Name: 모터 축 삭 탐색 및 빛 시트 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 마우스 배아에서 축 삭 Arborization의 정량화의 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 학습하세요 빛 시트 형광 현미경을 이용하여 마우스 배아의 운동 신경 축삭 가지 형성을 정성적·정량적으로 분석하는 방법을. 이 기술은 신경 발달 연구에 활용됩니다.

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LSFM 실험 및 데이터 분석은 일부를 사용 하 여 악기 서비스의 사단의 고급 광학 현미경 학계 Sinica에서 양 슈 첸 쉔의 원조 하는 것을 수행 했다. 우리는 이미징 핵심 시설의 IMB 상당한 기술 지원 Imaris 이미지 분석에서 양 슈 핑 리 감사합니다. IMB의 과학적인 영어 편집 코어 원고 검토. 이 작품은 학계 Sinica 경력 개발 상 (CDA-107-L05), 가장 (104-2311-B-001-030-MY3), 및 NHRI (NHRI-EX106-10315NC)에 의해 자금을.

모든 살아있는 동물의 특정 병원 체 자유롭게 (SPF) 동물 시설, 승인 및 학계 Sinica IACUC에 의해 감독에 유지 했다.
1입니다. 고정
<ol><li>배아 하루 12.5 (E12.5)의 배아를 수집 다음 목을 벨 하 고 그들 내장을 들어낸.</li>
	<li>수정 배아 개별적으로 24-잘 접시에 1 mL/갓된 4 %paraformaldehyde 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1에서의 하룻밤. 통에 4 ° C에서 품 어.</li>
	<li>1 x PBS의 1 mL와 함께 x, 5-10 분, 각각 고정된 배아 적어도 3를 세척 하 고 잔여 paraformaldehyde 제거를 통에 4 ° C에서 밤새 품 어.</li>
</ol>2. 전체-마운트 Immunostaining
<ol><li>0.5%의 1 mL에 각 배아를 permeabilize PBS-트리톤-X-100 (PBST) 통에 4 ° C에서 하룻밤.</li>
	<li>10 %FBS 통에 4 ° C에서 하룻밤 1 x PBS에 준비의 1 mL와 함께 각 샘플을 차단 합니다.</li>
	<li>안티-GFP 1 차적인 항 체의 1 mL와 함께 태아를 품 어 (1:1, 000 희석 10 %FBS에서) 모터 신경의 GFP 신호 강화로 지속적인 떨고 72 h 4 ° C에서.</li>
	<li>1 차적인 항 체 외피 후에 0.5%의 1 mL로 씻어 0.5%를 변경 하는 한 통에 4 ° C에서 1-2 일에 걸쳐 PBST PBST 적어도 세 번.</li>
	<li>이차 항 체의 1 mL를 적용 (1:1, 000 희석 10 %FBS에서) 및 일정 한 동요와 4 ° C에서 어둠 속에서 밤새 품 어.</li>
	<li>씻어 0.5%의 1 mL와 함께 3 x 2-3 일에 걸쳐 통에 4 ° C에서 PBST. 이미징 전날까지 4 ° C에서 1 x PBS에서 샘플 계속. 참고: 배아는 개간, 배아의 일부 것입니다 몇 군데 따라 하기 전에 작은 세그먼트로 해 부 될 수 있다. 앞 발이 실험 방법 (그림 1A)에서 유지 됩니다.</li>
	<li>이미징에 대 한 투명 한 태아를 렌더링 하룻밤 실 온에서 빛에서 보호 1.5 mL 튜브에 1.49의 굴절률을 가진 상업적인 청소 시에 태아를 품 어. 참고: 개간 시 약의 볼륨은 약 5 배 샘플 볼륨의.</li>
</ol>3. LSFM (2-3 h)
<ol><li>
샘플 설정
	<ol>
<li>5 X / 0.1 설정 조명 광학 및 5 X / 0.16 감지 광학. 샘플 홀더 및 샘플 모 세관 (1.5 m m 내부 직경, 녹색)를 조립 하십시오 하 고 현미경으로 그들을 배치. 참고: 자세한 설정 절차에 대 한 현미경의 운영 설명서를 참조 하십시오.</li>
		<li>다음과 같이 태아를 탑재.<ol>
<li>그것은 모 세관의 직경에 맞도록 위쪽 부분을 멀리 절단 하 여 P200 피 펫 팁을 준비 하 고 뾰족한 부분을 제거 (~ 3 mm) 샘플 첨부 파일에 대 한.</li>
			<li>작은 불꽃을 사용 하 여 피 펫 팁의 무딘된 끝을 녹여.</li>
			<li>불꽃을 소화 하 고 신속 하 게 녹 인된 끝에 수직으로 태아를 연결 합니다.</li>
			<li>샘플 모 세관 피 펫 팁의 위쪽 부분에 맞게.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Equilibrate 파편 또는 거품을 1 분 동안 태아와 챔버 버퍼를 수 있습니다.</li>
		<li>이미징 소프트웨어를 사용 하 여 찾기 탭 아래 모 세관 찾기 를 선택 하 고 x, y, z 축 샘플 모 세관의 위치 조정.</li>
		<li>찾기 샘플 을 선택 하 고 0.6 X 배아에 초점을 확대. 군데 사지의 긴 축 (그림 1B) 두 광원의 빛 경로와 정렬 있도록 배아를 회전 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
이미지 수집
	<ol>
<li>인수 탭 검출 목적 등 가벼운 경로 매개 변수 정의 차단 필터, 빔 스플리터, 카메라 및 레이저 레이저. 참고: GFP 채널은이 실험에 사용 (여기 파장: 488 nm; 방출 필터: BP 505 545 nm, 빔 스플리터: SPS LP 560).</li>
		<li>그림자 감소의 피벗 스캔 확인란을 확인 하십시오.</li>
		<li>수집 설정을 정의: 비트 수준, 16 비트; 확대/축소, 0.36-0.7 X; 단일 측면 조명 (왼쪽/오른쪽) 또는 듀얼 사이드 조명.</li>
		<li>연속 을 클릭 하 고 선명한 이미지 레이저 강도, 노출 시간, 레이저 전력 및 빛 시트 위치를 설정 합니다. 참고: 레이저 전원 photodamage 최소화 하기 위해 가능한 한 낮은 유지 됩니다.</li>
		<li>이미지 수집 끝에 중지 를 누릅니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
다차원 수집
	<ol>
<li>첫 번째 및 마지막 이미지에 대 한 Z 위치를 이동 하 여 z-스택을 정의 합니다. 최적 조각 수 설정을 클릭 합니다.</li>
		<li>선택한 z-스택 얻으려고 실험 시작 을 클릭 합니다.</li>
		<li>완료 되 면.czi 형태로 이미지를 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
이미지 처리 (선택 사항)
	<ol>
<li>듀얼 사이드 조명을 적용 하는 경우 처리 하는 Lightsheet 채널에서 듀얼 사이드 퓨전 으로 진행 합니다. Multiview 처리 하는 것은 멀티 플레이 여러 각도에서 이미지를 결합 하 여 취득 하는 경우에 필요 합니다.</li>
		<li>최대 강도 투영 채널에서 투영 축 따라 최고 강도 픽셀에서 데이터를 사용 하 여 2D 이미지를 만듭니다.</li>
		<li>복사 채널에서 원래 집합에서 이미지의 하위 집합을 선택 하려면 하위 집합 을 클릭 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 축 삭 Arborization (30 분 각 개별 신경에 대 한)의 정량화
<ol><li>영상 분석 소프트웨어에서 이미지 파일을 열고 (기본적으로 XYZ 데이터를 포함 하는 이미지 오픈 Surpass 모드에서 3D 렌더링 보기).</li>
	<li>이미지 색상, 밝기, 조정 하 고 디스플레이 조정 창을 사용 하 여 대조 (편집 | 디스플레이 조정 표시) 로컬 강도 대비에 따라 필 라 멘 트 감지 하.</li>
	<li>추가 새 필 라 멘 트 아이콘을 클릭 하 고 드롭-다운 메뉴에서 Autopath (루프) 알고리즘을 선택 합니다.</li>
	<li>(이 경우 관심의 분단 축 삭)에 관심 영역을 선택 합니다. 다음 완료를 클릭 합니다.</li>
	<li>분할 모드를 사용 하 여 측정 될 수 있는 크고 얇은 직경 측정을 할당 하 여 시작 및 씨앗 포인트를 정의 합니다.</li>
	<li>관심 영역의 가장자리에 시작점을 지정 합니다. 수동으로 추가 또는 제거 시작 지점에 달성 하기 위해, 먼저 포인터 모드 변경 (탐색 | 선택) 및 다음 shift 키를 마우스 오른쪽 단추로 클릭 관심의 포인트에.</li>
	<li>보이는 arborization의 모든 표시 되도록 씨 포인트에 대 한 수동 임계값을 선택 합니다. 포인터 모드 변경 (탐색 | 선택) 다음 Shift + 왼쪽 클릭 관심의 포인트에 수동으로 추가 하거나 씨앗 포인트를 제거 하 고. 참고: 그것은 이웃 신경에서 배경 소음 및 신호를 수동으로 제거 하는 것이 중요입니다.</li>
	<li>확인란 시작 지점 주변 씨앗 포인트를 제거합니다.</li>
	<li>포인트는 너무 멀리 떨어져 있으며 배경 잡음을 나타내는 수 있습니다의 배제를 허용 하도록 제거 분리 세그먼트를 확인 합니다. 제외에 대 한 상한값을 정의 하는 다음 단계에서 최대 간격 길이 나타냅니다.</li>
	<li>모든 복의 배경 강도 추정 하는 가우스 필터를 사용 하 여 배경 빼기에 대 한 임계값을 조정 합니다.</li>
	<li>대략적인 횡단면 영역 알고리즘을 사용 하 여 모 수석 직경에 대 한 자동 임계값을 설정 합니다.</li>
	<li>척추 계산에 대 한 단계는 건너뜁니다.</li>
	<li>프로세스를 완료 하 고 원하는 스타일과 색상을 선택 합니다.</li>
	<li>볼만 재건된 축 삭을 속성 에서 볼륨 상자 선택을 취소 합니다.</li>
	<li>통계 탭에서 자세히를 선택 합니다. 필 라 멘 트를 사용 하 여. 모 수석 터미널 포인트 모터 축 삭 arborization의 지표로 서 모터 신경 맨끝을 계량 하기. 참고: 통계 주석을 추가할 수 있습니다 원하는 경우.</li>
	<li>.Tif 파일로 복원된 축 삭의 이미지를 내보냅니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

프로토콜의 여러 단계 특정 상황에서 변화에 대상이 될 수 있습니다. 예를 들어 고정 기간의 2 h에서 1 이상의 일 갓 만든 paraformaldehyde를 사용 하 여 다양 한 태아의 나이에 따라 달라 집니다. 고정 단백질 가교에 민감한 항 체에 대 한 전체 마운트 immunostaining 이전 실시 이후 메탄올 대체 통 요원으로 사용할 수 있습니다. 얼룩에 높은 신호 대 잡음 비율, 그것은 세제 농도 최적화 하는 데 필요한 (사이 0.1-0.5%). 추가 세척 단계 전후에 항 체 외피 또한 신호 대 잡음 비율을 높일 수 있습니다. 또한, 조직 개간 단계는 빛 깊은 axonal 예측을 통해 차단 되는지 확인 해야 합니다. 조직의 투명성을 강화 하려면 개간 효과 다시 버퍼 솔루션에 샘플을 immersing에 의해 반전으로 상업 개간 에이전트에서 부 화 하는 동안 PBS의 최소한의 소개를 위해 중요 하다. 그렇지 않으면, 높은 굴절률 또는 장기간 개간으로 개간 시 약이 좋습니다. 한편, 이미지 수집 하는 동안 매개 변수는 다른 ...

중앙 신경의 일부인 척수 MNs 하지만 이동을 컨트롤 하기 위해 주변 근육을 자극. 개발 척수에서 미네소타 창시자 (pMNs) notochord 그리고 인접 한 somites에서 나오는 신호에 따라 설정 됩니다. 모든 포스트 mitotic MNs 분화 다음 pMNs, 결국 척수1,2의 rostrocaudal 축 미네소타의 일련에 기한에서 생성 됩니다. 척추 MNs 지형학과 해부학 잘 구성 되어 있습니다. 그들의 형태학 배열 주변3에 그들의 각각 대상의 위치와 상관 한다. 그들의 근육 목표에 도달, axons 수신 확장 하 고 분기 하도록 유도 하는 세포와 외 인 neurotrophic 요인 근육으로. 신경 분포 및 분기 결함 neuromuscular 접속점 (NMJ)를 형성 하는 실패에 기여할 수 있습니다. 예를 들어 폐해 파생 된 neurotrophic 요인 (GDNF)-유도 Pea3은 축 삭 arborization 피부 막시무스 (CM)에 대 한 필수 및 latissimus dorsi (LD) 근육4,5. 또한, 식사 녹아웃 마우스 배아 탄생6,7직후 호흡 실패 및 사망률을 일으키는 횡 경 막에 인할지 신경의 결함 arborization를 표시 합니다. 따라서, 미네소타 성숙 (즉, axonal 프로젝션 및 분기)의이 마지막 단계가 신경 세포와 대상 세포 간의 통신을 보장 하기 위해 중요 합니다.
Arborization 패턴을 보려면, 연구자는 일반적으로 confocal 영상 또는 sectioned 또는 전체 마운트 샘플8,,910의 2 광자 형광 가벼운 현미경 검사 법 실시. 현미경 검사 법 기술을 둘 다 생성 허용 해상도 깊이 침투 합니다. 2-광자 형광 가벼운 현미경 검사 법11두 낮은 에너지 광자 동시 흡수 fluorophores의 흥분을 포함 한다. 두 광자 여기 근처-적외선 방사선을 사용 하 여, 이후 감소 여기 주파수 감소 산란 및 1 m m 더 큰 깊이 가진 이미징 되므로 조직에서에서 더 나은 조직 침투에 기여 한다. Confocal 현미경 검사 법 제거 필터 초점 아웃 신호 및만12초점 비행기 내에서 빛을 수집 합니다. 이 방식으로 Z-스택 기능을 통해 3 차원 (3D) 이미지를 생성 하 다른 초점 비행기에서 샘플의 이미지를 결합 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 신호 강도 빛의 대부분을 차단 하 고 높은 수치 apertures 모호한 필드의 깊이 감소 된다. 더 중요 한 것은, 두 기법 때문에 하나의 비행기는 주어진된 시간에 촬영 하는 경우에 전체 표본 조명 받는 심각한 photodamage 및 phototoxicity에 기여 한다.
이러한 단점을 우회 되 고 빠른, 빛 효율의 장점을 선호 대안 및 더 적은 phototoxic13,14LSFM 되고있다. 또한, LSFM 분할 영상이 있습니다. 이 방식은 모터 축 삭 및 그들의 분산 터미널을 시각화 하는 그들은 3D 공간을 통해 확산에 특히 적합 합니다. LSFM 샘플 수직 축과 x, y 및 z 축을 따라 움직임 회전을 허용 하는 단계에 탑재 되어 있기 때문에 다른 두 가지 옵션을 능가. 이 설정 뿐만 아니라 둘 다 요구 플랫 슬라이드 샘플 장착 샘플의 최소 차단된 보기 뿐만 아니라 바람직한 조명 경로, 2 광자 고 confocal 현미경 검사 법의 단점에 대 한 선택 수 있습니다. 따라서, LSFM는 마우스 배아에 있는 모터 신경 맨끝의 정량화 및 축 삭 arborization의 3D 영상에 대 한 가장 적합 한 도구입니다.

<table><tbody><tr><td>Hb9 :: GFP</td><td>잭슨 연구소</td><td>005029</td><td>배아 일 12.5 (E12.5)</td></tr> <tr><td>4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)</td><td></td><td></td>의 배아를 수집합니다 <td>200ml의 경우 : ddH2O에 20ml 10X PBS, 8g PFA를 추가합니다. NaOH(10N)로 pH를 7.4로 조정합니다. 필터는 -20°C에서 살균 및 보관합니다.</td></tr><tr><td>인산염 완충액 식염수 10X(PBS 10X)</td><td></td><td></td><td>1L의 경우: NaCl 80g, KCl 2g, Na2HPO4 14.4g, KH2PO4 2.4g을 넣고 ddH2O를 보충합니다. 오토클레이브 및 RT에 보관하십시오.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>ThermoFisher</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Sheep polyclonal anti-GFP</td><td>AbD Serotec</td><td>4745-1051</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 당나귀 안티 양</td><td>Invitrogen</td><td>A-11015</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>RapiClear 1.49 투명 시약</td><td>SunJin Lab</td><td>RC149001</td><td></td></tr><tr><td>1.5ml 마이크로 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>24웰 플레이트</td><td>ThermoFisher</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>5 SA 핀셋</td><td>ideal-tek</td><td>3480641</td><td></td></tr><tr><td>홍채 가위 선조체 날카롭고 날카로운</td><td>Aesculap</td><td>BC110R</td><td></td></tr><tr><td>미세 수술 메스, 일회용</td><td>Aesculap</td><td>BA365</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>TKS</td><td>RS-01</td><td></td></tr><tr><td>Lightsheet Z.1 현미경</td><td>Carl Zeiss 현미경 Imaris</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8.4.0 이미지 분석 소프트웨어</td><td>Bitplane, 취리히, 스위스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9::GFP 마우스)</td><td>잭슨 연구소</td><td>005029</td><td></td></tr></tbody></table>

모터 축 삭 탐색 및 빛 시트 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 마우스 배아에서 축 삭 arborization의 정량화의 시각화

Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

척추 모터 신경 (MNs) 확장 운동과 척추 동물에서 복잡 한 작업을 제어 함으로써 그들의 innervating 목표와 의사 소통을 그들의 축 삭. 따라서, 어떻게 모터 축 삭으로 이동, arborize, 그리고 그들의 주변 근육을 자극을 개발 및 변성 동안 대상의 분자 메커니즘을 밝히기 위해서 중요 하다. 축 삭 터미널 arborization의 전체 스펙트럼에 대 한 자세한 설명은 남아 패턴 복잡성 때문에 불완전 한 유전자 변형 Hb9::GFP 마우스 라인 모터 축 삭 궤도 배아 개발 하는 동안 시각화를 오래 해 왔으나, 비록 고 현재 광학 현미경 검사 법의 제한입니다. 여기, 우리는 빛 시트 형광 현미경 검사 법 (LSFM) 및 질적 및 양적 시각화 모터 축 삭을 개발 하기 위해 강력한 이미지 분석을 결합 하 여 향상 된 프로토콜을 설명 합니다. 이 시스템은 교차 하는 유전 돌연변이 또는 Hb9::GFP 라인, 모터 축 삭 탐색 및 arborization 결함으로 이어질 새로운 분자 메커니즘을 드러내는 미네소타 질병 모델에 쉽게 채택 될 수 있습니다.

LSFM 배아를 마우스에서 미네소타 궤도 및 축 삭 arborization의 상세한 3D 시각화를 제공합니다. 밝은 필드 아래에서 조직 상업 개간 시 약에 몰입 되 고 후 완전히 투명 하 게 나타납니다. 수축 또는 샘플의 붓기는 이미징 하기 전에 시 약을 지우기에 스토리지의 최대 1 주일 후 발견 되었다. 형광 채널에서 모터 뉴런 transgenically 표현된 GFP (영화 1)으로 표시 되어 있습니다. 일부 경우에, 축 삭 구조의 세부 정보는 손상 된다. 예를 들어 그림 2 낮은 품질 이미지를 나타냅니다. 여러 가지 요인이 이미징 품질을 방해 수 있습니다. 첫째, 부족 permeabilization 및 세척 단계 높은 배경 신호 발생할 수 있습니다. 둘째, 이미지를 흐려 inadequately 허가 조직을 통해 산란 발생 합니다. 마지막으로, 차선의 샘플 이미지 중 위치 수 산란 늘...

여기, 우리가 모터 뉴런 프로젝션과 유전자 변형 Hb9::GFP 마우스 배아에서 축 삭 arborization 시각화에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 모터 뉴런에 대 한 immunostaining, 후 우리는 후속 정량 분석에 대 한 이미지 배아를 빛 시트 형광 현미경 검사 법 사용. 이 프로토콜은 중앙 신경 조직에 있는 다른 신경 탐색 프로세스에 적용 됩니다.

모터 축 삭 탐색 및 빛 시트 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 마우스 배아에서 축 삭 Arborization의 정량화의 시각화

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 마우스 배아에서 광시트 현미경 및 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 운동 뉴런 축삭 수화 패턴의 정성적 및 정량적 평가를 허용하는 것입니다. 이 방법은 복잡한 움직임과 조화를 이루는 운동 뉴런 발달을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 다양한 각도에서 운동 뉴런의 축삭 수화 패턴을 관찰 및 이미지화하고 각 신경을 정량적으로 분석할 수 있다는 것입니다.이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 Ya-Ping Yen과 Ee Shan Liau입니다. 이 절차를 시작하려면 쉐이커에서 밤새 셰이커에서 섭씨 4도의 웰당 PBS에 새로 준비된 4% 파라포름알데히드 1ml가 포함된 24웰 플레이트에 배아를 개별적으로 고정합니다. 다음날, 고정된 배아를 1밀리리터의 1X PBS로 각각 5분에서 10분씩 최소 3회 세척하고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.다음으로, 셰이커에서 섭씨 4도에서 하룻밤 사이에 0.5%PBST의 1밀리리터로 각 배아를 투과시킵니다. 셰이커에서 섭씨 4도에서 밤새 1X PBS로 준비한 10%FBS 1밀리리터로 각 샘플을 차단합니다. 그 후, 각 배아에 1ml의 항-GFP 1차 항체를 섭씨 4도에서 72시간 동안 지속적으로 흔들어 배양합니다.1차 항체 배양 후, 셰이커에서 섭씨 4도에서 하루-이틀에 걸쳐 각 배아를 1밀리리터의 0.5%PBST로 세척합니다. 그 후, 2차 항체 1ml를 바르고 섭씨 4도의 어둠 속에서 밤새 계속 흔들면서 배양합니다. 다음 날, 각 배아를 0.5%PBST 1밀리리터로 2-3일 동안 셰이커에서 섭씨 4도에서 최소 3회 세척합니다.그런 다음 하룻밤 동안 실온에서 빛으로부터 보호되는 1.5ml 튜브에서 굴절률이 1.49nd인 상업용 청정 시약에 각 배아를 배양합니다. 5X/0.1 조명 광학 장치 및 5X/0.16 감지 광학 장치를 설정합니다. 샘플 홀더와 샘플 모세관을 조립합니다.시료 챔버에 투명 용액을 채워 준비합니다. 배아를 장착하려면 모세관의 직경에 맞도록 윗부분을 잘라내어 P200 피펫 팁을 준비하고 샘플 부착을 위해 뾰족한 부분을 제거합니다. 그런 다음 작은 불꽃을 사용하여 피펫 팁의 뭉툭한 끝을 녹입니다.불꽃을 끄고 용융된 말단에 배아를 수직으로 빠르게 부착합니다. 피펫 팁의 윗부분을 샘플 모세관에 끼우고 준비된 샘플 챔버를 현미경에 넣습니다. 이미징 소프트웨어를 사용하여 Locate 탭 아래에서 Locate Capillary를 선택하고 X, Y 및 Z축을 조정합니다.다음으로, Locate Sample(샘플 찾기)을 선택하고 0.6X로 확대/축소하여 배아에 초점을 맞춥니다. 챔버 버퍼가 파편이나 기포를 제거하기 위해 일정 시간 동안 배아와 평형을 이루도록 합니다. 이미지 획득의 경우 Acquisition 탭에서 Detective Objectives, Laser Blocking Filter, Beam Splitter, Cameras 및 Lasers와 같은 광 경로 매개변수를 정의합니다.그림자 감소에 대한 Pivot Scan 확인란을 선택합니다. 그런 다음 획득 설정(Bit Bepth를 16비트로, Zoom을 0.36에서 0.7X 사이로 설정, 단일 사이트 조명 또는 이중 사이트 조명)으로 정의합니다. Continuous(연속)를 클릭하고 Laser Intensity(레이저 강도), Exposure Time(노출 시간), Laser Power(레이저 파워) 및 Light Sheet Position(광시트 위치)을 설정합니다.그런 다음 Stop을 눌러 이미지 획득을 종료합니다. 개별 운동 신경에서 미세한 수목화된 구조의 이미지를 자세히 획득할 수 있도록 투명 샘플이 최단 광 경로 내에 위치하도록 하는 것이 중요합니다. 다차원 획득의 경우 첫 번째 이미지와 마지막 이미지의 z 위치를 이동하여 Z 스택을 정의합니다.Optimal(최적)을 클릭하여 슬라이스 번호를 설정합니다. 그런 다음 실험 시작을 클릭하여 선택한 Z 스택을 획득합니다. 완료되면 이미지를 czi 형식으로 저장합니다.축삭 수목화를 정량화하려면 상상 분석 소프트웨어에서 이미지 파일을 엽니다. Display Adjustment 창을 사용하여 이미지 색상, 밝기 및 대비를 조정하여 로컬 강도 대비를 기반으로 필라멘트를 감지합니다. 그런 다음 새 필라멘트 추가 아이콘을 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 자동 경로 알고리즘을 선택합니다.관심 영역을 선택한 다음 슬라이스 모드를 사용하여 측정할 수 있는 가장 큰 직경과 가장 얇은 직경 측정값을 할당하여 시작점과 시드 점을 정의합니다. 관심 영역의 가장자리에 시작점을 지정합니다. 시작점을 수동으로 추가하거나 제거하려면 먼저 포인터 모드를 변경하고, 선택을 탐색한 다음, Shift 키를 누르고 관심 지점을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다.다음으로, 시드 포인트에 대한 수동 임계값을 선택하여 보이는 모든 수목화가 표시되었는지 확인합니다. 그런 다음 시드 점을 수동으로 추가하거나 제거합니다. Remove Disconnected Segments 상자를 선택하고 시작점 주위의 시드 점을 제거합니다.그런 다음 배경 빼기에 대한 임계값을 조정하고 프로세스를 마칩니다. 정확한 정량화를 위해 배경 아티팩트를 제거하고 검출기 경로가 실제 축삭 수목화를 반영하는지 확인해야 합니다. 마지막에 원하는 스타일과 색상을 선택합니다.Statistics 탭에서 Detailed를 선택하고 필라멘트 번호, 수상돌기 말단점을 사용하여 운동 신경 말단을 운동 축삭 수화의 지표로 정량화합니다. 그런 다음 재구성된 축삭돌기의 이미지를 tiff 파일로 내보냅니다. LSFM은 마우스 배아의 운동 축삭 arborization에 대한 상세한 3D 시각화를 제공합니다.운동 뉴런은 위에서 설명한 프로토콜에 따라 유전자 변형으로 발현된 GFP로 표지됩니다. 축삭 수목화를 보다 자세히 이미지화하고 정량화를 수행하기 위해 배율을 조정하여 미세하게 수화된 모든 구조를 드러낼 수 있습니다. 마지막으로, 개별 앞다리 신경의 축삭돌기 수목 형성 패턴은 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 재구성할 수 있습니다.소프트웨어의 자동 경로 알고리즘은 필라멘트를 추적하고 축삭 말단의 총 수를 정량화합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 광시트 형광 현미경을 사용하여 마우스 배아의 샘플을 준비하고 운동 뉴런 축삭을 이미지화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 또한 MRS에 의해 각 개별 운동 신경의 수목 패턴을 정량적으로 평가하는 방법을 알게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 프로토콜은 zebrafish 배아를 생활에서 개별 뉴런 또는 신경 능선 세포의 이미징을 설명합니다. 이 방법은 형광 공촛점 시간 경과 현미경을 사용하여 셀룰러 행동과 굴지의 현지화을 검사하는 데 사용됩니다.

세포 운동성 및 Zebrafish 태아의 개별 뉴런과 신경 크레스트 세포의 굴지의 Cytoskeleton의 라이브 영상

이 비디오는 미세유체 챔버 시스템을 사용하여 운동 뉴런의 축삭 수송을 추적하는 방법을 보여줍니다. 여기에는 축삭 성장을 유도하기 위해 영양 배지가 있는 폴리머로 코팅된 웰에서 마우스 배아 척수 조직을 배양하는 것이 포함됩니다. 라이브 이미징에서 형광 염료 염색 소기관의 움직임은 양방향 축삭 수송을 확인합니다.

Tracking Axonal Transport of Organelles in Motor Neurons Using a Microfluidic Device

Source: &lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/57546/visualization-of-motor-axon-navigation-and-quantification-of-axon-arborization-in-mouse-embryos-using-light-sheet-fluorescence-microscopy'&gt;Liau, E. S.  et al. Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy. J. Vis. 특급. (2018). 이 비디오는 가벼운 시트 형광 현미경을 사용하여 운동 뉴런 투영과 축삭 분기를 이미지화하는 방법을 보여줍니다. 형질전환 마우스 배아. 운동 뉴런 성장 및 연결성을 평가하기 위한...

광시트 형광 현미경을 사용한 운동 뉴런 투영 및 축삭 분지 시각화

출처: Boyer, N. P. et. al., 절제된 마우스 경골 신경에서 신경필라멘트 수송의 이미징 및 분석. J. Vis. Exp. (2020)  이 비디오는 분석을 위한 형광 광활성화 방법을 보여줍니다. 말초 신경의 수초화된 축삭돌기에서 neurofilament 수송. 광활성화 녹색 형광단이 부착된 신경필라멘트를 추적함으로써 이 기술은 신경퇴행성 질환의 축삭 수송에 대한 통찰력을 제공합니다.

Fluorescence Photoactivation Imaging of Neurofilament Transport in Myelinated Mouse Axons(수초화된 마우스 축삭돌기에서 신경필라멘트 수송의 형광 광활성화 이미징) 

출처: Jeong, S. Drosophila에서 배아 운동 뉴런의 축삭 투영 패턴 시각화. J. Vis. Exp. (2017)이 비디오는 초파리 배아에서 축삭돌기의 시각화를 보여줍니다. 운동 뉴런의 면역 라벨링, 뉴런 구조를 드러내기 위한 정확한 해부, 미분 간섭 대비 현미경을 통해 축삭 돌기 패턴을 강조하는 상세한 뉴런 구조를 총체적으로 보여줍니다.

Visualization of Axonal Projection Patterns of Embryonic Motor Neurons in Drosophila (초파리에서 배아 운동 뉴런의 축삭 투영 패턴의 시각화)

우리는 유전자 조작 마우스 개발에서 감각 축삭 성장 표현형을 평가하는 효과적인 방법으로 전체 동물에서 말초 통각 수용기 축삭돌기 이미징을 위해 태아 마우스를 유전형, 염색 및 준비하기 위한 최적화된 프로토콜을 제시합니다.

마우스 배아 감각 축삭 돌기 전체 마운트 이미지

생화학적 분석과 결합된 광학 현미경 기술은 네트린 의존성 축삭돌기 분지화에서 SNARE 매개 외세포작용의 관여를 밝힙니다. 이러한 기술의 조합을 통해 축삭돌기 분지 및 세포 모양 변화를 제어하는 분자 메커니즘을 식별할 수 있습니다.

결합 된 방법론을 활용하여 축삭 분기 및 신경 세포 형태 형성 동안 플라즈마 멤브레인 배달의 역할을 정의합니다

이 연구는 후기 단계 -16 Drosophila melanogaster 배아의 운동 뉴런 예측을 시각화하기위한 표준 면역 조직 화학 법을 상세히 설명합니다. FasII 항체로 염색 된 고정 배아의 필렛 된 준비는 신경 발달 중에 모터 축삭 돌연변이 및 표적인지에 필요한 유전자를 특성화하는 강력한 도구를 제공한다.

배아 운동 뉴런의 Axonal 투영 패턴의 시각화<em&gt; Drosophila</em

이 프로토콜은 DNA/DOTAP 혼합물을 1일 된 제노푸스 라에비스 배아의 안구에 미세 주입하는 방법과 지각 중뇌에서 광학 축색 아버를 발현하는 개별 녹색 형광 단백질(GFP)을 이미지화하고 재구성하는 방법을 설명하는 것을 목표로 합니다. 그대로, 살아있는 제노푸스 올챙이.

제노푸스 laevis 배아에서 눈부안으로 DNA의 미세 주입 및 GFP의 이미징 그대로 광학 축색 아버를 표현, 살아있는 제노푸스 올챙이

여기에서, 우리는 시간 경과 공초점 현미경에 의해 산후 마우스 망막 외식편에서 신경돌기 형태 형성을 조사하는 방법을 제시한다. 우리는 Cre 의존성 방식으로 막 표적화된 형광 단백질을 발현하는 재조합 아데노-관련 바이러스 벡터를 사용하는 망막 세포 유형의 희소 표지 및 획득 및 이들의 미세 공정에 대한 접근법을 기술한다.

유전자 표적화된 망막 세포 집단의 희소 아데노-연관 바이러스 표지를 이용한 뉴런 수목화의 타임랩스 이미징

대뇌 피질이 발달하는 동안 뉴런과 신경교세포는 심실 내벽의 심실 영역에서 시작하여 뇌 표면으로 이동합니다. 이 과정에는 많은 유전자가 관여합니다. 이 프로토콜은 이동하는 뉴런과 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징 기술을 소개합니다.

배아 마우스 뇌 절편에서 이동하는 뉴런 및 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징

학습하세요 빛 시트 형광 현미경을 이용하여 마우스 배아의 운동 신경 축삭 가지 형성을 정성적·정량적으로 분석하는 방법을. 이 기술은 신경 발달 연구에 활용됩니다.

모터 축 삭 탐색 및 빛 시트 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 마우스 배아에서 축 삭 Arborization의 정량화의 시각화

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