은 세포가 더 적은 것으로 나타났습니다.두 가지 중력 조건 모두에서 난포 크기가 유의미하게 증가했습니다. 결론. 본 방법은 모사 미세중력 조건 하에서 난자와 과립세포의 인 비트로(in vitro) 발달 과정에 관여하는 메커니즘을 연구하기 위한 모델을 제공합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

3D 섬유소 - 알지네이트요 interpenetrating 네트워크에 난소 대과의 캡슐에 대한 새로운 방법을 설명합니다. 이 시스템은 성숙 oocytes을 만들어 미숙 모공의 개발을 지원하기 위해 proteolytic 저하로 구조적 지원을 결합한 제품입니다. 이 방법은 확장을 제한하지 않고 세포 세포 접촉을 유지하기 위해 문화 셀 집계에 적용될 수 있습니다.

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우리는 축 발달과 병행하여 자기 조직화, 대칭 파괴 및 신장을 표시하는 마우스 배아 줄기 세포의 응집체를 생성하는 프로토콜을 개발했습니다. 이 기술을 사용하면 축 방향 발달 과정과 단층 배양에서 수행하기 어려운 세포 유형의 생성을 연구할 수 있습니다.

마우스 배아 줄기 세포의 집계의 세대 대칭 속보, 양극화 및 응급 집단 행동은보기가<em&gt; 체외</em

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생체 외에서 마우스 시뮬레이션된 Microgravity에서 Preantral 모 낭의 성장

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