3' 끝 시퀀싱 A seq2 라이브러리 준비

이 프로토콜 매핑 사전 mRNA 3' 최종 사이트를 처리 하는 방법을 설명 합니다.

이 방법의 전반적인 목표는 mRNA 3 프라임 말단을 캡처하고 염기서열분석을 통해 mRNA 처리, 특히 3 프라임 말단 절단 및 폴리아데닐화에 대한 연구와 유전자 발현의 정량화를 가능하게 하는 것입니다. 여기에 제시된 A-seq2 프로토콜과 데이터 분석 패키지는 다양한 세포 유형 및 조직에서 전사체 동형의 생성 및 기능에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. A-seq2 방법의 주요 장점은 긴 폴리(A) 스트레치를 통한 시퀀싱을 피하고 어댑터 이량체를 생성하지 않는다는 것입니다.

이 절차에는 80% 농도로 성장한 세포가 사용됩니다. 성장 배지를 제거하고 PBS로 세포를 한 번 씻습니다. 웰당 1ml의 용해 완충액을 추가하고 고무 주걱을 사용하여 플레이트 표면에서 세포 물질을 완전히 분리하여 플레이트의 세포를 직접 용해합니다.

1밀리리터 피펫 팁을 사용하여 각 웰의 점성 용해물을 15밀리리터 플라스틱 튜브로 옮깁니다. 23게이지 피하 주사 바늘에 부착된 1밀리리터 주사기로 DNA를 공유합니다. 용해물이 더 이상 점성이 없을 때까지 플런저를 위아래로 격렬하게 여러 번 움직입니다.

용해물을 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 20, 000 번 g과 섭씨 4도에서 5 분 동안 회전하여 파편을 제거하십시오. 용해물에서 투명한 상층액을 수집합니다.

올리고 d(T)25 마그네틱 비드에 첨가하고 혼합물을 재현탁합니다. 튜브를 회전하는 바퀴에 10분 동안 놓습니다. 그런 다음 튜브를 마그네틱 랙에 2분 동안 놓습니다.

맑은 액체를 제거하십시오. 각 튜브에 0.8ml의 버퍼 A를 추가하고 튜브를 180도 2-3회 돌립니다. 두 번째 세척에서 버퍼 A를 제거합니다.

각 튜브에 0.8ml의 버퍼 B를 추가하고 랙에 2분 동안 그대로 둡니다. 비드에서 결합된 mRNA를 용리시키려면 버퍼 B를 제거하고 각 튜브에 33마이크로리터의 물을 추가한 다음 비드를 다시 현탁시킵니다. 하트 블록에서 5분 동안 섭씨 75도까지 가열합니다.

즉시 튜브를 1초 동안 돌리고 마그네틱 랙에 놓습니다. 상등액을 새 튜브로 옮깁니다. 각 튜브에 66마이크로리터의 알칼리 가수분해 완충액을 추가하고 혼합 및 가열 블록에서 정확히 5분 동안 섭씨 95도에서 가열합니다.

즉시 얼음에 튜브를 식히십시오. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 RNA 정리 키트를 사용하여 RNA 분리를 수행합니다. 이 절차를 시작하려면 각 RNA 샘플에 14마이크로리터의 폴리뉴클레오티드 키나아제 마스터 믹스를 추가합니다.

섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 30분 후, 준비된 스핀 컬럼에 키나아제 반응을 로드합니다. 2분 동안 735회 g로 열을 돌립니다.

컬럼을 버리고 수집된 반응이 있는 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 후속 결찰 반응에서 RNA 단편의 3개 프라임 말단을 차단하여 연쇄화를 피하려면 각 샘플에 17.5마이크로리터의 폴리(A)중합효소 마스터 믹스를 첨가합니다. 1초 동안 섞고 돌립니다.

섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 30분 후 각 반응에 32.5마이크로리터의 물을 추가하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 RNA를 정제합니다. 반응을 진공 농축기에 10분 동안 넣어 부피를 6마이크로리터로 줄여 이 절차를 시작합니다.

그런 다음 각 반응에 24마이크로리터의 RNA 리가제 마스터 믹스를 추가합니다. 섭씨 24도의 가열된 믹서에서 16시간 동안 반응을 배양하고 1,000RPM에서 간헐적으로 혼합합니다. 다음 날, 각 반응에 17마이크로리터의 물을 넣고 섞습니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 RNA를 정제합니다. 용리석을 진공 농축기에 3분 동안 넣어 부피를 11마이크로리터로 줄입니다. 역전사 반응을 위해 반응을 200마이크로리터 PCR 튜브로 옮깁니다.

프라이머 1마이크로리터를 추가합니다. PCR 사이클러에서 섭씨 70도에서 5분 동안 가열한 다음 실온에서 5분 동안 그대로 둡니다. 8마이크로리터의 역전사 마스터 믹스를 각 튜브에 넣고 혼합합니다.

튜브를 PCR 사이클러에 넣습니다. 섭씨 55도에서 10분, 섭씨 80도에서 10분 더 가열합니다. 얼음 위에 보관하십시오.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 streptavidin 비드를 준비합니다. 비드 용액에 역전사 반응을 추가하고 회전하는 휠에서 섭씨 4도에서 20분 동안 배양합니다. 마그네틱 랙을 사용하여 비오틴 결합 완충액으로 비드를 두 번, TEN 완충액으로 두 번 세척합니다.

비드를 50마이크로리터의 TEN 버퍼에 재현탁합니다. 2마이크로리터의 우라실 DNA 글리코실라제 효소 혼합물을 넣고 믹서에서 섭씨 37도에서 1시간 동안 간헐적으로 혼합하여 배양합니다. 각 반응에 50마이크로리터의 물, 11마이크로리터의 RNase H 완충액 및 1마이크로리터의 Rnase H를 추가합니다.

섭씨 37도에서 20분 동안 배양합니다. 튜브를 마그네틱 랙에 놓고 절단된 cDNA가 포함된 액체를 새 튜브로 옮깁니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 PCR 정제 키트를 사용하여 절단된 cDNA를 정제합니다.

정제된 cDNA를 진공 농축기에 8분 동안 넣어 7마이크로리터 부피로 농축합니다. 분리된 cDNA의 5개 프라임 말단에 5개의 프라임 어댑터를 접합하려면 각 샘플에 23마이크로리터의 RNA 리가아제 마스터 믹스를 추가하고 섭씨 24도에서 20시간 동안 배양합니다. 마지막으로 각 반응에 70마이크로리터의 물을 추가합니다.

파일럿 PCR은 지수 단계 내에서 라이브러리 증폭에 도달하기 위한 최적의 PCR 주기 수를 결정하기 위해 수행됩니다. 200 마이크로 리터 PCR 튜브에 다음을 피펫 : 25 마이크로 리터의 DNA 중합 효소 믹스, 20 마이크로 리터의 결찰 반응, 2 마이크로 리터의 물, 1.5 마이크로 리터의 전방 PCR 프라이머 및 1.5 마이크로 리터의 역 PCR 인덱스 프라이머. 섭씨 95도에서 3분, 섭씨 98도에서 20초, 섭씨 67도에서 20초, 섭씨 72도에서 30초씩 20사이클을 20회 실행합니다.

표시된 사이클 후에 cycler에서 직접 7개의 마이크로리터 부분 표본을 수집합니다. 2% 아가로스 겔에서 산물을 분리하고 PCR 산물의 이동을 시각화합니다. 지수 증폭 시작 시 사이클 수(이 예에서는 12사이클)를 결정하고 대규모 PCR 반응에 이 사이클 수를 사용합니다.

2% 아가로스 겔에서 대규모 PCR 반응에서 산물을 분리하고 200-350개의 뉴클레오티드 DNA 산물을 포함하는 겔 조각을 잘라냅니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 겔 추출 키트를 사용하여 겔 슬라이스에서 DNA를 추출합니다. 이 비디오에는 가장 중요한 계산 단계만 표시됩니다.

자세한 내용은 텍스트 프로토콜에서 확인할 수 있습니다. 먼저 Git 저장소를 복제하고 새로 생성된 디렉토리로 변경합니다. 소프트웨어가 포함된 환경을 만들고 이 환경을 활성화합니다.

A-seq2 데이터를 얻은 유기체의 게놈 염기서열을 다운로드합니다. 구성 파일을 열고 텍스트 프로토콜에 표시된 대로 입력 매개변수를 설정합니다. 분석을 시작합니다.

HNRNPC 단백질의 녹다운에 대한 특정 유전자 NUP214의 반응은 대조군 소형 간섭 RNA 또는 HNRNPC 소형 간섭 RNA로 처리된 HEK-293 세포의 두 샘플에서 a-seq2 판독을 분석하여 조사되었습니다. 분석 파이프라인에 의해 주석이 달린 문서화된 폴리(A) 부위는 IGD 게놈 브라우저에 대한 입력으로 사용된 BAM 형식으로 저장되었습니다. 읽은 피크의 세 프라임 엔드는 앙상블에 주석이 달린 mMRNA 세 개의 프라임 엔드에 매핑됩니다.

프로파일은 HNRNCR 녹다운 시 긴 3 프라임 UTR 동형의 사용이 증가했음을 나타냅니다. 일단 마스터되면 A-seq 프로토콜은 세포 배양 및 야간 결찰 시간을 제외하고 8시간의 실습 시간 또는 약 2-3일이 소요됩니다. 프로토콜을 시도할 때는 먼저 해당 위치에서 사용되는 시퀀싱 플랫폼을 준수하는 프라이멀 세트를 설계하는 것이 중요합니다.

mMRA 3 프라임 말단을 얻은 후에는 가교 연결 및 면역침전과 같은 다른 방법을 사용하여 pre-mRNA 3 프라임 말단 처리의 조절자를 식별할 수 있습니다. A-seq2는 RNA 처리 분야의 연구자들이 개별 세포 유형에서 선택적 폴리아델릴화의 조절 및 결과를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 mRNA 3 프라임 말단의 라이브러리를 생성하고, 염기서열분석 데이터를 분석하고, 새로운 poly(A) 부위를 식별하고, 사용량을 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

A-seq2가 mRNA 처리 조절을 시작하는 작업을 용이하게 하고 많은 새로운 통찰력으로 이어지기를 바랍니다.