후각 감각 축색 돌연변이 분자 식별 코드의 시각화를위한 뒷 전구의 4 배 면역 면역 측정법

본 면역조직화학 염색법의 전반적인 목적은 후각 신경세포의 축삭 말단에서 축삭 분류 분자들의 결합 발현을 시각화하는 것입니다. 이 방법은 축삭 유도, 시냅스 형성 및 후각 신경세포의 재생과 같은 후각 발달 분야의 핵심 과정을 규명하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 절편 간의 편차를 유지하지 않고 후각구 내 축삭 분류 분자들의 발현 패턴을 비교 및 분석할 수 있다는 점입니다.

몰드 내 후각 조직 샘플의 위치와 각도를 말로 설명하기 어렵기 때문에, 임베딩 단계의 학습이 까다로우며 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 4%paraformaldehyde를 이용한 심장 관류 고정 처리가 된 생후 1~2주 된 마우스의 머리 부분으로 시작합니다. 가위 날을 위아래 치아 사이의 공간에 삽입하고, 수평으로 절개하여 아래턱뼈를 제거합니다.

그다음 핀셋과 가위로 불필요한 조직을 잘라내어, 후각구와 후각 상피를 포함한 후각 조직만 남깁니다. 후각 조직을 PBS에 담가 비강 내의 공기를 제거한 후, 수직으로 절개하여 뇌의 후방부를 제거하고, 절단면이 아래로 향하게 하여 임베딩 몰드 바닥에 후각 조직을 놓습니다. 몰드에 OCT 화합물을 채운 다음, 액체 질소에 담급니다.

조직과 OCT가 완전히 얼면, 크라이오스탯(cryostat) 내에서 조직을 20 °C로 1시간 동안 평형화합니다. 이제 크라이오스탯을 사용하여 후각구의 연속 파라사지탈(parasaggital) 절편을 만들고, MAS 코팅 유리 슬라이드에 부착하여 수집합니다. 부착 후에는 헤어드라이어로 슬라이드를 즉시 건조시킵니다.

건조된 슬라이드를 실온에서 5분 동안 PBS로 세척하여 면역염색을 시작합니다. 실온에서 5% blocking solution으로 슬라이드를 1시간 동안 배양하여 비특이적 결합 부위를 차단합니다. 그런 다음, 1% blocking solution에 희석한 1차 항체 칵테일 400 microliters를 각 슬라이드에 추가합니다.

슬라이드를 상온에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 1차 항체 용액을 제거하고 상온에서 PBST로 5분씩 3회 세척합니다. 그 다음, 각 슬라이드에 2차 항체와 PBS 혼합액 400 µL를 첨가합니다.

빛을 차단한 상태에서 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후 용액을 버리고, 실온의 PBS로 슬라이드를 다시 5분씩 3회 세척합니다. 마지막으로, 각 슬라이드에 마운팅 매질을 두 방울씩 떨어뜨리고 커버슬립을 덮은 뒤 기포를 제거하여 슬라이드를 마운팅합니다.

각 형광체에 적합한 필터를 사용하여 형광 현미경으로 형광 이미지를 획득합니다. 이미지의 형광 신호가 포화되지 않도록 노출 시간을 조정합니다. GLUT2의 면역형광 신호를 통해 사구체 구조를 정의합니다.

Image J를 사용하여 사구체 내 축삭 분류 분자의 염색 강도를 측정합니다. 이 이미지는 VGLUT2, 빨간색으로 표시된 Kirrel2, 녹색으로 표시된 Semaphorin 7A, 그리고 파란색으로 표시된 OLPC에 대한 항체로 면역 염색한 2주령 생쥐의 부시상 후각구 절편을 보여줍니다. 병합된 이미지는 사구체 분리에 관여하는 축삭 분류 분자들이 위치 독립적인 모자이크 패턴으로 발현됨을 보여줍니다.

각 사구체는 시냅스 전 마커인 VGLUT2의 형광 신호로 정의됩니다. 사구체 구조는 점선으로 표시되어 있습니다. 각 사구체에서 축삭 분류 분자의 신호 강도를 측정하였습니다.

여기서 보는 바와 같이, 축삭 분류 분자들은 각 사구체에서 서로 다르게 발현됩니다. 예를 들어, 사구체 3은 OLPC 수준이 높고 Semaphorin 7A 수준은 중간이며 Kirrel2 수준은 낮으며, 이러한 차이는 염색 강도를 측정하여 정량화할 수 있습니다. 반면 사구체 4는 OLPC 수준은 높고 Kirrel2와 Semaphorin 7A 수준은 낮습니다.

다시 한번, 이러한 차이는 염색 강도를 측정함으로써 정량화할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 일반적으로 권장되는 PFA 후고정 및 sucrose 용액 처리를 생략해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청한 후에는 단일 후각구 절편에 더 많은 사구체를 배치하는 방법과 다른 뇌 영역에도 적용 가능한 다중 항체를 이용한 고품질 면역염색 수행 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

희망을 잊지 마십시오, 이 방법이 귀하의 향후 실험 성공에 도움이 될 것입니다.