Name: 후각 감각 축색 돌연변이 분자 식별 코드의 시각화를위한 뒷 전구의 4 배 면역 면역 측정법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: 배우세요 후각 감각 신경원의 축색 돌연변이 분자 발현을 면역조직화학 염색으로 시각화하는 방법입니다. 이 기술은 후각 발달 과정에서 축색 유도와 시냅스 형성을 연구하는 데 필수적입니다.

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이 작품은 Mitsubishi Foundation, 다케다 과학 재단, JST PRESTO 및 JSPS KAKENHI 부여 번호 16H06144에 의해 지원되었습니다.

모든 실험 절차는 도쿄 대학의 동물 실험 윤리위원회의 승인과 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 도쿄 대학의 지침에 따라 수행되었습니다. 1. 솔루션 준비 <ol><li> 0.01 M 인산염 완충 식염수 (PBS)를 준비합니다 : PBS 정제 (0.14 M NaCl, 0.0027 M KCl, 0.010 M PO 4 3- , pH 7.4)를 증류수 1 L에 넣고 완전히 용해 될 때까지 실온에서 저어줍니다. </li><li> PBS에 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 준비합니다 : 100 ML PBS에 4g의 PFA를 추가합니다. 그것이 완전히 녹을 때까지 60 ° C에서 용액을 저어 준다. <ol><li> PBS에 PFA를 용해시킨 후, 1N 수산화 나트륨 (NaOH)으로 용액의 pH를 7.4로 조절한다. 그런 다음 얼음으로 식힌 다음 여과지를 통해 용액을 여과하여 미립자 물질을 제거합니다. 4 ° C에서 보관하십시오. 주의 :이 시약을 사용할 때는 적절한주의를 기울이십시오. 핸들장갑, 안전 안경 및 화학 물질 두건 아래 실험실 코트를 조심스럽게 사용하십시오. 참고 : 2 일 이내에 준비된 신선한 4 % PFA 용액을 사용하십시오. </li></ol></li><li> 0.3 % Triton X - 100 (PBST)가 보충 된 0.01M PBS를 준비하십시오 : PBS의 997 ML에 트리톤 X - 100 3 ML을 추가합니다. 용액이 완전히 녹을 때까지 실온에서 교반하십시오. </li><li> 1 % 및 5 % 블로킹 용액을 준비한다 : 탈지유 10g을 PBST 200mL에 넣고 5 % 블로킹 용액을 만든다. 그것이 완전히 녹을 때까지 실온에서 교반하십시오. PBST로 5 % 블로킹 용액을 5 번 희석하여 1 % 블로킹 용액을 제조한다. </li></ol> 2. Parasagittal OB 섹션의 준비 <ol><li> 1 ~ 2 주령의 동물을 사용하십시오. 사구체가 명확하게 보이고 두개골로 뇌를 절단 할 수 있기 때문에이 연령대는 다음 실험에 적합합니다. </li><li> pentobarbital (50 MG / kg 체중)의 intraperitoneal 주사로 동물을 마취. 얼음 냉 4 % P로 동물을 경련 주사한다.PBS의 FA. 조심해서 다루고 화학 물질 두건 아래에 장갑, 안전 고글 및 실험실 코트를 사용하십시오. </li><li> 관류 후 가위로 머리를 잘라 피부를 조심스럽게 제거하십시오. 그런 다음 가위 칼날을 위턱과 아래턱 사이의 공간에 삽입하고 수평으로 자르면서 아래턱을 제거합니다. OB 및 OE를 포함하여 후각 조직을 떠나려면 집게 및 가위로 과도한 조직을 정리하십시오. 참고 : OB를 둘러싸고있는 두개골을 제거하지 마십시오. 이것은 중간 사구체를 수직으로 똑바로 유지하기 때문에 OB를 둘러싼 두개골을 제거하지 마십시오. </li><li> 비강에있는 공기를 제거하기 위해 PBS에 후각 조직을 담그십시오. 뇌의 후부를 수직으로 잘라 내고 후각 조직을 삽입면의 아래쪽에 삽입하십시오. 몰드에 Optimal Cutting Temperature (OCT) 화합물을 채우고 액체 질소에 몰드를 담그십시오. <ol><li> 화합물에있는 조직이 완전히 얼린 후에, 그것을 cryos에서 품어 라.-20 ℃에서 1 시간 동안 배양한다. </li></ol></li><li> 저온 유지 장치를 사용하여 OB의 직렬 parasagittal 섹션 (10 μm)을 만들고 MAS 코팅 유리 슬라이드에 부착하여 수집하십시오. 붙인 후 즉시 블로 드라이어로 슬라이드를 건조하십시오. </li></ol> 3. 1 일째 : OB 슬라이스의 4 배 Immunostaining <ol><li> RT에서 PBS로 5 분 슬라이드를 씻으십시오. 3 번 반복하십시오. </li><li> 실온에서 5 % 차단 솔루션과 슬라이드를 1 시간 품어 비특이적 인 바인딩 사이트를 차단합니다. </li><li> RT에서 1 % 차단 솔루션의 기본 항체 (각 슬라이드 400 μL)의 칵테일과 O / N 슬라이드를 품어. 기니피그 항 Kirrel2 항체 (1 : 1000), 염소 항 세마포린 -7A (Sema7A) 항체 (1 : 500), 래트 항 -OL- 프로토 커 들린 (OLPC) 항체 (1 : 500) 및 마우스 항 - 소 혈청 글루타메이트 트랜스 포터 2 (VGLUT2) 항체 (1 : 500). </li></ol> 4. 2 일째 : OB의 4 배 Immunostaining조각 <ol><li> 일차 항체 용액을 버리고 RT에서 PBST로 5 분 동안 슬라이드를 씻으십시오. 3 번 반복하십시오. </li><li> RT에서 PBS의 보조 항체 (각 슬라이드 400 μL)의 칵테일과 1 시간 슬라이드를 품어. 당나귀 항 마우스 Alexa Fluor 405 (1 : 400), 당나귀 방제 Alexa Fluor 488 (1 : 400), 당나귀 항 기니아 피그 Alexa Fluor 555 (1 : 400) 및 당나귀 항 - 쥐 Alexa Fluor 647 (1 : 400). 참고 : 모든 2 차 항체는 동일한 숙주에서 유래한다. 파장이 겹치지 않도록 각 1 차 항체에 대한 2 차 항체의 형광 파장을 선택하십시오. </li><li> 솔루션을 폐기하고 RT에서 PBS로 5 분 슬라이드를 씻으십시오. 3 번 반복하십시오. </li><li> 마운트 매체로 슬라이드에 coverslips를 마운트합니다. 이를 위해, 각 슬라이드에 장착 매체 2 방울을 적용한 다음, 기포를 제거하여 coverslip을 넣어. </li></ol> 5. 강도 Me의구심 <ol><li> 형광 현미경으로 형광 이미지를 얻습니다. Alexa Fluor 405 신호, GFP 필터 큐브 (470/40 nm 여기, 525/50 nm 방출, 500 nm 방출, 400 nm 다이크로 익 미러)에 대해 DAPI 필터 큐브 (360/40 nm 여기, 460/50 nm 방사 및 400 nm 다이크로 익 미러) 및 495 nm 다이크로 익 미러), Alexa Fluor 555 용 TRITC 필터 큐브 (545/25 nm 여기, 605/70 nm 방출 및 565 nm 다이크로 익 미러) 및 Cy5 필터 큐브 (620/60 nm 여기, 700 / 75 nm emission, 600 nm dichroic mirror)을 Alexa Fluor 647에 적용했습니다. 참고 : 채도가없는 이미지의 형광 신호를 얻으려면 노출 시간을 조정하십시오. </li><li> VGLUT2의 immunofluorescence 신호로 사구체 구조를 정의하십시오. ImageJ로 사구체 내 축삭 정렬 분자의 염색 강도를 측정합니다. </li></ol> 6. 데이터 분석 <ol><li> 축삭 정렬 분자의 얼룩 강도에서 배경 신호를 뺍니다. </li><li> 준비하기e 발현 데이터 매트릭스는 축삭 정렬 분자로 구성된 컬럼과 사구체로 구성된 행을 갖는다. </li><li> 준비된 표현 데이터 세트를 사용하여 주성분 분석 (PCA)을 수행하십시오. 그런 다음 각 주 구성 요소의 PCA 점수, 기여도 비율 및 요인 부하를 얻습니다. </li></ol>

<ol><li>Mori, K., Sakano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+is+the+olfactory+map+formed+and+interpreted+in+the+mammalian+brain%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">How is the olfactory map formed and interpreted in the mammalian brain?</a> Annu Rev Neurosci. 34, 467-499 (2011).</li>
<li>Takeuchi, H., Sakano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+map+formation+in+the+mouse+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Neural map formation in the mouse olfactory system.</a> Cell Mol Life Sci. 71, 3049-3057 (2014).</li>
<li>Mombaerts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+an+olfactory+sensory+map%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing an olfactory sensory map.</a> Cell. 87, 675-686 (1996).</li>
<li>Feinstein, P., Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+contextual+model+for+axonal+sorting+into+glomeruli+in+the+mouse+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A contextual model for axonal sorting into glomeruli in the mouse olfactory system.</a> Cell. 117, 817-831 (2004).</li>
<li>Ishii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoallelic+expression+of+the+odourant+receptor+gene+and+axonal+projection+of+olfactory+sensory+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cell%22%5BJournal%5D)">Monoallelic expression of the odourant receptor gene and axonal projection of olfactory sensory neurones.</a> Genes Cell. 6, 71-78 (2001).</li>
<li>Nakashima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agonist-independent+GPCR+activity+regulates+anterior-posterior+targeting+of+olfactory+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Agonist-independent GPCR activity regulates anterior-posterior targeting of olfactory sensory neurons.</a> Cell. 154, 1314-1325 (2013).</li>
<li>Serizawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neuronal+identity+code+for+the+odorant+receptor-specific+and+activity-dependent+axon+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A neuronal identity code for the odorant receptor-specific and activity-dependent axon sorting.</a> Cell. 127, 1057-1069 (2006).</li>
<li>Kaneko-Goto, T., Yoshihara, S., Miyazaki, H., Yoshihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BIG-2+mediates+olfactory+axon+convergence+to+target+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">BIG-2 mediates olfactory axon convergence to target glomeruli.</a> Neuron. 57, 834-846 (2008).</li>
<li>Ihara, N., Nakashima, A., Hoshina, N., Ikegaya, Y., Takeuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+axon-sorting+molecules+in+mouse+olfactory+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neuro%22%5BJournal%5D)">Differential expression of axon-sorting molecules in mouse olfactory sensory neurons.</a> Eur J Neuro. 44, 1998-2003 (2016).</li>
<li>Williams, E. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delta+Protocadherin+10+is+Regulated+by+Activity+in+the+Mouse+Main+Olfactory+System%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Delta Protocadherin 10 is Regulated by Activity in the Mouse Main Olfactory System.</a> Front Neural Circuits. 5, 9(2011).</li>
<li>Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+anosmia+caused+by+a+targeted+disruption+of+the+mouse+olfactory+cyclic+nucleotide-gated+cation+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel.</a> Neuron. 17, 681-693 (1996).</li>
</ol>

저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

parasagittal OB 섹션의 4 배 면역 염색은 많은 수의 사구체에서 동시에 4 개의 축삭 정렬 분자의 발현 수준을 시각화하고 정량화 할 수있었습니다. 이러한 다변량 데이터를 PCA로 분석함으로써 이들 분자의 발현 특성을 추측 할 수 있습니다. 성공적인 염색을 위해서는 조직 샘플 준비가 매우 중요합니다. 일부 프로토콜은 조직을 4 % PFA로 후 고정시키고 cryoprotection을 위해 30 % sucrose로 치료해야한다고 제안했다. 그러나이 단계는이 프로토콜에서 생략되었습니다. 이는 대부분의 경우 이러한 단계가 염색 신호 강도를 감소시키고 배경을 증가시키기 때문입니다. 또한 염색 중 높은 배경을 피하기 위해 절편을 어느 단계에서나 말려서는 안됩니다. 최적의 염색 조건은 사용되는 조직과 항체의 종류에 따라 다릅니다. 그러므로, 그것은 필연적이다.y를 사용하여 각 실험의 특정 염색 조건을 결정합니다. 또한 1 차 ...

개발하는 동안, 뉴런은 서로 정확하게 연결되어 정상적인 뇌 기능에 중요한 적절한 신경 회로를 형성합니다. 뇌의 비정상적인 신경 회로는 자폐증 및 정신 분열증과 같은 정신 장애의 원인으로 여겨지므로 신경 회로 형성 메커니즘을 이해하는 것이 신경 과학 분야의 주요 과제 중 하나입니다. 마우스 후각 시스템에서 Olfactory Epithelium (OE)의 각 감각 신경 세포 (OSN)는 오직 하나의 기능적 후각 수용체 (OR) 유전자를 발현하고 동일한 OR을 발현하는 OSNs는 축색 돌기의 고정 된 위치에서 사구체의 특정 쌍에 축삭을 수렴시킵니다. 후각 망막 (OB) 1 , 2 . 마우스 후각 시스템은 신경 회로 형성의 분자 메커니즘을 연구하기위한 훌륭한 모델 시스템입니다. 연구자는 OR 표현을 활용하여 특정 s를 식별 할 수 있기 때문에OSNs의 ubtype과 명확한 사구체 구조로 OSN axons의 투영 사이트를 시각화. OSN 예측의 주목할만한 특징은 OR이 OSN 축색 돌기를 OB 3 , 4 , 5 , 6 에 투사 할 때 중요한 역할을한다는 점입니다. 보다 구체적으로, OSN 축삭 돌기가 표적 부위를 대략적으로 안내 한 후에, 이들은 분리되어 OR 의존성 방식으로 사구체를 형성한다. 이전의 연구는 OR 분자가 사구체 분리를 조절하는 축삭 정렬 분자의 발현을 조절한다는 것을 보여 주었다. 더욱이 축적 된 증거에 따르면 OR 분자는 축삭 정렬 분자의 독특한 조합에 의해 신경 신원 코드를 생성한다. 따라서, OR 의존성 사구체 분리의 메커니즘을 이해하기 위해서는 axon-sorting mol의 발현 프로파일을 특성화 할 필요가있다OSNs의 ecules. 형광 면역 염색은 특정 유전자의 발현을 시각화하는 일반적인 방법입니다. axon-sorting 분자의 단백질은 주로 OSN 축삭에 국한되어 있기 때문에 연구자들은 OBN을 이용하여 OSN에서의 발현 양상을 분석 할 필요가있다. OB의 관상 절편은 면역 염색에 일상적으로 사용되었습니다. 그러나,이 준비는 같은 OB 섹션에서 전후 축을 따라 지형 정보를 잃습니다. 따라서 우리는 OB의 내측의 parasagittal 준비를 개발했다. 이것은 같은 OB 구역에서 가능한 한 많은 주변 사구를 장착 할 수있다. 여러 항체를 이용한 면역 염색과 결합하여, OB 절 사이의 염색 변이없이 축삭 정렬 분자의 발현 양상을 비교 분석 할 수 있습니다. 또한, 면역 조직 화학 염색 방법은 PFA a와 함께 고정 후 (post-fixation)없이 제시되었다자당 치료. 이 방법을 통해 연구자는 다 변수 데이터 분석을위한 고품질의 염색 데이터를 얻을 수 있습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 후각 신경 회로 형성을 연구하는 연구자에게 강력한 방법에 대한 세부 정보를 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS) 정제, pH7.4</td><td>TAKARA BIO</td><td>T9181</td><td></td></tr><tr><td>탈지 우유</td><td>nacalai tesque</td><td>31149-75</td><td></td></tr><tr><td>염소 항-Sema7A 항체</td><td>R& D Systems</td><td>AF2068</td><td></td></tr><tr><td>rat anti-OLPC 항체</td><td>Merck Millipore</td><td>MABT20</td><td></td></tr><tr><td>마우스 anti-VGLUT2 항체</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB5504</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-BIG-2 항체</td><td>R& D Systems</td><td>AF2205</td><td></td></tr><tr><td>구네아 돼지 anti-Kirrel2 항체</td><td>Operon Biotechnologies</td><td></td><td>Anti-Kirrel2 항체는 KLH-conjugated synthetic peptides (644-673aa)로 기니피그를 면역시킴으로써 생성되었습니다: CRLYRARAGYLTTPHPRAFTSYMKPTSFGP</td></tr><tr><td>당나귀 안티-마우스 Alexa Fluor 405</td><td>Abcam</td><td>ab175658</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 안티-염소 Alexa Fluor 488&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-545-003</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 안티 기니피그 Alexa Fluor 555</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21432</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 안티 랫 Alexa Fluor 647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>712-605-153</td><td></td></tr><tr><td>파라 포름 알데히드 (PFA)</td> <td>Wako</td><td>162-16065</td><td></td></tr><tr><td>MAS 코팅 슬라이드 안경</td><td>MATSUNAMI</td><td>MAS-01</td><td></td></tr><tr><td>집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11253-27</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>해부가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td></td></tr>형<tr><td>광현미경</td><td>KEYENCE</td><td>BZ-X700</td><td></td></tr><tr><td>DAPI 필터 큐브</td><td>KEYENCE</td><td>OP-87762</td><td></td></tr><tr><td>GFP 필터 큐브</td><td>KEYENCE</td><td>OP-87763</td><td></td></tr><tr><td>TRITC 필터 큐브</td><td>KEYENCE</td><td>OP-87764</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 필터 큐브</td><td>KEYENCE</td><td>OP-87766</td><td></td></tr><tr><td>여과지</td><td>ADVANTEC</td><td>00011185</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T 컴파운드</td><td>사쿠라 파인텍</td><td>M71484</td><td></td></tr></tbody></table>

후각 감각 축색 돌연변이 분자 식별 코드의 시각화를위한 뒷 전구의 4 배 면역 면역 측정법

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

마우스 후각 시스템은 간단한 해부학 구조로 인해 신경 회로 형성 메커니즘을 연구하는 데 자주 사용됩니다. 후각 감각 뉴런 (OSN)은 단일 수상 돌기 및 단일 비 축삭 축색 돌기가있는 양극성 세포입니다. OSN은 하나의 후각 수용체 (OR) 유전자 만 발현하며, 주어진 유형의 OR을 표현하는 OSN은 그들의 축색 돌기를 후각 망막 (OB)의 불변성 사구체에 수렴시킵니다. OSN 예측의 두드러진 특징은 표현 된 OR이 축삭 투영에서 중요한 역할을한다는 점입니다. OR는 다중 axon-sorting 분자의 발현을 조절하고 OSN 축삭 말단에서 axon-sorting 분자의 조합 분자 코드를 생성한다. 따라서, OR- 특정 axon 유도 메커니즘의 분자 메커니즘을 이해하기 위해서는 동일한 사구체 내의 OSN 축삭 말단에서 그들의 발현 프로파일을 특성화하는 것이 중요합니다. 이 기사의 목적은 가능한 많은 사구체를 수집하는 방법을 소개하는 것이 었습니다e를 단일 OB 부위에 투여하고 다중 항체를 사용하여 면역 염색을 수행한다. 이것은 OB 절 사이의 얼룩 변이없이 축색 - 정렬 분자의 발현 양상을 비교 분석 할 수있게한다.

후각 사구체지도는 OSN 축삭 1 , 2 의 초기 전역 표적화 및 사후 사구체 분리에 의해 형성됩니다. 사구체 분리는 ax / sorting 분자에 의해 매개되는 접착 성 / 반발 축삭 상호 작용에 의해 조절됩니다.이 분자의 발현 수준은 발현 된 OR 분자에 의해 결정됩니다. 사구체 분리에 관련된 axon-sorting 분자는 OB 9 에서 위치 독립적 인 모자이크 방식으로 표현됩니다. 본 연구에서는 Kirrel2 , Sema7A , OLPC , BIG-2, PCDH17 유전자를 선정 하였다. 이러한 축삭 정렬 분자 중 일부는 활성 의존적 인 방식으로 표현됩니다 ( 7 , <sup ...

후각 감각 뉴런은 적절한 신경 회로를 만들기 위해 다양한 축삭 정렬 분자를 발현합니다. 이 프로토콜은 후각 감각 뉴런의 축삭 종말에 축삭 - 정렬 분자의 조합 표현을 시각화하기 위해 면역 조직 화학 염색법을 설명합니다.

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...

본 면역조직화학 염색법의 전반적인 목적은 후각 신경세포의 축삭 말단에서 축삭 분류 분자들의 결합 발현을 시각화하는 것입니다. 이 방법은 축삭 유도, 시냅스 형성 및 후각 신경세포의 재생과 같은 후각 발달 분야의 핵심 과정을 규명하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 절편 간의 편차를 유지하지 않고 후각구 내 축삭 분류 분자들의 발현 패턴을 비교 및 분석할 수 있다는 점입니다.몰드 내 후각 조직 샘플의 위치와 각도를 말로 설명하기 어렵기 때문에, 임베딩 단계의 학습이 까다로우며 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 4%paraformaldehyde를 이용한 심장 관류 고정 처리가 된 생후 1~2주 된 마우스의 머리 부분으로 시작합니다. 가위 날을 위아래 치아 사이의 공간에 삽입하고, 수평으로 절개하여 아래턱뼈를 제거합니다.그다음 핀셋과 가위로 불필요한 조직을 잘라내어, 후각구와 후각 상피를 포함한 후각 조직만 남깁니다. 후각 조직을 PBS에 담가 비강 내의 공기를 제거한 후, 수직으로 절개하여 뇌의 후방부를 제거하고, 절단면이 아래로 향하게 하여 임베딩 몰드 바닥에 후각 조직을 놓습니다. 몰드에 OCT 화합물을 채운 다음, 액체 질소에 담급니다.조직과 OCT가 완전히 얼면, 크라이오스탯(cryostat) 내에서 조직을 20 °C로 1시간 동안 평형화합니다. 이제 크라이오스탯을 사용하여 후각구의 연속 파라사지탈(parasaggital) 절편을 만들고, MAS 코팅 유리 슬라이드에 부착하여 수집합니다. 부착 후에는 헤어드라이어로 슬라이드를 즉시 건조시킵니다.건조된 슬라이드를 실온에서 5분 동안 PBS로 세척하여 면역염색을 시작합니다. 실온에서 5% blocking solution으로 슬라이드를 1시간 동안 배양하여 비특이적 결합 부위를 차단합니다. 그런 다음, 1% blocking solution에 희석한 1차 항체 칵테일 400 microliters를 각 슬라이드에 추가합니다.슬라이드를 상온에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 1차 항체 용액을 제거하고 상온에서 PBST로 5분씩 3회 세척합니다. 그 다음, 각 슬라이드에 2차 항체와 PBS 혼합액 400 µL를 첨가합니다.빛을 차단한 상태에서 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후 용액을 버리고, 실온의 PBS로 슬라이드를 다시 5분씩 3회 세척합니다. 마지막으로, 각 슬라이드에 마운팅 매질을 두 방울씩 떨어뜨리고 커버슬립을 덮은 뒤 기포를 제거하여 슬라이드를 마운팅합니다.각 형광체에 적합한 필터를 사용하여 형광 현미경으로 형광 이미지를 획득합니다. 이미지의 형광 신호가 포화되지 않도록 노출 시간을 조정합니다. GLUT2의 면역형광 신호를 통해 사구체 구조를 정의합니다.Image J를 사용하여 사구체 내 축삭 분류 분자의 염색 강도를 측정합니다. 이 이미지는 VGLUT2, 빨간색으로 표시된 Kirrel2, 녹색으로 표시된 Semaphorin 7A, 그리고 파란색으로 표시된 OLPC에 대한 항체로 면역 염색한 2주령 생쥐의 부시상 후각구 절편을 보여줍니다. 병합된 이미지는 사구체 분리에 관여하는 축삭 분류 분자들이 위치 독립적인 모자이크 패턴으로 발현됨을 보여줍니다.각 사구체는 시냅스 전 마커인 VGLUT2의 형광 신호로 정의됩니다. 사구체 구조는 점선으로 표시되어 있습니다. 각 사구체에서 축삭 분류 분자의 신호 강도를 측정하였습니다.여기서 보는 바와 같이, 축삭 분류 분자들은 각 사구체에서 서로 다르게 발현됩니다. 예를 들어, 사구체 3은 OLPC 수준이 높고 Semaphorin 7A 수준은 중간이며 Kirrel2 수준은 낮으며, 이러한 차이는 염색 강도를 측정하여 정량화할 수 있습니다. 반면 사구체 4는 OLPC 수준은 높고 Kirrel2와 Semaphorin 7A 수준은 낮습니다.다시 한번, 이러한 차이는 염색 강도를 측정함으로써 정량화할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 일반적으로 권장되는 PFA 후고정 및 sucrose 용액 처리를 생략해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청한 후에는 단일 후각구 절편에 더 많은 사구체를 배치하는 방법과 다른 뇌 영역에도 적용 가능한 다중 항체를 이용한 고품질 면역염색 수행 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.희망을 잊지 마십시오, 이 방법이 귀하의 향후 실험 성공에 도움이 될 것입니다.

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연구

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Neuroscience

신경과학

우리는 lentiviral 하나의 후각 감각 신경 세포의 축삭의 유전자 조작과 시각화를위한 기술 및 터미널 arborization을...

강한 감각 뉴런의 Lentivirus - 중재 유전자 조작 및 시각화 생체내에</em

이 문서는 생쥐의 후각 망울의 표면에지도 냄새 evoked 활동에 고유 광 신호와 flavoproteins autofluorescence 신호 이미징의 프로토콜을 제공합니다.

광 반사율과 Autofluorescence 신호를 사용하여 마우스 후각 망울에서 이미징 냄새 Evoked 활동

여기에서는 후각 수용체 뉴런(ORN)의 다양화와 관련된 분자 메커니즘을 더 잘 이해할 수 있도록 초파리 더듬이의 전체 마운트 면역 염색 과정을 설명합니다.

에있는 후각 수용체 뉴런의 전체 마운트 Immunolabeling<em&gt; 초파리</em&gt; 안테나

우리는 뉴런 형태와 시간 경과에 따른 발달을 시각화하기 위해 전기천공법과 후속 컨포칼 레이저 스캐닝 또는 다광자 현미경에 의한 후각 감각 뉴런의 생체 내 라벨링 프로토콜을 설명합니다.

모델로 후각 시스템은 축삭 성장 패턴 및 형태를 연구하는 생체

후각 감각 뉴런의 섬모는 신호 전달 캐스케이드의 단백질을 포함하고 있지만, 냉동 절편에서 그 분포에 대한 자세한 공간 분석은 어렵습니다. 여기에서는 전체 마운트 라벨링 및 섬모 단백질의 얼굴 시각화를 위한 최적화된 접근 방식에 대해 설명합니다.

마우스의 메인 후각 시스템의 섬모의 전체 마운트 라벨링

특정 세포 유형에 대한 유전자 발현을 국소화하는 것은 특정 항체가 없기 때문에 어려울 수 있습니다. 여기에서는 이중 형광 RNA in situ hybridization과 immunostaining을 결합하여 유전자 발현을 동시에 삼중 검출하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

더블 형광 결합<em&gt; 현장에서</em&gt; 마우스 뇌 섹션에서 세 가지 유전자의 발현의 검출을위한 Immunolabelling와 하이브리드

여기에서는 Xenopus laevis  의 후각구에서 온도 반응을 측정하고 분석하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.후각 수용체 뉴런과 승모세포는 다르게 염색된 후 칼슘 변화가 기록되며, 이는 코에서 유도된 온도 강하에 대한 전구의 일부 신경망의 민감도를 반영합니다.

의 후각 망울에서 칼슘의 변경 사항을 모니터링을 통해 온도에 의한 신경 세포의 활동을 기록<em&gt; Xenopus의의 laevis의</em

Xenopus tadpoles vivo에서 신경 시스템의 기능을 조사 하기 위해 독특한 플랫폼을 제공 합니다. 우리 생활에서 후 각 정보 처리를 평가 하는 방법론을 설명 Xenopus 애벌레 정상적인 양육 조건에서 또는 부상 후.

생활 Xenopus Tadpoles에 후 각 통로의 기능 평가

시투 혼성화(ISH)의 멀티플렉스는 성인 마우스의 전체 vagal ganglionic 복합체에서 2개의 G 단백질 결합 수용체 및 1개의 전사 인자에 대한 성적증명서를 동시에 시각화하기 위해 사용되었다. 이 프로토콜은 vagal 포렌트 뉴런의 전사 프로파일의 정확한 지도를 생성하는 데 사용할 수 있습니다.

시투 혼성화에서 멀티플렉스를 사용하여 마우스 Vagal afferent 뉴런에서 G 단백질 결합 수용체 발현의 검출

이 프로토콜은 후각 회로 어셈블리의 연구를 위한 안테나-뇌 explant 시스템의 해부 절차, 배양 조건 및 라이브 이미징을 기술한다.

초파리의 후각 회로 어셈블리의 타임랩스 이미징 연구를위한 Explant 시스템

배우세요 후각 감각 신경원의 축색 돌연변이 분자 발현을 면역조직화학 염색으로 시각화하는 방법입니다. 이 기술은 후각 발달 과정에서 축색 유도와 시냅스 형성을 연구하는 데 필수적입니다.

후각 감각 축색 돌연변이 분자 식별 코드의 시각화를위한 뒷 전구의 4 배 면역 면역 측정법

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