모터 축 삭 탐색 및 빛 시트 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 마우스 배아에서 축 삭 Arborization의 정량화의 시각화
May 11th, 2018
여기, 우리가 모터 뉴런 프로젝션과 유전자 변형 Hb9::GFP 마우스 배아에서 축 삭 arborization 시각화에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 모터 뉴런에 대 한 immunostaining, 후 우리는 후속 정량 분석에 대 한 이미지 배아를 빛 시트 형광 현미경 검사 법 사용. 이 프로토콜은 중앙 신경 조직에 있는 다른 신경 탐색 프로세스에 적용 됩니다.
이 프로토콜의 전반적인 목표는 마우스 배아에서 광시트 현미경 및 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 운동 뉴런 축삭 수화 패턴의 정성적 및 정량적 평가를 허용하는 것입니다. 이 방법은 복잡한 움직임과 조화를 이루는 운동 뉴런 발달을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 다양한 각도에서 운동 뉴런의 축삭 수화 패턴을 관찰 및 이미지화하고 각 신경을 정량적으로 분석할 수 있다는 것입니다.
이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 Ya-Ping Yen과 Ee Shan Liau입니다. 이 절차를 시작하려면 쉐이커에서 밤새 셰이커에서 섭씨 4도의 웰당 PBS에 새로 준비된 4% 파라포름알데히드 1ml가 포함된 24웰 플레이트에 배아를 개별적으로 고정합니다. 다음날, 고정된 배아를 1밀리리터의 1X PBS로 각각 5분에서 10분씩 최소 3회 세척하고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.
다음으로, 셰이커에서 섭씨 4도에서 하룻밤 사이에 0.5%PBST의 1밀리리터로 각 배아를 투과시킵니다. 셰이커에서 섭씨 4도에서 밤새 1X PBS로 준비한 10%FBS 1밀리리터로 각 샘플을 차단합니다. 그 후, 각 배아에 1ml의 항-GFP 1차 항체를 섭씨 4도에서 72시간 동안 지속적으로 흔들어 배양합니다.
1차 항체 배양 후, 셰이커에서 섭씨 4도에서 하루-이틀에 걸쳐 각 배아를 1밀리리터의 0.5%PBST로 세척합니다. 그 후, 2차 항체 1ml를 바르고 섭씨 4도의 어둠 속에서 밤새 계속 흔들면서 배양합니다. 다음 날, 각 배아를 0.5%PBST 1밀리리터로 2-3일 동안 셰이커에서 섭씨 4도에서 최소 3회 세척합니다.
그런 다음 하룻밤 동안 실온에서 빛으로부터 보호되는 1.5ml 튜브에서 굴절률이 1.49nd인 상업용 청정 시약에 각 배아를 배양합니다. 5X/0.1 조명 광학 장치 및 5X/0.16 감지 광학 장치를 설정합니다. 샘플 홀더와 샘플 모세관을 조립합니다.
시료 챔버에 투명 용액을 채워 준비합니다. 배아를 장착하려면 모세관의 직경에 맞도록 윗부분을 잘라내어 P200 피펫 팁을 준비하고 샘플 부착을 위해 뾰족한 부분을 제거합니다. 그런 다음 작은 불꽃을 사용하여 피펫 팁의 뭉툭한 끝을 녹입니다.
불꽃을 끄고 용융된 말단에 배아를 수직으로 빠르게 부착합니다. 피펫 팁의 윗부분을 샘플 모세관에 끼우고 준비된 샘플 챔버를 현미경에 넣습니다. 이미징 소프트웨어를 사용하여 Locate 탭 아래에서 Locate Capillary를 선택하고 X, Y 및 Z축을 조정합니다.
다음으로, Locate Sample(샘플 찾기)을 선택하고 0.6X로 확대/축소하여 배아에 초점을 맞춥니다. 챔버 버퍼가 파편이나 기포를 제거하기 위해 일정 시간 동안 배아와 평형을 이루도록 합니다. 이미지 획득의 경우 Acquisition 탭에서 Detective Objectives, Laser Blocking Filter, Beam Splitter, Cameras 및 Lasers와 같은 광 경로 매개변수를 정의합니다.
그림자 감소에 대한 Pivot Scan 확인란을 선택합니다. 그런 다음 획득 설정(Bit Bepth를 16비트로, Zoom을 0.36에서 0.7X 사이로 설정, 단일 사이트 조명 또는 이중 사이트 조명)으로 정의합니다. Continuous(연속)를 클릭하고 Laser Intensity(레이저 강도), Exposure Time(노출 시간), Laser Power(레이저 파워) 및 Light Sheet Position(광시트 위치)을 설정합니다.
그런 다음 Stop을 눌러 이미지 획득을 종료합니다. 개별 운동 신경에서 미세한 수목화된 구조의 이미지를 자세히 획득할 수 있도록 투명 샘플이 최단 광 경로 내에 위치하도록 하는 것이 중요합니다. 다차원 획득의 경우 첫 번째 이미지와 마지막 이미지의 z 위치를 이동하여 Z 스택을 정의합니다.
Optimal(최적)을 클릭하여 슬라이스 번호를 설정합니다. 그런 다음 실험 시작을 클릭하여 선택한 Z 스택을 획득합니다. 완료되면 이미지를 czi 형식으로 저장합니다.
축삭 수목화를 정량화하려면 상상 분석 소프트웨어에서 이미지 파일을 엽니다. Display Adjustment 창을 사용하여 이미지 색상, 밝기 및 대비를 조정하여 로컬 강도 대비를 기반으로 필라멘트를 감지합니다. 그런 다음 새 필라멘트 추가 아이콘을 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 자동 경로 알고리즘을 선택합니다.
관심 영역을 선택한 다음 슬라이스 모드를 사용하여 측정할 수 있는 가장 큰 직경과 가장 얇은 직경 측정값을 할당하여 시작점과 시드 점을 정의합니다. 관심 영역의 가장자리에 시작점을 지정합니다. 시작점을 수동으로 추가하거나 제거하려면 먼저 포인터 모드를 변경하고, 선택을 탐색한 다음, Shift 키를 누르고 관심 지점을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다.
다음으로, 시드 포인트에 대한 수동 임계값을 선택하여 보이는 모든 수목화가 표시되었는지 확인합니다. 그런 다음 시드 점을 수동으로 추가하거나 제거합니다. Remove Disconnected Segments 상자를 선택하고 시작점 주위의 시드 점을 제거합니다.
그런 다음 배경 빼기에 대한 임계값을 조정하고 프로세스를 마칩니다. 정확한 정량화를 위해 배경 아티팩트를 제거하고 검출기 경로가 실제 축삭 수목화를 반영하는지 확인해야 합니다. 마지막에 원하는 스타일과 색상을 선택합니다.
Statistics 탭에서 Detailed를 선택하고 필라멘트 번호, 수상돌기 말단점을 사용하여 운동 신경 말단을 운동 축삭 수화의 지표로 정량화합니다. 그런 다음 재구성된 축삭돌기의 이미지를 tiff 파일로 내보냅니다. LSFM은 마우스 배아의 운동 축삭 arborization에 대한 상세한 3D 시각화를 제공합니다.
운동 뉴런은 위에서 설명한 프로토콜에 따라 유전자 변형으로 발현된 GFP로 표지됩니다. 축삭 수목화를 보다 자세히 이미지화하고 정량화를 수행하기 위해 배율을 조정하여 미세하게 수화된 모든 구조를 드러낼 수 있습니다. 마지막으로, 개별 앞다리 신경의 축삭돌기 수목 형성 패턴은 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 재구성할 수 있습니다.
소프트웨어의 자동 경로 알고리즘은 필라멘트를 추적하고 축삭 말단의 총 수를 정량화합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 광시트 형광 현미경을 사용하여 마우스 배아의 샘플을 준비하고 운동 뉴런 축삭을 이미지화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 또한 MRS에 의해 각 개별 운동 신경의 수목 패턴을 정량적으로 평가하는 방법을 알게 될 것입니다.
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개요
이 연구는 형질전환 Hb9::GFP 마우스 배아에서 운동 뉴런 투영 및 축삭 분지를 시각화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 광판 형광 현미경을 사용하여 이 방법은 축삭 패턴의 정성적 및 정량적 평가를 가능하게 하여 운동 뉴런 발달에 대한 이해를 발전시킵니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 신경 발달
- 이미징 기술
배경
- 이 프로토콜은 복잡한 움직임을 조정하는 데 필수적인 운동 뉴런에 중점을 둡니다.
- 운동 뉴런 축삭 분지는 기능적 신경 회로에 중요합니다.
- 이러한 패턴을 이해하면 신경 발달 과정에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.
연구 목적
- 운동 뉴런 축삭 분지를 시각화하고 정량적으로 분석하기 위함입니다.
- 다른 뉴런 탐색 과정에 적용할 수 있는 방법을 수립하기 위함입니다.
- 마우스 배아에서 운동 뉴런 발달에 대한 이해를 향상시키기 위함입니다.
사용된 방법
- 주요 플랫폼으로는 광판 형광 현미경이 사용됩니다.
- Hb9 프로모터 아래에서 GFP를 발현하는 마우스 배아가 생물학적 모델로 사용됩니다.
- 배아는 면역염색 및 클리어링 기술을 통해 이미징 전에 준비됩니다.
- 주요 단계에는 시료의 고정, 투과성 처리 및 항체 배양이 포함됩니다.
주요 결과
- 결과는 3D에서 축삭 분지의 세부 사항을 시각화할 수 있는 능력을 확인합니다.
- 정량적 분석을 통해 개별 운동 신경의 분지 패턴 평가가 용이합니다.
- 이 방법을 사용하면 복잡한 구조를 보여주기 위해 배율을 조정할 수 있습니다.
결론
- 이 연구는 운동 뉴런 발달을 분석하기 위한 견고한 프로토콜을 시연합니다.
- 이 방법은 뉴런 행동에 대한 통찰력을 향상시키고 다른 연구에서의 잠재적 적용을 가능하게 합니다.
- 연구 결과는 운동 기반 신경 메커니즘에 대한 보다 광범위한 이해에 기여합니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Visualizing motor axon navigation and arborization in mouse embryos provides mechanistic insights into neurodevelopmental processes relevant to target validation in neurodegenerative disease models. Quantitative assessment of axon terminal patterns supports predictive confidence in evaluating genetic or pharmacological interventions affecting motor neuron connectivity. This approach enables early de-risking of therapeutic hypotheses by linking molecular perturbations to structural phenotypes in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing motor axon trajectory defects in genetic mutants or disease models.
- Operational Value: Supports functional target validation through quantitative analysis of axon arborization as a phenotypic readout.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by correlating molecular changes with neurodevelopmental outcomes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible 3D imaging data suitable for high-content screening of compound libraries.
- Quantitative Output: Provides filament number and terminal point measurements enabling dose-response analysis of axon growth inhibitors or enhancers.
- Scalability: Compatible with clearing and immunostaining workflows adaptable to multi-well embryo processing.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly applicable to motor neuron disease models (e.g., ALS, SMA) using Hb9::GFP reporter lines to assess axonal pathology.
- Translational Continuity: Bridges discovery phenotypes to preclinical validation by quantifying arborization deficits predictive of functional impairment.
- Biomarker Alignment: Axon terminal counts serve as quantifiable histopathological endpoints correlating with motor circuit integrity.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing structural phenotyping downstream of target engagement and upstream of functional behavioral assays in motor neuron disease models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of axon guidance molecules via qualitative and quantitative arborization profiling.
- Screening: Enables assay standardization through consistent clearing, staining, and imaging parameters across genetic backgrounds.
- Analytics: Generates morphometric data (filament count, terminal points) for statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects structural phenotypes to functional outcomes in preclinical models of motor neuron degeneration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for neurodevelopmental and neurodegeneration programs across multiple therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in motor neuron development studies through direct visualization of axon patterning.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized fixation, clearing, and imaging protocols applicable across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing structural validation of target modulation in neurodevelopmental pathways.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on axon arborization profiles in disease-relevant embryonic systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic dissection, immunostaining, and optical clearing techniques.
- Dependent on access to light sheet fluorescence microscopy and compatible image analysis software (e.g., Imaris).
- Necessitates standardization of antibody incubation and washing steps to minimize variability in GFP signal detection.
- Adaptation to alternative models may require optimization of clearing reagents and refractive index matching.
- Practical limitations include embryo size constraints and potential signal quenching during prolonged clearing or storage.
