Name: 형광 현미경 검사 법으로 모니터링 하는 대칭 및 비대칭 솔루션 조건에서 충전된 Vesicles의 위상 동작 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: 배우세요 형광 현미경 검사법으로 대칭 및 비대칭 솔루션 조건에서 충전된 거대 단층 소포(GUV)의 위상 동작을 정량적으로 평가하는 방법을. 생리학적 조건에서 막 특성과 위상 거동을 이해하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 연방 교육부 및 연구의 독일 막스 플랑크 협회 공동 투자 MaxSynBio 컨소시엄의 일부입니다.

저자는 공개 없다.

대칭 및 비대칭 높은 염 분 조건 하에서 위상 상태 관찰에 대 한 GUVs의 성공적인 생산
여기에 제시 된 프로토콜 구성의 광범위 한 범위에 걸쳐 청구 GUVs의 막 단계 상태에 높은 염 분 버퍼 및 솔루션 비대칭의 영향을 평가 하는 전략을 소개 합니다. 이 목표 달성으로 주요 과제 중 하나는 높은 염 분 버퍼에 충전된 GUVs의 생산을 했다.
우리가 성공적으로 예금 된 지질 영화의 사전 수 화 단계와 소포 성장 위한 하룻밤 최종 수 화 단계를 포함 한 간단한 자발적인 붓기 접근에 의해 자당 솔루션에 높은 염 분 버퍼 GUVs를 생산. 그것은 지질 증 착도 지질 unilamellar 소포를 확산 있도록 roughened PTFE 접시에 수행 해야 하는 것이 중요. 또한, 지질 영화 균질 성 및 액체 단계 상태에는 온도에 소포 준비 하는 동안 모든 단계를 수행 하려면 필수적입니다. 다른, 소포 인구 구성에서 polydisperse 수 하 고 최종 인구 단계 상태 분석 편견 수 있습니다. GUVs 수율의 자발적인 붓기 기 덩어리는 한 손으로 다시 얻기 위해 작은 볼륨에서 중단 가능성에 대 한 특정 프로토콜 소포 분산 매우 집중 하 고 다른 한편으로 비대칭 솔루션을 제공 합니다. 소포8,28의 희석을 최소화 하면서 막에 걸쳐 조건. 그것은 소포 희석 또는 외부 솔루션 중 교환, 내부 및 외부 osmolarities 유지 일치 osmolarity 불일치에 의해 발생 하는 형태 변화 유도 또는 Lo + Ld 단계 분리41 을 방지 하거나, 당뇨의 경우 필수 조건, 기 파열 될 수 있습니다.
여기, 높은 염 분 솔루션에서 electroformation 프로토콜을 최적화 하려고 PVA 기반 붓기 multilamellar 소포 굴복 하는 동안 아무 GUVs의 생산에 결과. 자발적인 여 긴 준비 시간 및 낮은 품질10,17기 일괄에서 결과, 충전된 vesicles의 성공적인 생산을 요구 하더라도 붓기는 추가적인 이점을 함께 제공 됩니다. 그것은 통계 일괄 분석에 대 한 충분 한 수익률 발생 하면서 최소의 노력을 요구 하 고, electroformation와 달리 정교한 장비 또는 최적화 필요 했다. 또한, 지질 산화에 의해 아무 오염42,43관찰 되었습니다. 문학에 따르면 소포의 지질 구성 하 고 해당 주식7,17성장 했다 그들은 사이 차이가 있다. 또한, PTFE 기판에 소포 대형 기판23에 의해 외국 분자를 도입 젤 기반 붓기 방법 달리 어떤 오염 포함 메시지가 표시 되지 않습니다. Electroformation 비대칭 솔루션 조건을 만들 때 과도 한 소포 희석에 관련 된 추가 단점이 함께 제공 됩니다. GUVs electroformation에 의해 생산은 일반적으로 (달리 자발적인 붓기 동안 덩어리의 형태로 농축된 기 정지) 균질 분산으로 존재 한다. 외부 솔루션의 어떤 희석도 소포 수를 희석 실질적으로 것 이다. 또한, 관찰이 작업의 과정을 통해 DOPG/eSM/철 GUVs 자당에서 electroformation 제작한 불안정 한 경우에 높은 염 분 버퍼에 희석 되었다. 현미경 슬라이드에 지질 패치에서 형광 표시 그들의 시각적인 검사 가능 했다 전에 소포 버스트 것 이다. 이러한 불안정 소포 자발적인 붓기10여 그에 비해 electroformation에 의해 준비의 높은 막 긴장 관찰 될 수 있습니다.
그것만 높은 분수에 쓰 신 부분 외부 솔루션 exchange 수행 소포 희석은 비대칭 우두머리 솔루션 조건을 만드는 쉽고 빠른 접근, 비록 (여기: 95%, 그림 2), 희석, 시의 흔적으로 솔루션을 붓기 남아 있게 됩니다. 외부 솔루션 exchange의 학위의 붓기 솔루션 (2 절) 함께 기 덩어리를 pipetting와 너무 많이 그것을 diluting 하지 사이 교환 이다. 따라서, 우리는 세부37 신속 하 고 완전 한 외부 솔루션 exchange 우두머리 위상 상태 관찰 하는 동안 만든 희석 단계 상태 관측을 확인 하도록 허용 하는 다른 논의 대체 미세 접근 도입 소포입니다. 위상 상태 변이 대칭에서 비대칭 솔루션 조건으로 변경 하는 경우의 관측 될 계약에 실제로 관찰 되었다. 또한, 두 가지 방법 모두 비대칭 솔루션 조건 comparably 빠른 운항 표시 (비교 참고.8)을 생성 하 고 로컬 구성 변경 (참조30,31비교)의 알려진된 위험 없이 함께 하 막 긴장 (비교 참조32), 증가 하거나 지역 난방 (비교 기준33), 다른 방법에 대해서는 소개에서 설명 합니다. 미세 트래핑 중 기 내부와 외부 사이의 삼 투 균형은 위에서 언급 한 단계 상태 유물 뿐만 아니라 마 솔루션 조건으로 인해 발생 하는 디플레이션을 피하기 위해 유일한 에센셜 슬립 갇혀 GUVs를 발생할 수 있습니다. 통해 외부 솔루션 교환 후 게시물.
도 불구 하 고 자발적인 붓기 저격총 성장에 성공적으로 적용 된 다른 경우, 비용의 부재에서에서 DOPC/eSM/철 시스템에서 소포 우두머리 개별 bilayers44 사이 반발 작용의 결과 부족 붓기 저하 될 수 있습니다. . 미리 붓기 기간을 연장 또는 부피가 큰 지질 headgroups 도입이 문제45카운터 수 있습니다. 또한, 붓기에 사용에서 다른 솔루션에서 자신의 희석 후 소포 안정성 다른 지질 작곡과 우리 여기 조사 하지 않은 희석 미디어에 대 한 달라질 수 있습니다. 우리는 또한 여기 준비 방법으로 평균 우두머리 직경 튜닝의 가능성을 탐구 하지 있다. 하지만 소포 구성과 솔루션 붓기 같은 매개 변수는 결과 영향을 미칠 가능성이 높습니다. 그러나 다른 방법46 의 응용 지질 및 여기에 사용 되는 솔루션에 대 한 더 큰 소포를 얻을 수 있습니다, 그리고, 그들은 방법으로 관련 된 다른 단점에와 함께 올 수 있습니다. 위에서 설명한 접근 대칭 및 비대칭 높은 염 분 조건에서 GUVs를 생산 하는 소포 다른 지질 구성의 구성 및 다른 매체에 있는 분산의 추가 연구에 대 한 잠재적인 도구를 제공 합니다. 마찬가지로 우리는 그 가능성을 탐험 하지 않은, 향후 재판 어떻게 일반적으로 우두머리 준비 및 희석 방법 적용 될 수 있습니다 표시 됩니다.
다양 한 온도에서 상 분리 관찰
다양 한 온도에서 GUVs 연구에 적합 한 다른 실험 설정을 존재 합니다. 이 설정을 일반적으로 문학에서 자세히 설명 하지 않습니다, 하는 동안 현재 작업 이러한 연구에 대 한 해당 기본 어셈블리를 제공 합니다.
_content "> 제어 측정 표시이 자체 설계 및 챔버의 온도 정확 하 게는 서 모스 탯에 의해 제어 챔버 내부에 온도 기울기는 실험 온도 분해능. 그것은 실험 열 조건 온도 읽기와 일치 하는 보장 됩니다.
광범위 한 온도 범위 우두머리 위상 상태 평가 기간 동안 온도 변경 된 후 관찰된 소포 equilibrated 잘은 중요 하다. 이것을 보장 하기 위해 한 가지 가능한 방법은 히스테리시스를 확인 하는 것입니다. 있으면 히스테리시스, 온도 단계를 감소 해야 합니다 및/또는 평형 시간 증가. 온도로이 작품에서 제어 방식으로 설정 됩니다 물 기반 온도, 작업 온도 범위는 0-100 ° c.에 이상적으로 제한 이 범위를 확장할 수 있습니다 다른 온도 제어 액체 오일 등을 사용 하 여 또는 다른 설정, 예를 들어 채용 하 여 Peltier 장치. 실제로, 작동 온도 또한 가능한 응축 또는 증발에 의해 제한 됩니다. 또한, 멀리 실내 온도에서 온도, 관찰 실에서 정상 상태 온도 기울기의 발생 확률이 된다. 또한, 영상 장비 극단적인 온도에 다치 지 될 수 있습니다. 지질 기 연구 (9~ 10-50 ° C7,)에 대 한 적절 한 온도 범위에 대 한 관측 장비에 손상을 고려해 야 하지만 일반적으로 예상 하지.
소포 도메인 관찰 유물
넓은 필드 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 관찰 아티팩트에 대 한 소스도 많습니다. 우선, 하나 기 위상 상태의 시각적 검사에 대 한 적용 되는 개체의 최대 해상도 r 에 따라 지질 도메인의 검출 한계를 결정 합니다 알고 있어야 합니다. 
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56034/56034eq2v2.jpg"> 여기서 λ 는 방출 파장 하 고 나는 목표의 숫자 조리개. 40 x 확대 및 녹색 방출 감지 0.6의 나 일반적인 목표 빛 약 560 nm ~0.6 µ m. 따라서, 소포 사이 다른 특정 지질 혼합물에서 만든의 위상 상태를 비교 하는 연구는 광학 해상도 도달할 것 이다 조건 같은 지질 혼합물에 대 한 동일한 목표를 사용 해야 합니다.
다른 아티팩트는 여기 빛41에 확장된 노출 때문 지질 사진-산화의 결과로 지질 도메인의 발생 이다. 사진 손상 불포화 탄화수소 지질 moieties에 우선적으로 발생합니다. 사실, 일부 지질 구성에 대 한 이러한 도메인 형성 처음 균질 vesicles의 관찰 되었다 여기 여기 빛 노출 오랜된 기간 후 (~ 30 s). 그 문제에 대응 하기 위해 여기 빛 유지 되었다 초점 보기의 한 필드에서 위상 상태 평가 대 한 몇 초. 따라서, DiIC18 우리의 목적을 위해 적당 했다. 그러나 다른 염료,, 훨씬 더 중요 한 수 있으며 낮은 자극 강렬에 및 짧은 흥분 빛의 노출 시간으로 처리 해야 할 수 있습니다.
기계적 전단 응력은 소포의 피 펫 전송에서 잠재적으로 일시적으로, 그로 인하여 왜곡 명백한 기 위상 동작 도메인 믹스. 일부 일괄 처리에 대 한 다른 소포 보여 다른 위상 동작 0 분 및 5 분 후 피 펫 현미경 coverslip에 전송. 또한 미세 장치에서 유체 흐름에 의해 유도 된 전단 응력은47혼합 도메인을 보였다. 소포 충분 한 관찰 하기 전에 평형에 대 한 시간 동안 그대로 남겨져 야 한다. 이 연구에서 소포 미세 장치에 갇혀 소포 로드 및 관찰 하기 전에 솔루션 교환 후 1 시간에 그대로 남아 있었다.
위에서 언급 한 어려움 뿐만 아니라 빛의 회절 한계, 핵 자기 공명 분광학48 또는 슈퍼 해상도 현미경 기법49 등 다른 방법에 의해 부과 된 제한 중 일부를 피하기 위해 고용 될 수 있었다.
결론 및 전망
제시 작품 막 단계 분리에 높은 염 분 대칭 및 비대칭 솔루션 조건의 영향의 분석을 허용 하는 메서드 집합을 보여 줍니다. 제시 방법의 모두는 다른 응용 프로그램에 적합 합니다. 미세 소자는 예 도메인 형성 및 솔루션 비대칭의 유도 따라 실종의 속도 론을 공부 하는 플랫폼을 제공 한다. 또한, 도메인 모양 소금 농도의 기능으로는 그런 식으로 검사 수 있습니다. 모든 방법 또한 관심의 다른 솔루션을 사용 하 여 위상 동작에 영향을 보면 사용 수 있습니다.

이후 마이크론 크기에서 도메인의 액체-액체 상 분리 거 대 한 unilamellar 소포 (GUVs) 형광 현미경 검사 법에 의해 관찰, GUVs로 사용 되었습니다 모델 시스템 조사 지질 뗏목 가설1,2 , 3 . 로 그들의 독립형 bilayer의 지역 생물 세포에서 그의 범위에서 그들은 가설된 뗏목을 특징으로 하는 플라즈마 세포 막의 적당 한 모방 이다. 순수한 물, 자당 또는 낮은 염 분 솔루션4,5,6,,78에 분산 된 소포와 같은 GUVs에 대 한 수많은 연구 수행 되었습니다. 그러나 셀에 대 한 조건으로이 조건은, 높은 염 분 환경 및 횡단 막 솔루션 비대칭 biomembranes의 순수 관련 노출을 반영 하지 않습니다.
이 작품에서는, 우리의 그룹9에서 이전 간행물에서 충전된 multicomponent GUVs의 위상 상태는 막에 걸쳐 소금과 솔루션 비대칭의 존재의 기능으로 시험 되었다. GUVs는 dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG), 계란 sphingomyelin (eSM), 고 콜레스테롤 (철) (210 mOsm/kg의 osmolarity)와 자당 솔루션 또는 높은 염 분 버퍼 (100 m m NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5, 210의 다른 비율의 혼합물에서 준비 했다 mOsm/kg 기준)입니다. 지질 선택이 혼합6,8단계 도표에 이미 얻은 데이터에 의해 정당화 되었다.
GUVs의 준비에 대 한 메서드의 여러 문학10,,1112 에서 사용할 수 있습니다 (여기에 유의 우리 그 지질 석유 기반에서 수성 단계 전송 포함을 고려 하지 것입니다 13 , 14 단계 동작에 영향을 미칠 수 있는 막에 남아 있는 기름 잔류물의 고유한 위험 때문에). 높은 염 분 버퍼에서 GUVs의 준비는 구체적인 과제와 연결 됩니다. 낮은 이온 강도의 솔루션, electroformation 방법15,16 작은 결함10,17높은 수율에 GUVs를 준비 하는 빠른 방법을 제공 합니다. 메서드를 사용 하면 지질 층 전도성 표면 (전극)에 입금, 그들, 건조 및 AC 필드를 적용 하는 동안 그들을 용액으로 보습을 기반으로 합니다. 그러나,이 방법은 조정 경우 소금 수성 솔루션18,19에 존재 하는 필요 합니다. 그것은 electroformation에 의해 소포 성장 위한 원동력 electroosmosis16 높은 conductivities20에서 방해는 가정. 따라서, 높은 염 분 해결책에 GUVs의 electroswelling이 아니다 간단 접근 그것은 다른 소금 농도 붓기 솔루션에 대 한 최적화를 요구 한다. 젤 기반 소포21,22 붓기 더 빨리 형성 시간 electroformation에 잠재적인 대안 이다. 이 이렇게 젤 (agarose 또는 폴 리 비닐 알코올 (PVA))는 기판으로 사용 될 때 향상 된 지질 영화 화에 만듭니다. 그러나 이러한 접근, agarose 기반 붓기23 / 온도 제한 PVA 기반 붓기의 경우 경우 막 오염의 위험으로 온다. 마찬가지로, GUVs 셀 루 로스 종이 기판에 성장 하는 프로토콜 최근 설립된24되었습니다입니다. 이 방법의 일반적인 문제는 기판 순도 제어의 부족 뿐만 아니라 많은 양의 지질 사용 합니다. 이 작품에서 소개 하 고 우두머리 준비, 즉 자발적인 붓기 방법25,26에 대 한 가장 전통적인 방법의 장점을 제공 합니다 우리. 그것은 건조-수증기 분위기, 그리고 원하는 붓기 솔루션 이후 붓기에 하이드레이팅 lipophobic 기판에 지질 층의 구성 ( 그림 1 및 프로토콜 섹션에서 세부 정보 참조). 이 방법은 소포 크기 배포 제어를 제공 하지 않습니다와 생산 전기 분야에 의해 원조 된다 하는 방법에 비해 전반적으로 더 작은 소포 폴리머 기판 또는 미세 결과. 그러나, 소포 품질과 크기는 여기 탐험으로 막 단계 상태 검사 적합 합니다.
소포 막에 걸쳐 솔루션 사이의 불균형을 만들기 뿐만 아니라 특정 과제와 연결 됩니다. 일반적으로 사용 되는 한 가지 방법은 원하는 외부 솔루션27,28기 서 스 펜 션의 직접 희석입니다. 그러나,이 또한 기 분포 밀도를 줄인다. 또 다른 전략 천천히 GUVs 솔루션에 대 한 허용-흐름 셀의 하단에 정착 주위 외부 솔루션을 교환 하는 것입니다 그리고 outflux. 방해 또는 심지어 흐름 소포를 잃고을 피하기 위해, 낮은 흐름 요금은 적용된8,이 이렇게 비효율적인 시간을 렌더링 합니다. 또한, 이러한 방법의 전체 외부 솔루션 교환을 보장합니다. 외부 솔루션 교환 하는 동안 그들을 잃고 피하기 위하여 소포를 무력화 하는 확실 한 해결책이입니다. 예를 들어, biotinylated GUVs streptavidin 입히는 표면29에 곁에 있을 수 있습니다. 그러나,이 접근에는 준수 작곡 유사 이어질 수 있습니다 그리고 그러므로 비 준수 막30,31세그먼트. 자석의 응용 프로그램 또는 전기 분야를 부과 하는 막에 소포 결과 트랩 긴장32. 핸들 하는 데 필요한 함정에 기 하 광학 핀셋 채용 광 들 것을 사용 하 여 지역 난방33를 포함 수 있습니다 (즉, 구슬), 연결 된. GUVs의 트래핑 최종 분리34없이 백 금 철사에 그들을 성장 하 여 수행할 수 있습니다. 그러나 이것 얇은 지질 관 (밧줄)에 의해 소포는 격리 하 고 철사에 일반적으로 연결 되는 또는 다른 소포를 생성 합니다.
제시 일 상기 한계를 극복 하는 전략을 강조 한다. 우리는 먼저 적응 하 고 높은 염 분 버퍼에서 GUVs의 생산을 위한 최적화 된 자발적인 붓기 방법에 대 한 자세한 설명을 제시. 다음 효율적으로 간단한 희석 또는 미세 소자의 활용에 의해 비대칭 솔루션 상태를 만드는 두 가지 방법을 소개 합니다. 우리의 목표는 다른 솔루션 조건에서 GUVs의 막 단계 상태 분석, 때문에 성공적인 통계 분석에 대 한 기준 및 피 잘못 된 분류를 위한 현재 힌트 후속 섹션에 설명 합니다.
분석은 등온 조건에서 뿐만 아니라 다양 한 온도에서 수행 했다. 동안 온도 control 일반적으로 고용, 실험 온도-제어 약 실에 대 한 정보는 거의 설명. 여기, 다양 한 온도 조건에서 GUVs를 관찰 하는 자체 내장된 설치 제공 됩니다.

<table><tbody><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol), 나트륨 염</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840475C</td>, <td>텍스트에서 DOPG로 약칭</td></tr><tr><td>닭 달걀 sphingomyelin</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>860061</td><td>eSM</td></tr><tr><td>콜레스테롤 (양모, > 98 %)</td>로 약칭<td>Avanti Polar Lipids</td><td>700000</td><td>약칭 Chol</td></tr><tr><td>1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate</td><td>Molecular Probes</td><td>D-282</td><td>약칭 DiIC18</td></tr><tr><td>Chloroform, HPLC grade (&ge; 99.8 %)</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl (> 99.8 %)</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl (37 %)</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris (&ge; 99.9 %)</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>설탕 (&ge; 99.5 %)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>나사형 바이알 45x27 mm, 15 mL</td><td>Kimble</td><td></td><td>Soda flat bottom, 흰색 나사 캡</td></tr><tr><td>, pH 측정기</td><td>Mettler Toledo</td><td>MP220</td><td></td></tr><tr><td>삼투압계</td><td>Gonotec</td><td>Osmomat030</td><td></td></tr><tr><td>Epi-fluorescence microscope</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer D1</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 레이저 스캐닝 현미경</td><td>Leica</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Objective 40x, 0.6 NA</td><td>Zeiss</td><td>LD Achroplan</td><td></td></tr><tr><td>Objective 40x, 0.75 NA</td><td>Leica</td><td>506174</td><td></td></tr><tr><td>Objective 63x, 0.9 NA</td><td>Leica</td><td>506148</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드, 56x26 mm, 0.17 &plusmn; 0.01 mm</td><td>Menzel-Gl &auml; SER</td><td></td><td></td></tr><tr><td>커버 슬립, 22x22mm, 0.17 & 0.01mm</td><td>Menzel-Gl &auml; aser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm "M"</td><td>Bremix 유연 포장</td><td></td><td></td></tr><tr><td>주사기, 5 mL, 10 mL</td><td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.45 &micro; m 주사기 필터</td><td>GVS North America</td><td>Cameo 25AS, 1213723</td><td>아세테이트, 멸균</td></tr></tbody></table>

형광 현미경 검사 법으로 모니터링 하는 대칭 및 비대칭 솔루션 조건에서 충전된 vesicles의 위상 동작

Phase Behavior of Charged Vesicles Under Symmetric and Asymmetric Solution Conditions Monitored with Fluorescence Microscopy

거 대 한 unilamellar 단계 구분 된 소포 (GUVs) 공존 전시 액체 주문 하 고 액체 난잡 도메인은 지질 뗏목 가설을 조사 하는 일반적인 생물 도구. 그러나 다 수의 연구,, 생리 솔루션 조건의 영향을 게을리. 해당 계정에서 현재 작업 충전된 GUVs dioleylphosphatidylglycerol, 계란 sphingomyelin, 및 콜레스테롤에서 성장에 액체-액체 상 분리에 높은 염 분 버퍼와 트랜스 막 솔루션 비대칭의 효과 제공 합니다. 효과 등온 및 다양 한 온도 조건 하에서 공부 했다.
우리는 장비 및 실험 전략 대칭 및 비대칭 높은 염 분 솔루션 조건에서 충전된 소포에 공존 액체 도메인의 안정성 모니터링에 대 한 적용을 설명 합니다. 높은 온도에서 높은 염 분 버퍼에 충전된 multicomponent GUVs를 준비 하는 접근 방식을 포함 됩니다. 프로토콜 옵션을 소포 희석을 최소화 하면서 외부 솔루션의 부분 교환 간단한 희석 단계 수행을 수반 한다. 다른 접근은 완벽 한 외부 솔루션 교환을 허용 하는 미세 장치를 활용 하 여 제공 됩니다. 단계 분리에 솔루션 효과 또한 다양 한 온도에서 공부 했다. 이 위해, 우리는 기본 설계 및 유틸리티는 자체 내장된 온도 제어 챔버의 제시. 또한, 우리 우두머리 위상 상태 평가에 반영 함정 연관 그것과 그들을 회피 하는 방법.

단계 구분 된 거 대 한 unilamellar 소포 (GUVs)에 대 한 실험은 자주 생리 솔루션 조건 게을리. 이 작품 횡단 막 솔루션 비대칭 및 온도 기능으로 충전된 multicomponent GUVs에서 액체-액체 상 분리에 높은 염 분 버퍼의 효과 연구에 접근을 제공 합니다.

형광 현미경 검사 법으로 모니터링 하는 대칭 및 비대칭 솔루션 조건에서 충전된 Vesicles의 위상 동작

Phase-separated giant unilamellar vesicles (GUVs) exhibiting coexisting liquid-ordered and liquid-disordered domains are a common biophysical tool to ...

이 프로토콜의 전반적인 목적은 생리학적 조건에서 발견되는 고염분 환경과 초막 용액의 비대칭성이 막의 상 상태에 미치는 영향을 정량적으로 평가하는 것입니다. 세포 내부와 외부의 용액은 매우 다릅니다. 본 방법론은 용액의 비대칭성이 막의 특성과 상 거동에 미치는 영향을 이해하는 데 도움을 줍니다.본 접근 방식의 주요 장점은 생리적 완충액 조건에서 소포를 준비할 수 있으며, 미세유체 장치를 사용하여 비대칭 완충액 조건을 형성할 수 있다는 점입니다. 절차를 시작하기 위해, PTFE 플레이트의 한쪽 면을 고운 사포로 거칠게 만듭니다. 플레이트와 15 milliliter 유리 바이알, 그리고 밀폐 가능한 유리 용기를 상용 주방 세제, 에탄올 및 클로로포름으로 세척하십시오.25 µL 유리 시린지를 사용하여 클로로포름에 용해된 지질 스톡 10~15 µL를 깨끗하고 건조한 PTFE 플레이트의 거친 면에 분주합니다. 시린지 바늘로 지질 스톡을 펴서 균일한 지질 박막을 형성합니다. 핀셋을 사용하여 플레이트를 15 mL 바이알로 옮깁니다.플레이트를 60 °C에서 가열하고 2시간 동안 건조하여 용매를 증발시킵니다. 그런 다음, 유리 용기에 탈이온수를 약 1 cm 높이로 채웁니다. 플레이트가 담긴 바이알을 용기에 세워 안정적으로 배치한 후 용기를 밀봉합니다.지질 이중층을 60 °C에서 4시간 동안 미리 팽창시킵니다. 그런 다음, 용기에서 바이알을 꺼냅니다. 플라스틱 주사기로 팽창 용액 5 mL를 흡입하고 주사기 팁에 0.45 µm 필터를 부착합니다.여과된 팽창 용액을 바이알에 첨가하여 지질 막을 수화합니다. 바이알의 캡을 닫고 플라스틱 파라핀 필름으로 밀봉합니다. GUV 응집체를 얻기 위해 바이알을 60 °C에서 하룻밤 동안 보관합니다.열원에서 제거한 후 1시간 이내에 소포를 실온으로 냉각합니다. GUV 응집체를 팁 안으로 흡입할 수 있도록 200 µL 플라스틱 마이크로 피펫 팁의 끝부분을 잘라냅니다. 잘라낸 피펫 팁을 사용하여 응집체와 50 µL의 팽창 용액을 깨끗하고 건조한 2 mL 바이알로 옮깁니다.바이알에 950 µL의 신선한 팽창 용액 또는 등장성 용액을 추가하여 각각 대칭 또는 비대칭 용액 조건을 형성합니다. 혼합물을 피펫으로 빨아들였다가 내뱉기를 반복한 후, 바이알을 여러 번 천천히 뒤집어 GUV를 재현탁합니다. 분석을 시작하려면, GUV 현탁액의 일부를 현미경 슬라이드 위의 실리콘 격리기에 넣습니다.커버슬립으로 챔버를 밀봉합니다. 샘플이 5분 동안 재평형화되도록 둡니다. 그 다음, 슬라이드를 형광 현미경의 샘플 스테이지에 놓고 배치당 최소 30개의 GUV 이미지를 획득합니다.이미지를 검사하여 GUV의 상 상태를 결정합니다. 단일 액상 상태의 GUV는 구형이며 표면이 매끄럽고, 형광 표지가 막 전체에 균일하게 분포되어 있습니다. 액체 정렬 상과 무질서 상의 이상 상태인 GUV는 구형이며, 형광 표지가 막 내에서 매끄러운 경계를 가진 도메인으로 분리되어 분포합니다.도메인이 소포 표면에서 자유롭게 확산되며 융합될 수 있는지 확인하십시오. 2상 또는 3상의 고체-액체 상 상태에 있는 GUV는 일부 각진 경계가 있는 둥근 형태를 띱니다. 고체 배경 위의 액체 도메인은 확산을 보이지 않아야 하지만, 액체 배경 위의 고체 도메인은 자유롭게 확산되어야 합니다.각 이미지 GUV의 상 상태가 확인되면, 해당 배치의 지배적인 상 상태를 결정합니다. 지배적인 상 상태가 근소한 차이로 결정된 경우, 독립적인 샘플을 사용하여 이 과정을 반복하십시오. 마이크로플루이딕 장치를 사용하기 전에, sucrose 및 염 팽창 용액을 각각 최소 5 mL씩 준비하십시오.각 용액을 0.45 micrometer 필터로 여과합니다. 다음으로, 200 microliter 플라스틱 피펫 팁의 끝부분을 잘라내어 장치의 각 채널에 피펫 팁을 배치합니다. GUV를 준비하는 데 사용한 것과 동일한 종류의 신선하게 여과된 팽윤 용액(swelling solution) 100 microliters를 장치 리저버에 추가합니다.각 피펫 팁에 팽윤 용액 5 µL를 넣습니다. 장치 채널을 채우기 위해 장치를 900 ×g에서 10분 동안 원심 분리합니다. 그런 다음, 1 mL 유리 주사기에 동일한 여과된 팽윤 용액을 채웁니다.시린지에 적절한 길이의 튜브를 연결하십시오. 플런저가 완전히 내려가고 튜브가 용액으로 가득 찰 때까지 팽윤 용액을 튜브를 통해 밀어 넣습니다. 그런 다음, 튜브를 배출 채널에 연결하고 시린지를 시린지 펌프에 장착하십시오.다음으로, 압력 제어 장치를 미세유체 채널 입구에 연결합니다. 밸브가 닫혀 있는지 확인한 후 압력을 3 bar로 설정하십시오. 미세유체 장치를 도립 공초점 현미경의 시료 스테이지 위에 놓습니다.피펫을 사용하여 장치 리저버에서 팽윤 용액을 제거하여 25~50 µL의 용액만 남도록 합니다. 리저버에 GUV 현탁액 150 µL를 추가하고 부드럽게 피펫팅하여 현탁액을 혼합합니다. 시린지 펌프를 흡입 모드로 설정하고 10 µL/min의 속도로 20분 동안 또는 장치 트랩의 90% 이상이 채워질 때까지 작동시킵니다.그 다음, 압력 제어 장치의 밸브를 열어 미세유체 장치 내의 링 밸브를 닫습니다. 시린지 펌프를 멈추고, 장치 내 GUV의 공초점 이미지를 획득하기 전 한 시간 동안 그대로 둡니다. 이어서, 피펫을 사용하여 리저버에서 GUV 현탁액을 제거하여 25~50 µL만 남깁니다.저장조에 다른 종류의 여과된 팽창 용액 150 µL를 추가하고 피펫으로 혼합물을 부드럽게 위아래로 섞어줍니다. 저장조 내의 용액을 완전히 교체하기 위해 이 과정을 최소 5회 반복합니다. 마이크로채널 내의 용액을 교체하기 위해 시린지 펌프를 흡입 모드로 설정하고 10 µL/min의 속도로 10분 동안 작동시킵니다.그 다음, 유속을 1 µL/min으로 낮춥니다. 압력 제어 장치의 밸브를 2초 동안 닫은 후, 밸브를 열고 시린지 펌프를 정지시킵니다. 공초점 이미지를 기록하기 전, 장치를 1시간 동안 그대로 둡니다.온도 조절 챔버 준비를 시작하려면, 먼저 2mm 두께의 커버슬립 윈도우가 장착된 알루미늄 열 유동 어셈블리에 바브 튜브 피팅을 부착하십시오. 관찰 챔버를 형성하기 위해 커버슬립 중 하나에 고무 스페이서를 부착합니다. 100 µL의 GUV 현탁액을 관찰 챔버에 넣고 커버슬립으로 챔버를 밀봉하십시오.어셈블리를 천천히 뒤집으십시오. 알루미늄 챔버를 외부 항온수조에 연결하십시오. 어셈블리를 현미경 시료 스테이지 위에 장착하십시오.외부 항온수조를 원하는 최저 온도로 설정하고 시스템이 10분에서 15분 동안 평형을 이룰 때까지 기다립니다. GUV의 이미지를 획득하고 다양한 온도에서의 상 상태를 결정합니다. GUV는 대칭적인 설탕 또는 염 용액에서 DOPG와 egg sphingomyelin 및 콜레스테롤의 다양한 비율로 준비되었습니다.형광 현미경을 통해 이들의 우세한 상 상태를 결정하였습니다. 이후 선택된 조성들을 희석하여 비대칭 조건으로 전이함으로써, 상 거동에 미치는 유효 용액 조건의 영향을 평가하였습니다. 비대칭 용액에서의 GUV 상 거동을 추가로 조사하기 위해, GUV를 미세 유체 장치 내에 포획하여 외부 용액을 완전히 교체하였습니다.포획된 GUV는 유체 교환 전후에 공초점 현미경으로 평가되었습니다. GUV 상 거동에 미치는 유효 온도를 평가하기 위해, 다양한 온도 범위에서 균일한 GUV 대비 상 분리된 GUV의 비율을 모니터링했습니다. 데이터에서 시그모이드 패턴이 관찰되었으며, 이를 Boltzmann 모델에 맞추어 피팅하였습니다.상분리된 GUV의 분율이 0.5가 되는 온도를 피팅 곡선을 통해 결정하였습니다. 이 방법은 막 상 거동에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 생리적 조건에서 생체분자와 막 사이의 상호작용을 연구하는 것과 같은 다른 실험에도 응용될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

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