두 개의 상보적인 세포 동기화 프로토콜에 의한 세포주기 조절 유전자 발굴 연구

이 프로토콜의 전반적인 목표는 세포 주기 특이적 방식으로 유전자 발현을 분석하기 위한 컨텍스트를 제공하는 것입니다. 이 방법은 항암 치료뿐만 아니라 악성 형질전환의 기초가 되는 세포주기 의존적 전사 사건과 관련된 암 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 두 번째 조건과 화학 요법에 노출된 후 모두에서 세포주기 특정 유전자 발현 패턴을 정확하게 확립한다는 것입니다.

이 실험에는 U2OS 셀이 사용되며, 작업 시간 동안 후속 단계를 수행할 수 있도록 저녁 7시경에 100mm 접시에 파종해야 합니다. 섭씨 37도의 가습된 분위기에서 5%CO2로 24시간 동안 접시를 배양하여 세포가 부착되도록 합니다.

다음 날에는 세포를 검사하여 50% 밀도에 있는지 확인합니다. 티미딘 블록의 경우 각 100mm 배양 접시에 갓 준비한 200밀리몰 티미딘 스톡을 100마이크로리터씩 추가합니다. 섭씨 37도의 가습된 분위기에서 5%CO2로 Thymidine으로 세포를 20시간 동안 배양합니다.

다음 날 오후 3시경에 Thymidine이 함유된 성장 배지를 제거하여 Thymidine 블록에서 세포를 방출합니다. 예열된 1X PBS로 세포를 두 번 세척합니다.

그런 다음 각 100mm 접시에 100ml의 완전한 매체를 추가합니다. 섭씨 37도에서 5시간 동안 세포를 배양합니다. 유사 분열 세포 정지를 위해 노코다졸을 밀리리터당 50 나노 그램의 최종 농도로 첨가하십시오.

노코다졸로 세포를 10-11시간 이상 배양하지 마십시오. 다음 날 아침 6시에서 7시 사이에 현미경으로 세포를 검사하여 둥근 모양으로 표시된 G2-M에서 실제로 막혀 있는지 확인합니다.

각 플레이트를 흔들어 유사분열 세포를 분리하고, 각 100mm 플레이트에서 분리된 세포와 함께 성장 배지가 포함된 노코다졸을 부드럽게 피펫팅합니다. 모든 접시의 유사분열 세포를 50밀리리터 멸균 튜브에 결합합니다. 원심분리기를 섭씨 4도에서 5분간 g을 300회 사용합니다.

차가운 1X PBS를 첨가하여 세포를 두 번 세척한 다음 원심분리합니다. 두 번째 세척에서 PBS를 제거한 후 완전한 배양 배지에 유사분열 세포를 다시 현탁시킵니다. RNA 추출을 위해 2밀리리터를 절약하고 0시 시점에 대한 FACS 분석을 위해 2밀리리터를 절약할 수 있습니다.

6개의 웰 플레이트에서 후속 시점을 위해 남아 있는 유사분열 세포를 다시 플레이플레이트합니다. 이 절차를 시작하려면 6개의 웰 플레이트에서 웰당 6번째 U2OS 셀에 0.25배 10을 파딩합니다. 각 6개의 웰 플레이트의 표지에 각 웰에 대한 실험 조건을 씁니다.

예를 들어, 치료되지 않았거나 약물 농도와 시간대가 다른 상태로 치료되었습니다. 6개의 웰 플레이트를 밤새 배양하여 세포가 부착되도록 합니다. 다음 날 아침에 세포를 검사하여 50% 포화도에 있는지 확인합니다.

웰에서 완전한 배지를 제거하고 웰당 2ml의 예열된 FBS가 없는 DMEM-글루타민 배지를 추가합니다. 추가로 24시간 동안 세포를 배양합니다. hydroxyurea로 세포를 정지시키려면 우물에서 배지를 제거하고 완전한 배지를 포함하는 새로 준비된 4마이크로몰 hydroxyurea로 교체하십시오.

24시간 동안 배지를 함유한 하이드록시우레아(hydroxyurea)에서 세포를 배양합니다. hydroxyurea 매개 정지에서 세포를 방출하기 전에 세포가 정지되었는지 확인하십시오. 웰에서 하이드록시우레아가 함유된 배지를 제거하고 예열된 1X PBS로 웰을 두 번 헹굽니다.

두 번째 세척에서 PBS를 제거한 후 웰당 2ml의 완전한 배지를 추가합니다. 검체가 채취될 때까지 플레이트를 인큐베이터에 보관하십시오. 두 동기화 프로토콜의 샘플은 FACS 분석 및 RNA 추출을 위해 동일한 방식으로 수집됩니다.

FACS 분석의 경우, 2밀리리터의 예열된 1X PBS로 각 웰을 헹군 다음 0.3밀리리터의 예열된 트립신-EDTA 용액을 첨가하여 세포를 분리합니다. 5분 후, 1ml의 완전한 배지를 첨가하여 트립신-EDTA를 비활성화합니다. 각 샘플을 별도의 15ml 튜브에 수집합니다.

300배 G의 원심분리기 세포를 실온에서 5분 동안 사용합니다. 상층액을 버리고 1X PBS로 세척한 후 다시 탈수합니다. PBS를 제거하고 세포 펠릿을 저장합니다.

세포를 고정하기 위해 각 세포 펠릿을 1ml의 냉각된 70% 에탄올에 부드럽게 와류로 다시 현탁시킵니다. 프로피듐 요오드화물 염색 및 FACS 분석 전에 약 15분 동안 세포를 얼음 위에 놓습니다. RNA 추출을 위해 매체를 제거하고 예열된 1X PBS 2밀리리터로 각 웰을 헹굽니다.

플레이트를 안전 캐비닛으로 옮기고 웰당 1ml의 적절한 RNA 분리 시약을 추가합니다. 피펫을 위아래로 피펫으로 세포를 피펫 및 용해한 다음 각 세포 용해물을 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 이동합니다. 실온에서 5분 동안 배양합니다.

RNA 분리 시약의 샘플이 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브를 냉동실에서 회수하고 화학 물질 안전 캐비닛 내부의 실온에서 해동하여 RNA 추출 절차를 시작합니다. 각 샘플에 400마이크로리터의 클로로포름을 추가하고 완전히 혼합될 때까지 와류 없이 세게 흔듭니다. 샘플을 실온에서 5분 동안 배양합니다.

벤치탑 마이크로 원심분리기에서 튜브를 15분 동안 원심분리합니다. 각 샘플의 수성상을 새로운 1.5 밀리미터 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 100% 에탄올의 1개 부피를 천천히 한 방울씩 첨가하여 혼합하는 동안 수성에 한 방울씩 첨가합니다.

원심분리하지 마십시오. 상용 RNA mini-prep kit에서 제공하는 2밀리리터 수집 튜브의 스핀 컬럼으로 형성되었을 수 있는 침전물을 포함하여 각 샘플을 최대 700마이크로리터까지 옮기고 뚜껑을 닫습니다. 15초 동안 원심분리기를 사용합니다.

플로우 스루를 폐기합니다. 샘플당 700마이크로리터 이상에서 시작하는 경우 나머지 샘플을 스핀 컬럼으로 옮기고 다시 원심분리합니다. 제조업체의 지침에 따라 RNA를 세척한 후 30-40마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물을 스핀 컬럼에 피펫팅하고 실온에서 1분 동안 원심분리하여 각 샘플을 용리시킵니다.

흡광도 측정을 통해 샘플의 RNA 농도와 순도를 측정합니다. 유전자 발현 분석에 사용할 때까지 RNA 샘플을 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. Thymidine-Nocodazole 프로토콜에 의한 처리는 m상 진입에서 U2OS 세포를 정지시키고 유세포 분석 분석에서 볼 수 있듯이 G1을 통해 S 기로 동시에 진행되는 세포 집단을 제공합니다.

Hydroxyurea 프로토콜에 의한 처리는 G1/S 경계에서 세포를 정지시킵니다. 방출 시 세포는 S 및 G2 단계를 통해 동시에 전이됩니다. Thymidine-Nocodazole 프로토콜은 G1 단계에서 최대 발현을 가진 유전자의 mRNA 프로파일을 분석하는 데 가장 적합합니다.

E2F1 표현식에 대해 표시된 바와 같습니다. 대조적으로, Hydroxyurea 프로토콜은 E2F7 발현에 대해 예시된 바와 같이 S 또는 G2에서 우선적으로 발현되는 유전자 분석에 더 잘 작동합니다. 세포주기는 일반적으로 항종양 약물에 의해 교란되며, 이는 하이드록시우레아 동기화 세포에서 미토마이신 C가 영구적인 G2 상 정지를 가한 것으로 나타났습니다.

세포 동기화는 항종양제에 반응하는 유전자와 항종양제에 의해 가해지는 세포주기 교란에 전적으로 영향을 받는 유전자를 구별하는 데 도움이 됩니다(예: 미토마이신 C 처리 후 E2F1 mRNA 수치 감소는 세포주기 역학에 대한 약물의 간접적인 영향일 가능성이 있음). 대조적으로, 미토마이신 C 치료 후 p21-Cip1 mRNA 발현의 정점은 이 약물에 의해 유발된 전사 프로그램의 직접적인 결과입니다. 이 절차에 따라 특정 세포주기 단계에 영향을 미치는 전반적인 유전자 발현 변화를 밝히기 위해 게놈 전체 전사체 및 단백질체 분석을 수행할 수 있습니다.

두 번째 상태 또는 항종양 치료 중. 이 동영상을 시청한 후에는 동기화된 세포 배양에서 유전자 발현 분석을 수행하는 데 필요한 절차를 잘 이해하게 될 것입니다. 프로피듐 요오드화물 또는 RNA 분리 시약으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑 및 화학 물질 안전 캐비닛과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.