후각 감각 축색 돌연변이 분자 식별 코드의 시각화를위한 뒷 전구의 4 배 면역 면역 측정법

이 면역조직화학적 염색 방법의 전반적인 목표는 후각 감각 뉴런의 축삭 말단에서 축삭 분류 분자의 결합된 발현을 시각화하는 것입니다. 이 방법은 축삭 유도, 시냅스 형성 및 후각 감각 뉴런의 재생과 같은 후각 발달 분야의 주요 과정을 특성화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 과학자들이 단면 간의 지속적인 차이 없이 후각구에서 축삭돌기 분류 분자의 발현 패턴을 비교하고 분석할 수 있다는 것입니다.

이 방법의 시각적 시연은 금형에서 후각 조직 샘플의 위치와 각도를 말로 설명하기 어렵기 때문에 임베딩 단계를 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다. 생후 1주에서 2주 된 생쥐의 머리부터 시작하여 4%의 파라포름알데히드를 심장 내 관류로 고정합니다. 윗니와 아랫니 사이의 공간에 가위날을 삽입하고 수평으로 잘라 아래턱뼈를 제거합니다.

그런 다음 집게와 가위로 여분의 조직을 잘라내어 후각구와 후각 상피를 포함한 후각 조직을 남겨둡니다. 후각 조직을 PBS에 담궈 비강의 공기를 제거한 다음 수직 절단을 하여 뇌의 뒤쪽 부분을 제거하고 절단된 끝이 아래로 향하게 하여 후각 조직을 임베딩 몰드의 바닥에 놓습니다. 금형에 최적의 절단 온도 화합물을 채운 다음 액체 질소에 담그십시오.

조직과 OCT가 완전히 동결된 후 섭씨 20도의 저온 유지 장치에서 1시간 동안 조직을 평형화합니다. 이제 저온 유지 장치로 후각 전구의 연속적인 기형 부분을 만들고 MAS 코팅 유리 슬라이드에 붙어 수집합니다. 붙인 후에는 즉시 드라이어로 슬라이드를 말리십시오.

건조된 슬라이드를 실온에서 5분 동안 PBS로 세척하여 면역 염색을 시작합니다. 실온에서 5% 차단 용액으로 슬라이드를 1시간 동안 배양하여 비특이적 결합 부위를 차단합니다. 그런 다음 1% 차단 용액으로 희석된 1차 항체 칵테일 400마이크로리터를 각 슬라이드에 추가합니다.

슬라이드를 실온에서 밤새 배양합니다. 다음날, 1차 항체 용액을 버리고 실온에서 5분씩 PBST로 슬라이드를 3회 세척합니다. 그런 다음 400마이크로리터의 2차 항체 및 PBS 칵테일을 각 슬라이드에 추가합니다.

빛을 피하고 실온에서 1시간 동안 배양하십시오. 배양 후 용액을 버리고 실온에서 PBS로 슬라이드를 각각 5분씩 3회 세척합니다. 마지막으로, 각 슬라이드에 장착 매체를 두 방울 떨어뜨리고 커버 슬립을 놓고 기포를 제거하여 슬라이드에 커버 슬립을 장착합니다.

형광 현미경으로 각 형광체에 적합한 필터를 사용하여 형광 이미지를 획득합니다. 채도 없이 이미지의 형광 신호를 얻을 수 있도록 노출 시간을 조정합니다. GLUT2의 면역형광 신호로 사구체 구조를 정의합니다.

이미지 J를 사용하여 사구체 내 축삭돌기 분류 분자의 염색 강도를 측정합니다. 이 이미지는 VGLUT2, Kirrel2는 빨간색, Semaphorin 7A는 녹색, OLPC는 파란색으로 표시된 2주 된 마우스의 parasaggital 후각 전구 절편을 보여줍니다. 병합된 이미지는 사구체 분리에 관여하는 축삭돌기 분류 분자가 위치 독립적인 모자이크 패턴으로 표현됨을 보여줍니다.

각 사구체는 시냅스전 마커 VGLUT2의 형광 신호에 의해 정의됩니다. 사구체 구조는 점선으로 둘러싸여 있습니다. 축삭돌기 분류 분자의 신호 강도를 각 사구체에서 측정했습니다.

여기에서 볼 수 있듯이 축삭 정렬 분자는 각 사구체에서 다르게 발현됩니다. 예를 들어, 사구체 3은 OLPC 수치가 높고, 세마포린 7A는 중간 수치, Kirrel2 수치는 낮으며, 이러한 차이는 염색 강도를 측정하여 정량화할 수 있습니다. 반면 사구체 4는 OLPC 수치가 높고, 키렐2와 세마포린 7A 수치가 낮습니다.

다시 말하지만, 이 차이는 염색 강도를 측정하여 정량화할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 일반적으로 권장되는 PFA로 고정하고 자당 용액으로 치료하는 것을 생략하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 단일 후각구 섹션에 더 많은 사구체를 배치하는 방법과 다른 뇌 영역에 적용할 수 있는 여러 항체를 사용하여 고품질 면역 염색을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 방법이 향후 실험에서 성공하는 데 도움이 되기를 바라는 것을 잊지 마십시오.