생체 외에서 마우스 시뮬레이션된 Microgravity에서 Preantral 모 낭의 성장

모사 미세중력 환경 하에서의 마우스 전안포 follicle의 인비트로(in vitro) 성장. 전체 과정은 네 단계로 나눌 수 있습니다. 첫 번째 단계에서는 실체현미경 하에서 바늘을 사용하여 난소로부터 follicle을 기계적으로 분리합니다.

두 번째 단계로, 단일 난포를 피펫팅하여 각각의 알긴산 비드 중앙에 넣어 캡슐화합니다. 세 번째 단계로, 단일 난포가 포함된 알긴산 비드를 모의 미세중력을 생성하는 회전 배양 시스템의 배양액 방울로 옮깁니다. 네 번째 단계로, 알긴산 비드를 수거하고 Alginate lyase가 첨가된 배지에서 37 °C로 30분 동안 배양하여 알긴산 비드로부터 난포를 탈캡슐화합니다.

난포 분리 및 캡슐화. 핸들링 배지(handling medium)를 사용하여 난소를 수집한 후, 난소를 센터드 웰 플레이트(centered well plate)에 놓습니다. 실체 현미경 하에서 두 개의 바늘을 사용하여 난소로부터 난포를 분리합니다.

혈관막(vasomembrane)이 손상되지 않도록 주의하십시오. 배지 방울을 떨어뜨린 디쉬를 준비하고 그 위를 오일로 덮습니다. 준비된 디쉬로 난포를 옮깁니다.

새 배지로 난포를 세척한 후 배지 방울로 옮깁니다. 배지 한 방울에는 난포 하나가 포함됩니다. 센터드 배양 접시를 준비하고 바깥쪽 원에 캡슐화 용액을 추가합니다.

0.8% 알긴산 용액 바이알을 준비합니다. 디쉬 중앙에 알긴산 용액 0.5 µL를 추가합니다. 디쉬의 바깥쪽 원에 있는 캡슐화 용액 속으로 알긴산 용액 방울들을 떨어뜨립니다.

난포를 디쉬 중앙에 있는 알긴산 용액으로 옮깁니다. 알긴산 용액으로 난포를 세척합니다. 용액의 부드러운 표면을 통해 각 알긴산 비드의 중앙으로 난포를 이동시킵니다.

각 알지네이트 비드는 단일 난포를 포함하고 있습니다. 캡슐화 용액으로 알지네이트 비드를 헹구어 비드를 고형화합니다. 알지네이트 비드를 핸들링 배지가 담긴 새 디쉬로 옮깁니다.

모의 미세중력 처리 하에서 캡슐화된 난포의 인 비트로(in vitro) 배양. 대조군의 경우, 새 디쉬에 150 milliliter 배양액을 추가하고 오일로 덮습니다. 알지네이트 비드 3개를 배양액 방울 속으로 옮깁니다.

배양을 위해 디쉬를 이산화탄소 배양기에 넣고 배양합니다. 모사 미세중력 처리를 위해, 오일이 담긴 디쉬를 준비하고 포트 캡을 제거한 뒤, 용기가 거의 가득 찰 때까지 열린 포트를 통해 오일을 주입합니다. 오일에 배양액 50 milliter를 1회 추가합니다.

알지네이트 비드 3개를 배지 액적 내로 옮깁니다. 개방된 포트 캡을 다시 닫습니다. 용기 내의 기포는 반드시 제거해야 합니다.

시린지 포트 캡을 제거합니다. 오일이 채워진 시린지 두 개를 시린지 포트에 장착합니다. 시린지 포트 하단의 기포를 제거합니다.

기포를 시린지로 끌어당긴 후, 다른 시린지를 통해 동일한 부피의 오일을 주입하십시오. 용기 내에 기포가 없는지 확인하십시오. 밸브를 닫고 시린지를 제거한 뒤 시린지 포트 캡을 다시 씌우십시오.

알지네이트 비드를 포함한 4개의 용기를 이미 준비했습니다. 이제 용기들을 회전 베이스에 고정할 차례입니다. 배양액 방울이 균형 상태가 될 때까지 회전 속도를 조절하십시오.

배양을 위해 용기와 베이스 모두를 이산화탄소 배양기로 옮깁니다. 배양액 교체 단계입니다. 개방 포트 캡을 제거하고, 알지네이트 비즈와 오일을 새 디쉬에 수집합니다.

알긴산 비드를 찾아 핸들링 배지가 담긴 디쉬로 옮깁니다. 이전과 동일하게 혈관 배양 시스템을 다시 구축합니다. 난포 회수.

포트 캡을 제거하고, 알지네이트 비드와 오일을 새 디시에 수집합니다. 알지네이트 리아제(alginate lyase)가 첨가된 핸들링 배지에서 37 °C로 30분 동안 배양하여 알지네이트 비드로부터 비드와 캡슐이 제거된 여포를 회수합니다.결과. 세포 생존율 분석 결과, 정상 중력 조건에서 배양된 단일 여포가 모사 미세중력 조건에서 배양된 여포보다 살아있는 세포가 더 많고 죽은 세포가 더 적은 것으로 나타났습니다.

두 가지 중력 조건 모두에서 난포 크기가 유의미하게 증가했습니다. 결론. 본 방법은 모사 미세중력 조건 하에서 난자와 과립세포의 인 비트로(in vitro) 발달 과정에 관여하는 메커니즘을 연구하기 위한 모델을 제공합니다.