형광 현미경 검사 법으로 모니터링 하는 대칭 및 비대칭 솔루션 조건에서 충전된 Vesicles의 위상 동작

이 프로토콜의 전반적인 목표는 생리학적 조건에서 발견되는 고염도 환경과 막횡단 용액 비대칭이 막 위상 상태에 미치는 영향을 정량적으로 평가하는 것입니다. 세포 내부와 세포 외부의 솔루션은 매우 다릅니다. 우리의 방법은 용액 assymetry가 멤브레인 특성과 상 거동에 미치는 영향을 이해하는 데 도움이 됩니다.

우리 접근 방식의 주요 장점은 생리학적 완충 조건에서 소포를 준비할 수 있고 미세유체 장치를 사용하여 비대칭 완충 조건을 생성할 수 있다는 것입니다. 절차를 시작하려면 고운 사포로 PTFE 플레이트의 한쪽 면을 거칠게 만듭니다. 접시, 15ml 유리 바이알, 밀봉 가능한 유리 용기를 상업용 식기 세척 세제, 에탄올 및 클로로포름으로 세척합니다.

25마이크로리터 유리 주사기를 사용하여 클로로포름 함량 10-15마이크로리터의 지질 스톡을 깨끗하고 건조한 PTFE 플레이트의 거친 면에 증착합니다. 주사기 바늘로 지질 스톡을 펴서 균일한 지질 필름을 만듭니다. 핀셋을 사용하여 플레이트를 15ml 바이알로 옮깁니다.

플레이트를 섭씨 60도에서 가열하고 2시간 동안 건조시켜 용매를 증발시킵니다. 그런 다음 약 1cm 높이의 유리 용기에 탈이온수를 첨가합니다. 용기에 접시가 있는 바이알을 놓고 안정적이고 똑바로 유지되도록 하고 용기를 밀봉합니다.

지질 이중층이 섭씨 60도에서 4시간 동안 미리 팽창하도록 합니다. 그런 다음 용기에서 바이알을 꺼냅니다. 플라스틱 주사기에 5ml의 팽창 용액을 넣고 주사기 팁에 0.45마이크로미터 필터를 부착합니다.

여과된 팽창 용액을 바이알에 첨가하여 지질 필름에 수분을 공급합니다. 바이알의 뚜껑을 닫고 플라스틱 파라핀 필름으로 바이알을 밀봉합니다. 바이알을 섭씨 60도에서 하룻밤 동안 보관하여 GUV 응집체를 얻습니다.

열을 끈 후 한 시간 이내에 소포를 실온으로 식히십시오. 200 마이크로리터 플라스틱 마이크로 피펫 팁의 끝을 잘라 GUV 골재가 팁으로 유입될 수 있도록 합니다. 트리밍된 피펫 팁을 사용하여 골재와 50마이크로리터의 팽창 용액을 깨끗하고 건조한 2ml 바이알로 옮깁니다.

바이알에 950마이크로리터의 신선한 팽창 용액 또는 등장성 용액을 첨가하여 각각 대칭 또는 비대칭 용액 조건을 얻습니다. 혼합물을 위아래로 피펫팅한 다음 바이알을 여러 번 부드럽게 뒤집어 GUV를 다시 현탁시킵니다. 평가를 시작하려면 현미경 슬라이드의 실리콘 아이솔레이터에 GUV 현탁액 부분 표본을 놓습니다.

커버슬립으로 챔버를 밀봉합니다. 샘플이 5분 동안 재평형을 이루도록 합니다. 그런 다음 형광 현미경의 샘플 스테이지에 슬라이드를 놓고 배치당 최소 30 GUV의 이미지를 획득합니다.

이미지를 검사하여 이미지 GUV의 위상 상태를 확인합니다. 단일 액상 상태의 GUV는 구형이고 매끄럽고 멤브레인 전체에 균일하게 분포된 형광 라벨이 있습니다. 액체 정렬되고 무질서한 2상 상태의 GUV는 멤브레인 내에서 부드러운 경계를 가진 도메인으로 분할된 형광 라벨이 있는 구형입니다.

도메인이 소포 표면에서 자유롭게 확산되고 합쳐질 수 있는지 확인합니다. 2상 또는 3상 고체 액상 상태의 GUV는 일부 각도 경계로 반올림됩니다. 고체 배경의 액체 도메인은 확산을 나타내지 않아야 하지만 고체 도메인은 액체 배경에서 자유롭게 확산되어야 합니다.

각 이미지 GUV의 위상 상태가 식별되면 배치의 우세 위상 상태를 결정합니다. 우세 위상 상태가 근소한 다수인 경우 독립 샘플로 프로세스를 반복합니다. 미세유체 장치를 사용하기 전에 자당과 염 팽창 용액을 각각 최소 5밀리리터씩 준비하십시오.

0.45마이크로미터 필터를 통해 각 용액을 필터링합니다. 그런 다음 200마이크로리터 플라스틱 피펫 팁의 끝을 자르고 장치의 각 채널에 피펫 팁을 놓습니다. GUV를 준비하는 데 사용 된 것과 동일한 유형의 새로운 여과 된 팽창 용액 100 마이크로 리터를 장치 저장소에 추가하십시오.

각 피펫 팁에 5마이크로리터의 팽창 용액을 추가합니다. 900배 G에서 10분 동안 장치를 원심분리하여 장치 채널을 채웁니다. 그런 다음 1mL 유리 주사기에 동일한 여과된 팽창 용액을 채웁니다.

주사기에 튜브 길이를 연결합니다. 플런저가 완전히 눌리고 튜브에 용액이 채워질 때까지 튜브를 통해 팽창 용액을 밀어 넣습니다. 그런 다음 튜브를 배출구 채널에 연결하고 주사기 펌프에 주사기를 장착합니다.

다음으로, 압력 제어 장치를 미세유체 채널 입구에 연결합니다. 밸브가 닫혀 있는지 확인한 다음 압력을 세 개의 막대로 설정하십시오. 미세유체 장치를 도립 컨포칼 현미경의 샘플 스테이지에 놓습니다.

피펫을 사용하여 용액이 25-50 마이크로 리터 만 남을 때까지 장치 저장소에서 팽창 용액을 제거하십시오. 150마이크로리터의 GUV 현탁액을 저장소에 추가하고 현탁액을 부드러운 피펫팅과 혼합합니다. 분당 10마이크로리터의 속도로 20분 동안 또는 장치 트랩의 90% 이상이 사용될 때까지 주사기 펌프를 인출 모드로 실행합니다.

그런 다음 압력 제어 장치 밸브를 열어 미세 유체 장치의 링 밸브를 닫습니다. 주사기 펌프를 중지하고 장치에서 GUV의 컨포칼 이미지를 획득하기 전에 장치를 1시간 동안 그대로 두십시오. 다음으로, 피펫을 사용하여 저장소에서 GUV 현탁액을 제거하여 25-50 마이크로 리터 만 남겨 둡니다.

150 마이크로 리터의 다른 유형의 여과 된 팽창 용액을 저장소에 넣고 혼합물을 위아래로 부드럽게 피펫팅합니다. 이 과정을 최소 5회 반복하여 저장소의 용액을 완전히 교체하십시오. 회수 모드에서 주사기 펌프를 분당 10마이크로리터로 10분 동안 실행하여 마이크로 채널의 용액을 교체합니다.

그런 다음 유속을 분당 1마이크로리터로 줄입니다. 압력 제어 장치 밸브를 2초 동안 닫은 다음 밸브를 열고 주사기 펌프를 정지합니다. 컨포칼 이미지를 기록하기 전에 장치를 1시간 동안 그대로 두십시오.

온도 제어 챔버 준비를 시작하려면 먼저 2mm 두께의 커버슬립 창이 있는 알루미늄 열 흐름 어셈블리에 가시 튜브 피팅을 부착합니다. 커버슬립 중 하나에 고무 스페이서를 부착하여 관찰실을 형성합니다. 100마이크로리터의 GUV 현탁액을 관찰 챔버에 로드하고 커버슬립으로 챔버를 밀봉합니다.

어셈블리를 천천히 뒤집습니다. 알루미늄 챔버를 외부 수조에 연결합니다. 현미경 샘플 스테이지에 어셈블리를 장착합니다.

외부 수조를 원하는 가장 낮은 온도로 설정하고 시스템이 10-15분 동안 평형을 이루도록 합니다. GUV의 이미지를 획득하고 다양한 온도에서 위상 상태를 결정할 수 있습니다. GUV는 대칭 자당 또는 염 용액에서 DOGG와 계란 스핑고미엘린과 콜레스테롤의 다양한 비율로 제조되었습니다.

이들의 우세한 위상 상태는 형광 현미경 검사에 의해 측정되었습니다. 그런 다음 선택된 조성물을 상 거동에 대한 효과적인 용액 조건을 평가하기 위해 희석에 의해 비대칭 조건으로 전환했습니다. 비대칭 용액에서 GUV 상 거동을 추가로 조사하기 위해 GUV를 미세유체 장치에 갇혀 외부 용액을 완전히 교환할 수 있도록 했습니다.

포획된 GUV는 유체 교환 전후에 컨포칼 현미경으로 평가되었습니다. GUV 상 거동에 대한 유효 온도를 평가하기 위해 균일한 GUV에서 상분리된 GUV로의 비율을 온도 범위에서 모니터링했습니다. 데이터에서 시그모이드 패턴이 관찰되었으며, 이를 Boltzmann 모델에 적합시켰습니다.

위상 분리 GUV의 분율이 0.5인 온도는 적합 곡선에서 결정되었습니다. 이 방법은 막상 거동에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 응용 프로그램은 생리학적 조건에서 생체 분자의 막 간 상호 작용을 연구하는 것과 같은 다른 실험에도 사용할 수 있습니다.