Name: 심사 분석 실험 소설 내 피 레 귤 레이 터 염증 반응에 관여 하 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 50 s
Description: 학습하세요 혈관 내피 세포에서 염증 반응을 조절하는 새로운 조절 인자를 특성화하는 방법을. 백혈구 이동과 염증 질환 치료 전략 개발에 활용됩니다.

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이 작품은 정부의 드 Economía y Competitividad (MINECO) 및 Instituto de에 의해 지원 되었다 건배 카를로스 3 세 (ISCIII) (보조금 번호 IERPY 1149/16 앨 러 배 마; MPY 1410/09 S. Hortelano에); 의해 Fondo 드 Investigación en 건배 (FIS) (S. Hortelano PI11.0036-PI14.0055 번호 부여)을 통해 MINECO. S. Herranz IERPY 1149/16 ISCIII에서 지원 되었다.

1. 내 피 세포 배양 <ol><ol><li>코트 100 m m 조직 문화 접시 2.5 mL 젤라틴을 조직 배양 플레이트 취급 <li>솔루션 (증류수에 압력가 마로 소독, 0.1% 젤라틴) 37 ° C에서 30 분 동안,이 필요한 잘 형식으로 추정 될 수 있습니다. 발음 젤라틴 솔루션 및 조직 문화 후드에 건조를 접시에 두고.</li>
	</ol></li> <li>조직 배양 조건 <ol><li>(37 ° C, 습도 95%, 5% CO 2) 생물 인큐베이터 안에 MLEC 04 세포 배양. Dulbecco의 완전 한 미디어에 셀 성장 &#39; s 수정이 글 매체: 영양소 혼합 F-12 (DMEM/F-12) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 및 100 단위/mL 페니실린과 100 µ g/mL 스 (P/S)와 보충.</li>
		<li>표준 Neubauer 챔버 메서드에서 셀의 개수 고 2-11 x 10 4 셀/c m 2의 낮은 밀도에서 완전 한 미디어 10 mL에서에서 100 m m 젤라틴 처리 번호판 MLEC 04 셀을 추가 합니다. 합류를 도달할 때 셀 1: 3을 분할. 
		참고: 일반적으로이 2 ~ 3 일 후에 문화 발생.</li>
		<li>Subculture 멸 균 인산 염 버퍼 염 분 (PBS) 2 mL 트립 신-EDTA 솔루션 (0.25 %trypsin, 5 mM EDTA)를 추가 하 여 다음와 37에 3 분 동안 품 어 10 mL와 함께 접시를 세척 하 여 셀 ° c.</li>
		<li>트립 신-EDTA 반응 중지 하 고 10 mL 전체 미디어를 추가 하 여 일시 중단 된 세포를 복구. 스핀 다운 셀 (300 x g, 5 분)는 상쾌한, 적절 하 게 완전 한 미디어와 subculture에 셀룰러 펠 릿 resuspend.</li>
	</ol></li></ol> 2. LPS 치료 및 중재자 <ol><li>접시 완전 한 미디어 다음 잘 형식으로 하위 합류 MLEC-04 셀: 셀/잘에 6-잘 접시와 2.5 10 5 셀/96 잘 접시에 잘 x 7 x 10 5.</li>
	<li>셀 인큐베이터 (37 ° C, 습도 95%, 5% CO 2)에서 6 h에 대 한 문화를 품 어. 셀 불완전 한 미디어 (DMEM F12, P/S)에 전환 하 고 동기화 하 고 세포의 활동을 줄일 (에) 하룻밤 두고.</li>
	<li>미디어를 제거 하 고 (또는 없이) 내 피 세포를 배양 하 여 새로운 약물 화합물을 테스트 마약 문제 (예: DT 10) 불완전 한 미디어 (30 분, 37 ° C)에 희석; 추가 1.4 mL/6 잘 플레이트 또는 0.14 잘 mL/잘 96 잘 접시).</li>
	<li>각 분석 결과에 지정 된 시간 동안 LPS 인큐베이션 미디어 (100 ng/mL, 최종 농도)를 추가 하 여 셀을 도전 한다. PBS를 사용 하 여 컨트롤.</li>
</ol> 3. 실시간 정량 Pcr에 의해 활성화 Endothelium에 Transcriptional 프로필의 평가 <ol><li>6 잘 문화에서 하위 합류에 시드 MLEC-04 셀 접시 (7 x 10 5 셀/잘). 6 h (37 ° C, 습도 95%, 5% CO 2)에 대 한 품 어 고 이후에 혈 청 기아 (에 품 어).</li>
	<li>미디어를 제거 하 고 치료 (또는) 내 피 세포의 약 문화 (30 분, 37 ° C를 품 어) 불완전 한 미디어에 희석; 1.4 mL을 추가/6 잘 플레이트 (30 분, 37 ° C)에 대 한 잘 취급 하지 않습니다.</li>
	<li>(2.3 단계에서 설명) 하는 대로 100 ng/mL LPS incubated 미디어를 추가 하 여 셀을 도전 6 h. 차가운 PBS로 두번 세척 하 여 반응을 중지에 품 어 하 고 샘플 처리까지-80 ° C에서 번호판을 유지.</li>
	<li>RNA 추출 <ol><li>판 해 동 고 1 mL/잘 RNA 추출 버퍼 (38% 페 놀 및 0.8 M guanidinium isothiocyanate; 자료의 표 참조)를 추가 합니다. 1.5 mL 튜브에 동요와 수집 homogenate에서 실 온 (RT)에서 30 분 두고.</li>
		<li>200 µ L 클로 프롬을 추가 하 고 부드럽게 RT 및 분리기 (11,600 g, 15 분, 4 ° C)에서 3 분 15 미 품에 대 한 선동.</li>
		<li>다른 1.5 mL 튜브에 수성 단계를 전송. 500 µ L 소 프로 파 놀 RT 한 다음 원심 분리 (11600 x g, 4 ° C)에서 10 분 부 화 뒤를 추가 하 여 RNA를 침전.</li>
		<li>는 상쾌한 삭제 하 고 소용돌이 동요와 다음 원심 분리 (7500 x g, 4 ° C)에 의해 75% 에탄올과 펠 릿을 세척.</li>
		<li>펠 릿 건조 하 고 25 µ L 순수한 H 2 O 샘플 처리까지-80 ° C에 55 ° C. 유지 RNA에서 10 분 동안 배양 하 여 RNA를 solubilize.</li>
	</ol></li> <li>수량 및 RNA의 순도 <ol><li>260에서 샘플의 흡 광도 측정 하 여 RNA 농도 계량 한 분 광 광도 계에 nm (재료의 표 참조).</li>
		<li>측정 230 nm 및 280 nm RNA의 순도 확인. 
		참고: 260/280에 비율은 단백질 또는 페 놀 오염을 나타냅니다. 2 가까운 비율 허용 됩니다. 260/230에서 비율 EDTA, 탄수화물 또는 페 놀 오염 물질을 나타냅니다. 2.0-2.2 사이의 값을 사용할 수 있습니다.</li>
	</ol></li> <li>검사 RNA 무결성 <ol><li>총 RNA는 RNA의 실행 2 µ g 1.5 %agarose 젤을 변성 시키기에 사다리, 젤 설명서 시스템에 시각화 (재료의 표 참조). 
		참고: 명확 하 고 날카로운 28S와 18S rRNA 밴드의 2:1 비율 그대로 RNA를 나타냅니다. 듯한 모양으로 RNA 해결을 부분적으로 저하.</li>
	</ol></li> <li>실시간 정량 <ol><li>보완 DNA (cDNA) 표준에 따라 단일 좌초 RNA에서 합성 프로토콜 (참조 테이블의 재료) 11.</li>
	</ol></li> <li>실시간 정량 평가 진 식 <ol><li>각 샘플에 대 한 반응 혼합물 준비: 믹스 2 µ L cDNA, 7 µ L 형광 화합물, 300 nM 앞으로 뇌관, 및 300 nM 역방향 뇌관 (표 1)는 13 µ L의 최종 볼륨 96-잘 반응 접시에 추가 하 고 (재료의 표 참조).</li>
		<li>광학 접착제 커버, 원심 분리기 (300 x g, 1 분)와 함께 접시를 봉인 하 고 실시간 PCR 시스템에 반응 실행 (뜨거운 시작 20 95 ° C s 40 주기 다음: 95 ° C 3 s와 30에 대 한 60 ° C에 대 한 s) (재료의 표 참조).</li>
		<li>상대적인 정량 비교 방법 2를 사용 하 여 결과 분석 -ΔΔCt 내부 관리 유전자 glyceraldehyde-3-인산 효소 (GAPDH) 또는 산 성 ribosomal phosphoprotein P0 (36B4) 12 .</li>
	</ol></li></ol> 4. Cytometry 내 피 정품 인증 평가 <ol><li>2 절에서 설명한 조건에 따라 MLEC 04 셀 고 cytometry에 의해 내 피 표면 단백질의 변화를 평가.</li>
	<li>분리 후 트립 신-EDTA 방법에 설명 된 LPS 자극의 6 h 셀 1.2.3, 단계 그리고 4 불완전 한 미디어와 함께 씻어 ° c.</li>
	<li>는 Neubauer 챔버 메서드를 사용 하 여 셀 고 10 x 10 4의 세포 u-하단 96 잘 접시 합니다. 원래 위치로 빠른 복구에 위에서 손목의 스냅 원심 분리기 (300 x g, 5 분) 및 180 °에 의해 표면에 뜨는 폐기.</li>
	<li>셀에 불완전 한 미디어 (10 µ g/mL, 최종 농도)에 희석 된 항 체의 50 µ L을 추가 하 고 (30 분, 4 ° C)를 품 어.</li>
	<li>씻어 두 번 w 셀ith에 설명 된 절차를 수행 하는 불완전 한 미디어 4.3, 단계 및 해당 이차 항 체의 10 µ g/mL에서 50 µ L로 품 어 결합 FITC 또는 유사한 켤레 (30 분, 어두운 공간에서 4 ° C).</li>
	<li>씻어 셀 한 번 PBS 세척 뒤 불완전 한 미디어. 1 mL 피 펫 팁을 사용 하 여 300 µ L PBS를 가진 세포를 복구 하 고 cytometry 튜브에.</li>
	<li>흐름 cytometry 시스템에 샘플을 평가 (재료의 표 참조). 앞으로 및 측면 산란 매개 변수 셀 인구를 조정 합니다. 게이트의 인구입니다. 게이츠 세포 isotype 컨트롤과 incubated에서 부정적인 컨트롤에 따라 조정 합니다. 분석 결과 긍정적인 세포의 백분율 또는 형광 강도 8 뜻.</li>
</ol> 5. 서쪽 오 점 내 피 정품 인증 평가 <ol><li>씨앗 6-잘 배양 배지 (7 x 10 5 셀/잘) 하위 합류에 있는 피 고 2에 설명 된 대로 LPS와 치료. 다음 서쪽 오 점 프로토콜에 의해 염증 성 단백질 표정 분석.</li>
	<li>내 피 응답의 다양 한 측면을 명료 하 게 다른 시간 지점에서 LPS 자극을 중지: <ol><li>LPS 자극의 6 h 후 염증 성 단백질 프로필 확인.</li>
		<li>60 분 기간을 통해 매 15 분을 신호 하는 셀을 결정.</li>
	</ol></li> <li>두 경우 모두, 차가운 PBS로 두번 세척 하 여 반응을 중지 하 고 샘플 처리까지-80 ° C에서 샘플을 저장할.</li>
	<li>Lyse 세포 및 단백질 추출 <ol><li>추가 200 µ L 세포의 용 해 버퍼 각 잘 (1% 비 이온 계면 활성, 10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, 염화 나트륨 150 m m, 30mm 나트륨 파이 인산, 50mm 나트륨 불 화물에서 2.1 m m 나트륨 orthovanadate를 pH 7.6, 프로 테아 제 억제 물 칵테일 보충) (자료의 표 참조).</li>
		<li>동요에서 4 ° C에서 15 분 웰 스 피 펫 팁을 긁 고 1.5 mL 튜브에 homogenate 수집을 품 어.</li>
		<li>11600 x g에서 튜브 4 원심 ° c.</li>
		<li>처리까지-80 ° C에서 깨끗 한 1.5 mL 튜브에는 상쾌한 저장.</li>
	</ol></li> <li>측정 bicinchoninic 산 분석 결과 표준 다음에 의해 단백질 농도 프로토콜 (재료의 표 참조) 13.</li>
	<li>는 0.1% 나트륨 라우릴 황산 염, 10 %polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS-PAGE) 14의 표준 기술에 의해 총 단백질 각 샘플에 대 한 lysate의 30 µ g을 해결. 샘플 10 m m β-mercaptoethanol (줄이는 조건)와 함께 또는 없이 실행 (조건 비 감소) 관심사의 단백질을 검출 하는 데 사용 하는 항 체에 따라.</li>
	<li>표준 절차를 사용 하 여 0.45 µ m 기 공 크기와 polyvinylidene difluoride (PVDF) 전송 막 polyacrylamide 젤에서 분리 된 단백질 전송.</li>
	<li>전이, 후 막 PBS, 0.1% 폴-20 (PBS-T)로 두 번 세척 하 고 추가 20 mL 2% BSA PBS-T 검색된 phosphoproteins 또는 PBS-T 아래 동요 (90 분, 총 단백질에에서 5% 비 지방 건조 우유에에서 희석 하 여 불특정 바인딩 사이트 차단 RT).</li>
	<li>권장된 농도에서 적절 한 차단 버퍼의 10 mL에 선택 된 항 체를 희석 하 고 동요 (ON, 4 ° C)에서 막 품 어. 또는 막 밀폐 비닐 봉지에 놓고 희석된 항 체의 5 mL을 사용.</li>
	<li>다음 날 씻어 3 막 (초과 PBS-T, 15 분, RT) 번.</li>
	<li>동요 (30 분, RT) 10 mL와 함께 특 파 원 이차 항 체의 아래 막 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP)는 적절 한 차단 버퍼에서 1:10,000에 희석에 바인딩된 품.</li>
	<li>동요 (초과 PBS-T, 15 분, RT) 아래 세 번 막 세척.</li>
	<li>과산화 효소 기질 강화 화학 (ECL)의 0.1 mL/c m 2으로 1 분 동안 막 품 어. 두 개의 투명 한 플라스틱 시트, 사이 물기 막 놓고 Charged-Coupled 장치 카메라 (CCD)를 포함 하는 화학 탐지 시스템에 삽입.
	<ol><li>CCD 카메라를 사용 하 여 신호 및 누적 프로그램과 이미지를 기록 하는 소프트웨어 검색 (이미지 표시 누적된 신호 마다 30 s 노출에서 총 15 분 동안).</li>
	</ol></li> <li>Densitometry 15 사용자 가이드 설명 된 프로토콜을 따르고 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 밴드 강도 계량.
	<ol><li>ImageJ 소프트웨어에서 샘플을 열고 사각형 선택 도구와 관심의 밴드를 선택 합니다.</li>
		<li>첫 번째 레인과 언론 플롯 프로필 음모를 차선으로 선택.</li>
		<li>직선 선택과 봉우리의 영역 구분.</li>
		<li>각 피크의 내부를 클릭 하 여 각 밴드의 크기를 측정.</li>
		<li>단백질 제어 (β-말라, tubulin, 등)를 로드 관련 결과 나타냅니다.</li>
	</ol></li></ol> 6. 내 피 요소 접착 분석 실험에 의해 백혈구 활성화에서 발표 평가 <ol><li>내 피 조절된 미디어 얻기.
	<ol><li>섹션 2에에서 표시 된 대로 MLEC-04 세포를 치료 하 고 LPS 24 시간 자극 후 표면에 뜨는 문화 수집 (100 ng/mL).</li>
		<li>대우 MLEC-04 세포 분리기 (600 x g)에서 바른된 미디어를 수집합니다. 사용까지-80 ° C에서 0.5 mL aliquots에는 상쾌한 유지.</li>
	</ol></li> <li>백혈구 접착 분석 결과 <ol><li>50 µ L/잘 선택 된 세포 외 기질 단백질 (콜라겐, 0.1 m M 초 산에 희석)를 제외 하 고 PBS에 희석의 96 잘 접시 코트: fibronectin (1-10 µ g/mL ), laminin (1-10 µ g/mL)와 교원 질 유형 I (10-40 µ g/mL). 4 ° c.에 두고 ON</li>
		<li>코팅된 미디어를 삭제 하 고 150 µ L PBS, 1 %BSA 열 비활성화 (1 분, 100 ° C) 실시간에서 90 분으로 우물에 난다 바인딩 사이트 차단</li>
		<li>PBS로 두 번 우물을 세척 하 고 우물에 100 µ L 이전 수집의 내 피 조절 미디어 (6.1 단원)을 추가. 
		참고: 판 접착 시험을 수행 하기 위한 준비가.</li>
		<li>문화 (37 ° C, 습도 95%, 5% CO 2) 생물 인큐베이터에서 마우스 monocyte macrophage 셀 라인 J774와 로스웰 파크 기념 연구소 매체 (RPMI), 10 %FBS, 1 %P / s. 
		참고: J774 세포 성장 정지에서.</li>
		<li>15 mL 튜브 및 원심 분리기 (300 x g, 5 분)로 J774 셀을 수집합니다. 삭제는 상쾌한 고 10 mL 혈 청 자유로운 미디어와 셀룰러 펠 릿 resuspend. Neubauer 챔버에 세포를 계산 합니다. (300 x g, 5 분) 세포를 원심, 삭제는 상쾌한 고 50 µ L 미디어 당 15 x 10 4 J774 세포에서 혈 청 자유로운 미디어에 셀 resuspend.</li>
		<li>추가 15 x 10 4 J774 셀 각 50 µ L 세럼 무료 미디어에서 잘 하 고 CO 2 셀 인큐베이터에서 37 ° C에서 1 h 뒤에 4 ° C에서 15 분 동안 품 어.</li>
		<li>따뜻한 PBS를 추가 하 여 우물을 두 번, 부드럽게 씻어; 원심 (300 x g, 5 분) 하 고 원래 위치로 빠른 복구에 탑에서 손목의 180 ° 스냅 하 여 상쾌한 삭제. 연결 된 셀을 수정PBS에서 100 µ L/4 %paraformaldehyde (PFA)의 음을 추가 하 여 s (10 분, RT)을 품 어와.</li>
		<li>부드럽게 미디어를 삭제 하 고 부드럽게 실시간 삭제 미디어에서 2 분에 대 한 PBS에 2% 메탄올을 가진 세포를 permeabilize 90에 대 한 20% 메탄올에서 50 µ L / 0.5% 크리스탈 바이올렛의 우물을 추가 하 여 셀을 얼룩 실시간에 s</li>
		<li>풍부한 실행 물과 함께 접시를 세척, 초과 액체를 삭제 하 고 건조를 두고. 디지털 카메라는 가벼운 현미경에 결합에 의해 연결 된 셀을 보고.</li>
		<li>셀 100 µ L/0.1 M 나트륨 구 연산 염, 50% 에탄올의 우물을 추가 하 여 얼룩을 희석. 더 높은 리간드 농도와 코팅 545 nm 및 흡 광도 또는 세포 접착으로 100% 고려 하 여 접착의 비율의 임의의 단위로 결과 도달 우물에서 흡 광도 측정</li></ol></li></ol> 7. 백혈구 Endothelium 공동 접착 분석 결과 내 피 정품 인증 테스트 <ol><li>96 잘 접시에 MLEC-04 셀 섹션 2에에서 설명 된 대로 고 LPS (6, 37 ° C)와 품 어.</li>
	<li>J774 셀 Carboxyfluorescein Succinimidyl 에스테 르 (CSFE)와 라벨을 붙일.
	6.2.5에서 절차를 수행 하는 PBS에 <ol><li>워시는 J774 셀. 수는 Neubauer에 의해 셀 방법 챔버 1 x 10 6 셀/mL PBS, 0.1 %BSA resuspend.</li>
		<li>37 ° C. 추가 5 mL 불완전 한 미디어에서 20 분 (5 µ M, 최종 농도) CFSE와 셀을 품 어 고 (5 분, 4 ° C)를 품 어.</li>
		<li>6.2.5에 설명 된 대로 불완전 한 미디어로 한 번 씻어. 15 x 10 4 셀/100 µ L에서 resuspend, 공동 접착 시험 진행.</li>
	</ol></li> <li>Endothelium 치료 후 씻어 3 배 불완전 한 미디어와 우물. 내 피-코팅 잘 각 CFSE J774 셀 (15 x 10 4 셀/100 µ L)를 추가 합니다. 37에서 60 분 다음 4 ° C에서 10 분 동안 접시를 품 어 ° c.</li>
	<li>우물 6.2.7에 설명 된 대로, 부드럽게 세척., 따뜻하게 PBS를 사용 하 여 및 다음 두 가지 방법으로 내 피 레이어 J774 접착을 보고: <ol><li>0.1 M Tris HCl pH 8.8, 1 %SDS에서 세포를 Lyse (100 µ L/잘) 측정 하 고는 CFSE J774 신호 fluorometry (여기/방출 = 492 nm/517 nm). 형광 강렬의 임의 단위 또는 긍정적인 통제에 관하여 접착의 비율 결과 나타냅니다 (추가 총 세포에서 신호에 각 잘).</li>
		<li>형광 현미경 시각화 하 여 4 %PFA 및 보고서에 셀 endothelium CFSE J774 셀의 첨부 파일을 수정 (여기/방출 = 492 nm/517 nm).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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저자는 공개 없다.

이 내 피 프로토콜 탐험 소설 메커니즘 염증 반응의 조절에 관여에 대 한 기초를 설정 하는 단계적 기술을 설명 합니다. 이러한 방식을 내 피 활동 LPS에 의해 자극된의 연구에 기초 하 고 특히 백혈구 신규 모집 선 동적인 응답 동안에 관련 된 중요 한 단계를 평가: cytokines 내 피, 내 피 접착 분자 표정 및 백혈구 접착 혈관 층에. 내 피 매개 변수가 설정 되 면 시스템 내 피 기능의 규정에 관련 된 소설 화합물에 대 한 검색할 수 있습니다 따라서, 염증 진행. 그 규제 약물 제약 시장에 대 한 관심의 수 있습니다. 이 순차 프로토콜의 주요 투영 물질로 조건 내 피 종류에 그들의 상대 혈관 활동 매개 변수를 조정 하 여 이러한 연구를 확장 하기 위한 기초입니다.
이 심사에 의해 선정 하는 마약 염증 성 질환에 대 한 새로운 치료 전략을 설계에 대 한 재미 있는 후보자를 창설할 것 이다. 한편으로, 내 피 응답을 선호 하 고 백혈구 신규 모집을 하는 화합물 면역 결핍 ...

염증은 병원 체를 제거 하 고 손상 된 조직을 복구 하는 주요 목적으로 전염 성 요원에 대 한 유익한 생물학 응답 이다. 만성 감염 또는 면역 질환과 같은 특정 조건에서 염증이 해결 되지 않습니다. 대신, 백혈구, 조직 손상, 섬유 증, 기능, 및 전반적인 손실, 장애 및 환자 일부의 경우 죽음에 리드 장기간된 면역 반응의 결과로의 지속적인 침투와 탈 선 반응이입니다. 이러한 인간의 장애, 염증 성 질환으로 카탈로그 모든 백혈구 넘쳐 흐름1,2의 컨트롤에 대 한 혈관 포함.
내 피 세포 백혈구 밀매를 제어 하 여 염증 반응의 규칙에 있는 근본적인 역할을 재생 합니다. 내 피 레이어 LPS 등 염증 성 중재자에 노출은, 휴식 endothelium 활성화 하 고 프로 염증 성 cytokines (Cxcl10 Cxcl5, Cxcl1, 등)와 접착 분자 (전자 selectin VCAM-1, ICAM-1)를 표현 하 고 그 은혜 순환 하는 백혈구는 감염의 사이트에 모집 다음 릴리스 cytokines에 의해 액 백혈구 중재 압 연 및 특 파 원 접착제 대응을 통해 내 피 레이어와 상호 작용: selectin, α4β1 integrin VCAM-1 및 αLβ2 integrin ICAM-1 PSGL-1. 마지막으로, 백혈구는 염증3의 초점으로 맥 관 구조에 걸쳐 마이그레이션합니다.
염증 반응 조절에 피 내 막의 필수적인 역할 유전자 LPS 수용 체, 통행세 같이 수용 체 4 (TLR4), 내 피 세포에만 표현 하기 위해 수정 된 쥐에 증명 되었습니다. 이 내 피 TLR4 동물 LPS 중재 염증 박테리아 접종 후 발생 하는 감염을 감지 하 고 대응 하 고 따라서 감염 확인 및 강포한 유형 쥐4 으로 비슷한 수준에서 생존을 달성할 수 있었다 , 5.
피 규제 염증 반응 통로 대 한 그것은 되었습니다 가정 하는 백혈구 내 피 상호 작용의 어떤 단계에서 저해 트랜스 내 피 마이그레이션에 대 한 더 나은 예 지의 감소 귀 착될 것입니다. 염증 관련 된 질병입니다. 사실, 내 피 활성화 및 백혈구 endothelium 상호 작용을 대상으로 하는 여러 전략 염증 성 장애6,7에 대 한 치료로 면역 세포의 넘쳐 흐름을 방해 하기 위하여 설계 되었습니다.
이 보고서에서 우리는 생체 외에서 기술 완벽 하 게 특성화 염증 성 자극 LPS에 내 피 활동 및 백혈구 활성화 및 혈관 층에 접착의 역할의 철저 한 그룹을 설명 합니다. 이 원고에 사용 되는 내 피 세포 모델은 마우스 폐 내 피 세포 라인 (MLEC-04), Hortelano 그 외 여러분 에 의해 설명 된 대로 8. 내 피 활성화9,10공부 하는 적절 한 시스템 문학에는 MLEC-04 셀 라인 검증 되었습니다. 연구 관심 분야에 따라, 이러한 접근 수 있습니다 쉽게 추정 될 어떤 내 피에 백혈구 시스템 및 염증 성 프로필 또는. 선택한 조건에 내 피 매개 변수를 정의한 후 시스템 혈관 활성화를 평가 하기 위해 제안 된 실험에 대 한 새로운 약물을 테스트할 수 있습니다. 이 염증 성 맥락에서 관심의 화합물과 테스트 내 피 세포는 세포의 제어 조건에 비교 될 수 있다 하 고 결과 차이 약물의 개발 및 염증의 진행에 전조 결과 알릴 수 있습니다. 결론, 우리는 염증 관련 질병에 대 한 소설 관련 혈관 치료의 디자인에 영향을 미칠 수 있는 내 피 세포에 새로운 약물 표적을 특성화 하기 위해 관련 시스템을 제안 합니다.

<table><tbody><tr><td>젤라틴</td><td>시그마</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Lonza</td><td>BE12-719F</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>시그마</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신</td><td>Lonza</td><td>DE17-602E</td><td></td></tr><tr><td>트립신</td><td>Lonza</td><td>BE17-160E</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>시그마</td><td>ED2SS</td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>시그마</td><td>L2880</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Sigma</td><td>T9424</td><td>RNA 추출 버퍼</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma</td><td>33539</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absoluto</td><td>Panreac</td><td>1,310,861,612</td><td></td></tr><tr><td>Pure H2O</td><td>Qiagen</td><td>1017979</td><td>RNAse free</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Pronadisa</td><td>8020</td><td></td></tr><tr><td>Stain for agarose gels</td><td>Invitrogen</td><td>s33102</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III First-Strand Synth</td><td>Invitrogen</td><td>18080051</td><td>RT-PCR</td></tr><tr><td>Fast SYBR Green Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4385610</td><td>qPCR용 형광 염색</td></tr><tr><td>MicroAmp Fast Optical 96-Well</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346906</td><td>Plates for qPCR</td></tr><tr><td>U-bottom 96 well plates</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>세포 분석 튜브</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>TX100</td><td>Panreac</td><td>212314</td><td>비이온 성 계면 활성제</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Panreac</td><td>1,319,401,211</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Merck</td><td>1,064,041,000</td><td></td></tr><tr><td>피로 인산 나트륨</td><td>시그마</td><td>221368</td><td></td></tr><tr><td>불화 나트륨</td><td>시그마</td><td>S7920</td><td></td></tr><tr><td>오르토 바나 데이트</td><td>나트륨 시그마</td><td>13721-39-6</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일</td><td>시그마</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>피어스 BCA 단백질 분석 키트</td><td>피어스</td><td>23225</td><td>비신 코닌산 분석 용 시약</td></tr><tr><td>&베타; -메르캅토 에탄올</td><td>머크</td><td>805,740</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 전달 멤브레인, 0.45 &마이크로; m</td><td>Thermo Scientific</td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Panreac</td><td>1,623,121,611</td><td>폴리소르베이트 20</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>BE17-515Q</td><td></td></tr><tr><td>ECL</td><td>Millipore</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 유형 I</td><td>Sigma</td><td>c8919</td><td></td></tr><tr><td>아세트산</td><td>Panreac</td><td>1,310,081,611</td><td></td></tr><tr><td>Trypan 블루</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Panreac</td><td>1,310,911,612</td><td></td></tr><tr><td>크리스탈 바이올렛</td><td>Sigma</td><td>HT90132</td><td></td></tr><tr><td>구연산나트륨</td><td>Sigma</td><td>C7254</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 96%</td><td>Panreac</td><td>1,410,851,212</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Sigma</td><td>21888</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Lonza</td><td>BE12-115F</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0418</td><td></td></tr><tr><td>Infinite M200</td><td>Tecan</td><td>M200</td><td>다중 모드 마이크로플레이트 리더</td></tr><tr><td>Gel Doc 2000</td><td>Bio-Rad</td><td>2000</td><td>Gel 문서화 시스템</td></tr><tr><td>StepOnePlus</td><td>Applied Biosystems</td><td>StepOnePlus</td><td>qPCR 시스템</td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 10</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Analyzer 10</td><td>Cytometry equipment</td></tr><tr><td>ChemiDoc MP</td><td>Bio-Rad</td><td>MP</td><td>Chemiluminescence detection system</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호<</td><td>strong>Comments</td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PECAM-1</td><td>BD Biosciences</td><td>553370</td><td>10 &micro에서 사용; g/mL</td></tr><tr><td>ICAM-2</td><td>Biolegend</td><td>1054602</td><td>10 &micro에서 사용; g/mL</td></tr><tr><td>E-selectin</td><td>BD Biosciences</td><td>553749</td><td>10 &micro에서 사용; g/mL</td></tr><tr><td>VCAM-1</td><td>BD Biosciences</td><td>553330</td><td>10 & 마이크로에서 사용; g/mL</td></tr><tr><td>ICAM-1</td><td>Becton Dickinson</td><td>553250</td><td>10 &마이크로에서 사용; g/mL</td></tr><tr><td>항-쥐 IgG-FITC</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>112-095-006</td><td>10 & 마이크로에서 사용; g/mL</td></tr><tr><td>안티 아르메니아 햄스터-FITC</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>127-095-160</td><td>10 & 마이크로에서 사용; g/mL</td></tr><tr><td>쥐 IgG 이소티오프 제어</td><td>Invitrogen</td><td>10700</td><td>10 & 마이크로에서 사용; g/mL</td></tr><tr><td>아르메니아 햄스터 IgG 이소타입 제어</td><td>Invitrogen</td><td>PA5-33220</td><td>10 &micro에서 사용; g/mL</td></tr><tr><td>P-I&카파; &베타;-&알파;</td><td>세포 신호</td><td>2859</td><td>10 &micro에서 사용; g/mL</td></tr><tr><td>&beta;-Actin</td><td>Sigma</td><td>A5441</td><td>10 &마이크로에서 사용; g/mL</td></tr><tr><td>P-ERK</td><td>세포 신호</td><td>9101</td><td>10 & 마이크로에서 사용; g/mL</td></tr><tr><td>안티 마우스 HRP</td><td>GE Healthcare</td><td>LNXA931/AE</td><td>1:10,000에서 사용</td></tr><tr><td>안티 토끼 HRP</td><td>GE Healthcare</td><td>LNA934V/AG</td><td>1:10,000에서 사용</td></tr><tr><td>안티 랫 HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-3823</td><td>1:10,000에서 사용</td></tr></tbody></table>

심사 분석 실험 소설 내 피 레 귤 레이 터 염증 반응에 관여 하

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

내 피 층은 여러 가지 기능을 제어 하 여 신체의 항상성 유지 하기 위한 필수적입니다. 내 피 층에 의해 염증 반응의 규칙은 효율적으로 유해한 입력에 대 한 싸움과 손상 된 지역의 복구에 도움이 중요 합니다. 내 피 세포는 선 동적인 환경, 그람 음성 세균 막, lipopolysaccharide (LPS)의 외부 구성 요소에 노출 되 면 그들은 Ccl5, Cxcl1 등 Cxcl10, 수용 성 프로 염증 성 cytokines를 표현 하 고 방 아 쇠는 순환 하는 백혈구의 활성화입니다. 또한, 내 피 표면에 접착 분자 전자 selectin VCAM-1, ICAM-1의 식 상호 작용 및 접착 내 피 레이어, 그리고 결국 염증된 조직 향해 넘쳐 흐름을 활성화 된 백혈구의 수 있습니다. 이 시나리오에서는 내 피 기능 해야 합니다 엄격 하 게 규제 되어야 백혈구 신규 모집에 과도 한 또는 결함이 활성화 염증 관련 질환으로 이어질 수 있기 때문에. 이후 많은 이러한 장애의 효과적인 치료를 하지 않아도, 혈관 층에 초점을 맞춘 새로운 전략을 조사 해야 합니다. 우리 소설 내 피 레 귤 레이 터 백혈구 기능을 수정 하는 검색에 유용한 종합적인 분석 제안 합니다. 우리를 포함 한 여러 가지 기술로 특정 식 대상 (예: cytokines, 발산, 및 접착 분자) 백혈구 신규 모집에 참여를 사용 하 여 내 피 활성화 분석: 실시간 정량 중 합 효소 연쇄 반응 ( RT-qPCR), 서쪽 오 점, cytometry 및 접착 분석 흐름. 이러한 접근 염증 맥락에서 내 피 기능을 결정 하 고 소설 내 피 염증 성 레 귤 레이 터 설계 새로운 치료 전략에 대 한 잠재적으로 가치 있는 특징을 심사 분석을 수행 하는 매우 유용 합니다.

실시간 정량 Pcr에 의해 LPS 유발 내 피 세포 활성화의 평가
굶 어 혈 청 MLEC-04 셀 100 ng/mL LPS의 6 h에 의해 자극 되었다 그리고 내 피 유전자 발현 비교 활성화 마커 휴식 상태를 표현 하 여 실시간 정량 Pcr를 사용 하 여 평가 했다. 그림 1A같이 LPS incubated MLEC-04 세포 염증 반응 (전자 selectin VCAM-1, ICAM-1) 동안 백혈구 신규 모집에 관련 된 선택 된 접착 분자의 mRNA 표현 유도. PECAM-1 식이 실험적인 치료에서 수정 되지 않은 때문에 내부 제어로 사용 되었다. 그림 1B LPS cytokines Ccl5, Cxcl10, 및 Cxcl1의 증가 mRNA 식으로 측정 하 여 내 피...

혈관 내 피는 단단히 백혈구 신규 모집을 제어합니다. 부적당 한 백혈구 넘쳐 흐름 인간의 염증 성 질병에 기여 한다. 따라서, 내 피 활성화의 새로운 규제 요소에 대 한 검색은 염증 성 질환에 대 한 향상 된 치료를 디자인 해야 합니다. 여기, 우리는 포괄적인 방법론 소설 내 피 레 귤 레이 터 백혈구 중 염증 매매 하는 것을 수정할 수 있는 특성을 설명 합니다.

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

이 스크리닝 분석의 전반적인 목표는 염증성 질환에 대한 새로운 치료 전략을 설계하기 위해 관심 있는 염증 반응에 관여하는 새로운 내피 조절 인자를 특성화하는 것입니다. 이 방법은 염증성 질환을 약화시킬 수 있는 새로운 내피 표적 약물을 정의하는 것과 같은 병리학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 내피 프로토콜의 주요 장점은 염증 반응 조절과 관련된 새로운 메커니즘을 탐색하기 위한 기초를 확립하는 분석 기술을 설명한다는 것입니다. 이 방법론을 시연하는 사람은 우리 연구실의 박사후 연구원인 Maria Angeles Higueras와 우리 연구실의 기술자인 Sandra Herranz입니다. 먼저 10% FBS가 보충된 완전한 DMEM F12 배지에서 MLEC-04 세포를 배양하고 Pen-Strep.37의 생물학적 인큐베이터에서 세포를 배양합니다.

screening-assays-to-characterize-novel-endothelial-regulators

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

석판술으로 새겨져와 PDMS에서 가공 Microfluidic 흐름 여왕님 EC 장애와 염증과 관련된 기능적 결과를 알아내기 위해 적용됩니다. 대표 실험에서는 차등 전단 응력의 능력 시토킨 활성화 EC monolayers에 monocytic 세포 접착을 조절하기 위해이 입증되었습니다.

온칩 내피 염증성 Phenotyping

여기 면역 - modulatory의 bioactives의 식별을 목표로 소설 높은 콘텐츠를 화학적으로 유도된 염증 분석을 설명합니다. 우리는 성공적으로 염증 반응뿐만 아니라 추가로 데이터 처리, 분석, 마이닝, 그리고 저장 장치의 자동 부량을 활성화하는 사용자 정의 개발 소프트웨어의 스크립트와 자동화된 현미경을 결합했습니다.

촉진 약물 디스커버리 : Zebrafish의 자동화된 하이 컨텐츠 염증 분석

감염의 사이트에서 활성화 된 내피 세포에 백혈구 준수는 호스트의 염증 반응의 중요한 구성 요소입니다. 수 있습니다 호중구 결합 분석은이 보고서에...

정량<em&gt; 체외</em정적 조건에서 활성화 된 기본 인간의 미세 혈관 내피 세포에 호중구 부착을 측정하는&gt; 분석

관 형성 분석법은 시험관 내 혈관 신생을 측정하기위한 신속하고 정량적 방법이다. 내피 세포는 조절 된 미디어와 결합 기저막 추출물에 도금된다. 튜브 형성은 시간 이내에 발생하고 새로 형성된 세관은 쉽게 정량화.

에 대한 내피 세포의 관 형성의 분석<em&gt; 체외</em&gt; 혈관 신생 연구

인간의 혈관 혈액 상호 작용을 조사하기 위한 신뢰할 수 있는 모델의 접근성이 부족합니다. 우리는 혈액(ELISA)과 혈관 구획(현미경) 모두에서 세포 상호 작용을 조사하기 위해 인간 전혈과 결합된 배양된 1차 인간 내피 세포의 체외 모델을 제시합니다.

소설 시험관 인간의 전체 혈액과 내피 세포 사이의 상호 작용 유학을위한 모델

우리는 검출 및 정량화 리간드, 혈관 내피 성장 인자 패밀리의 구성원의 활성을 모니터링하는 간단한 셀 기반 생물학적 검정을 기술한다. 분석법은 리간드가 수용체 결합 및 가교 결합의 반 정량적 또는 정량적 평가를 제공하는 인자 의존적 세포주에서 발현 된 키메라 수용체를 사용한다.

혈관 내피 성장 인자의 평가에 대한 간단한 생물 검정

이 원고는 통제된 환경에서 내피 세포관 형성을 사용하여 혈관 신생에 대한 주어진 화합물 또는 조건의 효과를 정량화하기 위한 튜브 형성 분석을 설명합니다.

전략적 내피 세포 관 형성의 분석 : 감소 세포 외 매트릭스 세포 외 기질과 성장 인자를 비교

우리는 전체, 비 anticoagulated 혈액에서 응고의 분석과 연구를 허용 하는 체 외에서 모델 제시. 그리고 시스템에 anticoagulation 건강 한 내 피 세포의 자연 anticoagulation 효과에 따라 내 피 세포 활성화 응고 귀 착될 것 이다.

3D 세포 배양 및 비 anticoagulated 전 혈을 사용 하 여 내 피 세포의 항 응 혈 약 그리고 항 염증 제 속성에 대 한 평가

혈관 벽에 면역 세포의 동적 접착 용기 추적에 대 한 전제 조건입니다. 여기, 우리 addressin 코팅 모 세관을 사용 하 여 인간 세포의 동적 세포 접착에 안티 integrin 항 체, 발산 또는 다른 요인의 영향 분석에 대 한 기능 생체 외에서 시험에 대 한 프로토콜을 제시.

선 동적인 장 질병에 방지 접착 치료의 기능 분석에 대 한 동적 접착 시험

이 단계별 프로토콜 실험 설정 및 hiPSC-ECs에 염증 반응의 평가 대 한 데이터 분석 및 생리 적 흐름에서 백혈구 접착의 분석에 대 한 자세한 설명을 제공합니다.

미세 분석 결과 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 내 피 세포 (hiPSC-ECs)에 백혈구 접착의 평가 대 한

학습하세요 혈관 내피 세포에서 염증 반응을 조절하는 새로운 조절 인자를 특성화하는 방법을. 백혈구 이동과 염증 질환 치료 전략 개발에 활용됩니다.

심사 분석 실험 소설 내 피 레 귤 레이 터 염증 반응에 관여 하

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