Name: 주 사용 Hydrogels 키토 산 기반 및 3D 세포 배양에서의 응용의 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: 배우세요 동적 이민 화학을 이용하여 주사 가능한 키토산 기반 하이드로겔을 제조하는 방법을. 이 기술은 3D 세포 배양 및 세포 치료 운반체로 활용할 수 있으며, 자가 치유 특성과 기계적 강도 조절이 가능합니다.

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이 연구는 국립 과학 재단의 중국 (21474057 및 21604076)에 의해 지원 되었다.

주의: 사용 하기 전에 모든 관련 물질 안전 데이터 시트 (MSDS)를 참조 하십시오. 증기 두건 및 개인 보호 장비 (보호 안경, 보호 장갑, 랩 코트, 등)의 사용을 포함 하 여 화학 실험을 수행할 때 적절 한 안전 관행을 사용 하십시오. 프로토콜 처리 기술 (살 균, 세포 복구, 셀 뿌리고, 세포 동결, 셀 얼룩, 등) 표준 셀 필요.
 1. 준비의 Hydrogels <ol>benzaldehyde의 합성 종료 디 기능성된 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG DF) <ol>사전 건조 목이 <li><li>폴리머 <ol><li>4.00 g PEG (MW 4000, 1.00 mmol), 무게 둥근 바닥 플라스 크 (250 mL)에 그것을 전송 하 고 톨루엔 (100 mL) 추가. 
			참고: 다른 분자 무게를 가진 다른 구슬 하이드로 겔 형성을 위해 일할 수 있지만 다른 강성으로 이어질 것입니다.</li>
			<li>열 열 총 (또는 핫 플레이트 약 40 ° C) 약간에 의해 모든 고분자를 분해 하는 데 도움이 솔루션. 모든 고분자 분해 후 모든 용 매를 제거 하는 증발 기를 사용 합니다. 이 분해 과정과 건조을 고분자 말린된 나무 못을 두 번 반복. 
			주의:이 주의 연기 후드에서 수행 되어야 합니다. 톨루엔은 인화성.</li>
		</ol></li> <li>말뚝의 benzaldehyde 종료 반응 <ol><li>플라스 크를 자력 및 tetrahydrofuran (THF, 100 mL)을 추가 하 고는 교 반기를 사용 하 여 말뚝을 분해. 모든 고체를 완전히 해산 솔루션 4-carboxybenzaldehyde (0.90 g, 6.0 mmol)과 4-dimethylaminopyridine (0.07 g, 0.6 m m o l)을 순차적으로 추가.</li>
			<li>추가 N, N &#39;-dicyclohexylcarbodiimide (DCC, 1.25 g, 6.0 mmol)를 솔루션에 추가 건조 튜브 무수 CaCl 2 플라스 크에 가득. 실 온에서 교 반 아래 반응 계속 (~ 20 ° C) 약 12 헤 대 한</li>
		</ol></li> <li>후 반응 과정 <ol><li>반응이 완료 된 후 진공 하 여 솔루션에서 생성 된 백색 고체를 필터링. 솔루션을 아래 흰색 고체 침전을 교 반 찬 diethyl 에테르 (500 mL)에 붓으십시오. 필터에 의해 모든 백색 고체를 수집 하 고 증기 두건에서 고체 건조.</li>
			<li>는 THF에 흰색 고체를 다시 해산, 모든 불 용해성 백색 고체 필터링, 흰색 고체 침전을 신선한 찬 diethyl 에테르에 솔루션을 붓는 다 고 그것을 건조. 2 ~ 3 배,이 과정을 반복 하 고 진공 건조 오븐 (20 ° C, 0.1 mbar) 그들을 완전히 건조에 흰색 고체를 배치. 최종 제품으로 백색 분말을 수집: benzaldehyde 종료 DF 못.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Hydrogels의 준비 <ol><li>튜브 (10 mL) DF 못 (0.11 g, 0.028 mmol, 0.22 g, 0.055 mmol, 0.44 g, 0.110 mmol)의 다른 양을 무게 이온된 수 (5.0 mL), 추가 하 고 소용돌이 또는 자력 교 반기를 사용 하 여 도움말 폴리머 분해.</li>
		<li>글리콜 키토 산 (0.495 g, 10 -3 mmol x 6.18) 튜브 (50 mL), 이온된 수 (15.0 mL)에 녹이 고 몇 분 동안 소용돌이 사용 하 여 균질 키토 산 용액 (3 wt %).</li>
		<li>글리콜 키토 산 용액 (0.2 mL, 3 wt %)와 추가 DF 못 솔루션 (0.2 mL) 순차적으로 튜브 (2.0 mL). 소용돌이 사용 하 여 몇 분에 솔루션 양식 hydrogels 균질 혼합. 다른 기계적인 힘의 hydrogels 수 있도록 표 1의 비율에 따라. 
		참고: 튜브 반전 메서드를 사용 하는 하이드로 겔은 이미 형성 여부 확인.</li>
	</ol></li> <li>유동성 분석 <ol><li>병렬 강판으로 회전 고분자에 유동성 분석 수행 (직경: 20 m m). 겔 화 테스트에 대 한 낮은 접시에 글리콜 키토 산 용액 (0.2 mL, 3 wt %)를 확산. 다음, 키토 산 솔루션 표면에 고르게 dropwise DF 못 수성 솔루션 (0.2 mL, 2 wt %)를 추가 하 고 신속 하 게는 피 펫과 혼합. 낮은 위 격판덮개를 아래로 하 고 테스트 시작</li>
		<li>하이드로 겔에 대 한 &#39; s 강성 테스트를 원형으로 한 히드로 컷 (직경: 20mm) 저장 모듈러스를 측정 (G &#39;) 주파수 분석 1% 변형에 대 한 값. 전형적인 G &#39; 6.3 rad s 값 &#8722; 1 표 1에 나열 됩니다. 
		참고: 동적 본드는 히드로의 안정화를 위해 하이드로 겔 형성 후 하이드로 겔 0.5 h의 유동성 분석 수행.</li>
		<li>는 하이드로 겔에 대 한 &#39; s 자체 healable 속성 테스트 조각 하는 하이드로 겔을 잘라 하 고 필수적인 부분에 자체를 함께 조각 수집. 원을 만들기 위해 하이드로 겔 조각 잘라 (직경: 20mm) 유동성 분석을 수행 하는 고분자에.</li>
	</ol></li></ol> 2. Hydrogels에 3D 세포 배양 <ol><li>히드로 겔 화 솔루션의 준비 <ol><li>세포 배양 (RPMI-1640, 2.0에에서 추가 무게 DF 말뚝 (0.44 g, 0.11 mmol) 무 균 튜브 (4.0 mL) mL), 및 소용돌이 또는 교 반기를 사용 하 여 고분자 폴리머 솔루션 (20 wt %)를 분해 하는 데 도움이. 주사기 (10.0 mL)에서 솔루션을 로드 하 고 다음 미크론 박테리아 못 벗어난 필터 (0.22 μ m)를 통해 그것을 전달 하 여 소독.</li>
		<li>는 글리콜 키토 산 (0.165 g, 10 -3 mmol x 2.06) 무 균 튜브 (15.0 mL)에 무게, 셀 문화 미디어 (RPMI-1640, 4.0 mL), 그리고 글리콜 키토 산 용액 (4.0 wt %)를 폴리머 분해 있도록 소용돌이에 추가. 주사기 (10.0 mL)에서 솔루션을 로드 하 고 0.22 μ m 박테리아 못 벗어난 필터와 필터.</li>
	</ol></li> <li>Hydrogels에서 세포 배양 주의: 수행 모든 세포 조직 문화 후드에서 관련된 절차. 살 균 기술의 기본 지식으로 예상 된다.
	<ol><li>세포 현 탁 액 <ol><li>RPMI-1640 년에 문화 L929 세포의 준비 중간 보충 10 %FBS, 5% 페니실린 (10 mL)는 페 트리에서 접시 (직경 10 cm), 및 37 ° C, 5% CO 2에서 품 어. 매체를 사용 하기 전에 매일 변경.</li>
			<li>Trypsin (0.025 w/v %)과 EDTA를 포함 하는 PBS를 가진 L929 세포를 수확 (0.01 w/v %), 다음 원심 (70 x g, 5 분) 하 고 다시 RPMI 1640 매체 (1.0 mL)에 셀을 일시 중지. 셀 피 세 보드의 표준 동작을 사용 하 여 계산을 수행 합니다. 다시 셀을 셀 농도 조정 중단 ~ 3.75 × 10 6 셀/mL.</li>
		</ol></li> <li>Hydrogels에 셀 캡슐화 <ol><li>L929 세포 정지 (0.4 mL, 10 6 세포 mL -1 x 3.75) 글리콜 키토 산 용액 (0.4 mL) 튜브 (4.0 mL) 소용돌이 의해 혼합. 공초점 레이저 페 트리 접시의 중앙에 L929/글리콜 키토 산 용액 (0.8 mL)를 플라스틱 (직경 2.0 cm). DF 못 솔루션 (0.2 mL) 같은 그릇에 플라스틱 하 고 부드럽게 솔루션을 조합 하 여 하이드로 겔 형성 유도 플라스틱. 
			참고: 페 트리 접시를 기울임으로써 하이드로 겔 형성 평가.</li>
			<li>직접 세포 배양에 대 한 추가 히드로 위에 RPMI 1640 문화 미디어 (1.0 mL)의 추가 금액. 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO 2)에서 포함 하는 셀 hydrogels (1.0 mL, 1.5 wt % 글리콜 키토 산, 4.0 wt %DF 못, 1.5 × 10 6 세포 mL -1)을 넣고 매일 매체를 변경. 하루 1, 3, 5, 및 7 셀 캡슐화 후에 셀 이미징에 대 한 준비.</li>
		</ol></li> <li>Hydrogels 주입 후에 3 차원 셀 후 문화, 준비 로드 셀 하이드로 겔 (1.0 mL 단계 2.2.2 참조) 주사기 (10.0 mL, 48 G 바늘)에. 하이드로 겔 형태의 후 천천히 confocal 영상에 대 한 페 트리 접시에는 히드로 주입. 위에 하이드로 겔 문화 미디어 (1.0 mL)의 추가 금액을 추가 하 고 매일 그것을 변경할. (37 ° C, 5% CO 2) 인큐베이터에서 배양 접시를 넣고 나중 이미징에 대 한 준비. 
		주의: 검사 하 고 주사기의 안전 작업 프로토콜 따라.</li>
	</ol></li> <li>세포 생존 능력 분석 <ol><li>Confocal 관찰 <ol>
			<li>2 번 PBS (1.0 mL)와 hydrogels 린스. Fluorescein diacetate (FDA, 0.5 mL, 0.05 mg/mL)와 15 분 동안 propidium 요오드 화물 (PI, 0.5 mL, 0.08 mg/mL) 솔루션 hydrogels 얼룩. 모든 용 매를 제거 하는 얼룩, 후.</li>
			<li>Hydrogels 488의 여기 파장에서 confocal 현미경을 사용 하 여 관찰 및 543 nm 라이브 시각화 및 죽은 세포, 각각. Z-스택 전체 셀의 동등한 배급을 확인 하기 위해 hydrogels의 모든 2 µ m 깊이 통해 받아. 
			참고: FDA 얼룩 라이브 셀 동안 PI 죽은 세포 얼룩.</li>
		</ol></li> <li>튜브 (4.0 mL)로 5 분 및 피 펫에 대 한 초 산 (HAc, 3 v %, 1.0 mL)와 히드로 (1.0 mL)을 저하. 원심 분리기 (70 x g, 5 분)에 의해 세포를 수집 하 고 다시 RPMI 1640 세포 배양 매체 (1.0 mL)에 셀을 일시 중단. 셀 보드를 계산 하는 혈액을 사용 하 여 계산 수행.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

하이드로 겔이이 프로토콜 (그림 1)에 두 가지 주요 구성 요소: 자연 폴리머 글리콜 키토 산 합성 benzaldehyde 종료 폴리머 gelator DF 못, 두 생체 재료입니다. DF 말뚝의 합성 단계 수정 반응을 사용 하 여 제공 됩니다. 분자량 4000의 PEG 하이드로 겔 강성 뿐만 아니라 가용성, 수정 효율성의 문제에서이 프로토콜에 선정 되었다. 다른 기계적인 힘을 가진 hydrogels의 시리즈는 다른 고체 내용과 글리콜 키토 산 및 DF PEG 비율을 사용 하 여 준비 되었다. 균질 hydrogels 신속 하 게 형성 되었다 분에 실 온에서 겔 화 솔루션을 혼합 하 여 겔 화 속도 희석 솔루션에 의해 저하 될 수 있지만. 유동성 시험 다른 hydrogels의 기계적 강도 평가 하기 위해 고용 되었다. 저장 계수 (G') 그 hydrogels의 약 900에서 다 발견 된 Pa (소프트), 2100 Pa (중간) 4700 Pa (뻣 뻣 한) (표 1<...

Hydrogels는 많은 양의 물과 부드러운 기계적 성질, 가교 된 고분자 재료 그리고 그들은 많은 바이오-의료1,2에 사용 되었습니다. Hydrogels는 vivo에서세포에 대 한 생리 적인 환경에 매우 비슷한 부드럽고 젖은 환경을 제공할 수 있습니다. 따라서, hydrogels 3D 셀 문화3,4건설 하는 가장 인기 있는 기계 중 하나가 되고있다. 2D 페 트리 접시 세포 배양에 비해, 3 차원 세포 배양 한 세포 외 기질 (ECM) 유사 문의 확산 및 감 별 법 목적5조립 하는 셀에 대 한 microenvironment 제공 하 신속 하 게 전진 했다. 또한, hydrogels 천연 고분자를 포함 하 수 증식 및 분화3셀 바이오 호환 및 추진 환경을 제공 하 고 있다. 합성 중합체에서 파생 된 Hydrogels 동물 유래 단백질 이나 바이러스 같은 복잡 한 영향을 제외 그들의 간단 하 고 명확한 구성 선호 됩니다. 3D 세포 배양에 대 한 모든 히드로 후보자, 중 hydrogels 쉽게 준비 하 고 일관 된 속성을 항상 선호 됩니다. 하이드로 겔의 다른 연구 요구 사항에 맞게 속성 조정 시설 뿐만 아니라6으로 중요 하다.
여기 우리는 글리콜 키토 산 기반의 히드로 동적 것 화학, 3D 셀 문화7다목적 히드로 플랫폼을 사용 하 여 손쉬운 준비 소개. 이 방법에서는, 잘 알려진 바이오 호환 글리콜 키토 산 하이드로 겔의 네트워크의 프레임을 설정 하는 데 사용 됩니다. 아미노 그룹은 hydrogels8의 crosslinkages로 동적 것 유대를 형성 하는 폴리머 gelator로 종료 benzaldehyde 폴 리 에틸렌 글리콜과 반응. 동적 것 유대 형성 하 고 기계적으로 조정 가능한 가교 된 네트워크9,,1011hydrogels 부여 주변 역 고 responsively 분해 수 있습니다. 높은 물 내용을, 바이오 호환 재료, 및 조정 가능한 기계적인 힘는 하이드로 겔 3D 셀 문화12,13L929 세포에 대 한 발판으로 성공적으로 적용 됩니다. 여기에 프로토콜 등 폴리머 gelator 합성, 히드로 준비, 셀 포함, 3D 세포 배양 절차를 자세히 설명 합니다.
히드로 동적 것 crosslinkages, 다중 응답 다양 한 바이오-자극 (산/pH, 비타민 B6 파생 pyridoxal, 단백질 papain, 등)을 포함 하 여, 히드로 것을 나타내는 때문에 여러 가지 다른 기능을 보여 줍니다. 8생리 적 조건 분해를 유도 한다. 하이드로 겔은 또한 자체 healable 고 주 사용는 히드로 최소한의 침략 적 주입 방법을 통해 관리 될 수 및 약물 및 세포 배달14,15에서 얻을. 추가 하 여 기능 첨가제 또는 특정 미리 디자인 된 폴리머 gelators는 히드로 얻고 자기, 온도, pH, 등16,17, 이행할 수 있는 같은 특정 속성에 호환 되는 요구 사항 연구의 넓은 범위. 이러한 속성 주 사용 하는 하이드로 겔의 잠재 능력 약물과 생체 외에서 그리고 vivo에서 생물 의학 연구 및 응용 프로그램에서 셀에 대 한 여러 사업자 공개.

<table><tbody><tr><td>글리콜 키토산</td><td>Wako 순수 화학 산업</td><td>39280-86-9</td><td>90%의 탈아세틸화</td></tr><tr><td>4-카르복시벤즈알데히드</td><td>상하이 알라딘&nbsp; Bio-Chem Technology Co., LTD</td><td>619-66-9</td><td>99%</td></tr><tr><td>N, N'-dicyclohexylcarbodiimide</td><td>상하이 알라딘&nbsp; Bio-Chem Technology Co., LTD</td><td>538-75-0</td><td>99%</td></tr><tr><td>염화칼슘 무수</td><td>상하이 알라딘&nbsp; Bio-Chem Technology Co., LTD</td><td>10043-52-4</td><td>96%</td></tr><tr><td>4-dimethylamiopryidine</td><td>상하이 알라딘&nbsp; Bio-Chem Technology Co., LTD</td><td>1122-58</td><td>99 %</td></tr> <tr><td>폴리에틸렌 글리콜</td><td>시노 팜 화학 시약</td><td>5254-43-7</td><td>99 %</td></tr> <tr><td>테트라 하이드로 푸란</td><td>시노 팜 화학 시약</td><td>109-99-9</td><td>99</td></tr> <tr><td>% 톨루엔</td><td>시노 팜 화학 시약</td><td>108-88-3</td><td>99 %</td></tr> <tr><td>에틸 에테르</td><td>시노 팜 화학 시약</td><td>60-29-7</td><td>99 %</td></tr><tr><td>아세트산</td><td>Sino-pharm 화학 시약</td><td>64-19-7</td><td>99%</td></tr><tr><td>무수 CaCl2</td><td>Sino-pharm 화학 시약</td><td>10043-52-4</td><td>99%</td></tr><tr><td>Fluorescein diacetate</td><td>Sigma</td><td>596-09-8</td><td>99%</td></tr><tr><td>Propidium iodide&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>25535-16-4</td><td>94%</td></tr><tr><td>RPMI-1640 배양 배지</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td></td><td>0.25%</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Solarbio</td><td></td><td>0.01 M</td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신 용액</td><td>Hyclone</td><td></td><td>10,000 U/mL</td></tr><tr><td>유변계</td><td>TA 기기</td><td></td><td>AR-G2</td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Zeiss</td><td></td><td>710-3channel</td></tr><tr><td>L929 셀</td><td>ATCC</td><td></td><td>NCTC 클론 929; L 셀, L929, 변형 L</td></tr><tr><td>증발기</td><td>EYELA</td><td></td><td>N-1100</td></tr><tr><td>48 게이지 바늘</td>의 파생물 <td>ShanghaiZhiyu Medical Material Co., LTD</td><td></td><td>48-게이지</td></tr><tr><td>현미경</td><td>Leica</td><td></td><td>DM3000 B</td></tr><tr><td>현미경 소프트웨어</td><td>Imaris</td><td></td><td></td></tr><tr><td>히트 건</td><td>Confu</td><td></td><td>KF-5843&nbsp;</td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>NEST</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

주 사용 hydrogels 키토 산 기반 및 3d 세포 배양에서의 응용의 준비

Preparation of Chitosan-based Injectable Hydrogels and Its Application in 3D Cell Culture

프로토콜 키토 산 기반 hydrogels 동적 것 화학을 사용 하 여 준비 하기 손쉬운 효율적이 고 다양 한 메서드를 제공 합니다. 하이드로 겔 합성된 benzaldehyde 종료 폴리머 gelator와 글리콜 키토 산의 솔루션을 혼합 하 여 준비 되 고 hydrogels 실 온에서 몇 분에 효율적으로 얻을 수 있습니다. 글리콜 키토 산, 폴리머 gelator, 및 물 내용 사이 다양 한 비율에 의해 다른 겔 화 시간 및 강성 다목적 hydrogels 얻을 수 있습니다. 손상, 그것의 외관 및 계수, crosslinkages로 동적 것 유대의 가역 때문에 히드로 복구할 수 있습니다. 이 자체 healable 속성에는 히드로 주입 과정 후 필수 대량 하이드로 겔을 압착된 조각에서 자체 치유 될 수 있기 때문에 주사 될 수 있습니다. 하이드로 겔 멀티 동적 것 유대의 다른 평형 상태 때문에 많은 바이오-액티브 자극에 반응 이기도합니다. 이 히드로 바이오 호환으로 확인 됐다 고 L929 마우스 fibroblast 세포 포함 된 다음과 같은 표준 절차 이었고 셀 확산 쉽게 3D 세포 배양 과정에 의해 평가 되었다. 히드로 셀에 대 한 3D 환경의 생리 적 모방 이익이 되었다 다른 연구에 대 한 조정 플랫폼을 제공할 수 있습니다. 다중 응답, 자체 healable 및 주 사용 속성을 함께 hydrogels 마약과 셀 미래 바이오-의료 응용 프로그램에 대 한 여러 사업자로 잠재적으로 적용할 수 있습니다.

하이드로 겔 준비 및 3D 세포 배양으로 그것의 사용에이 프로토콜의 프레 젠 테이 션이 회로도 그림 1에 제공 됩니다. 하이드로 겔의 내용과 다른 기계적인 힘으로 준비 하는 비율의 정보는 표 1에 요약 됩니다. 히드로 자체 healable 고 유동성 재산 저장 모듈러스 주파수 테스트 그림2에서 대 여 히드로 강성을 선물 한다. 셀 공초점 영상과 hydrogels 문화의 일 셀 번호 그림 3, 세포 생존 능력 및 세포 증식 3D 세포 배양을 통해 확인 되 게 됩니다. 그림 4 는 현미경 검사 법, confocal 이미지 및 세포의 확산 hydrogels 고통을 주입 및 후 문화에에서 포함 된 셀에 대 한 분석을 선물 한다. 높은 세포 생존 능력 및 세포 증식 세포는 히드로에 포함 된 파괴적...

여기는 키토 산 기반의 주 사용 hydrogels 동적 것 화학을 사용 하 여 손쉬운 준비에 설명 합니다. 하이드로 겔의 기계적 강도 및 3D 세포 배양에서의 응용 프로그램을 조정 하는 방법은 제시 하는.

주 사용 Hydrogels 키토 산 기반 및 3D 세포 배양에서의 응용의 준비

The protocol presents a facile, efficient, and versatile method to prepare chitosan-based hydrogels using dynamic imine chemistry. The hydrogel is ...

본 프로토콜의 전반적인 목적은 궁극적으로 치료법에 활용하기 위해 3차원 세포 배양용 주입 가능 키토산 하이드로겔을 제조하는 것입니다. 이 방법은 전 과정을 통해 자가 치유 하이드로겔을 제조하는 방법과 이를 3D 세포 배양에 활용하는 방법 등 자가 치유 하이드로겔 분야의 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 장점은 생체 적합성 자가 치유 하이드로겔을 매우 간단한 방법으로 제조할 수 있으며, 이를 3D 세포 배양에 사용할 수 있다는 점입니다.이 하이드로젤은 주입이 가능하므로 세포 치료를 위한 운반체로 사용될 수 있습니다. 이제 용산 이 씨가 하이드로젤 제조 방법과 이 하이드로젤을 이용한 3D 세포 배양 방법을 시연하겠습니다. 용산 이 씨는 저희 연구실의 대학원생입니다.하이드로겔을 제작하려면 먼저 DF PEG를 합성하십시오. 흄 후드 내에서 분자량 4,000 PEG 4g을 둥근 바닥 플라스크에 정밀하게 측정하여 넣고, 톨루엔 100mL를 첨가합니다. 그다음, 폴리머를 용해시키기 위해 용액을 가온합니다.모든 폴리머가 용해되면, 증발기를 사용하여 모든 용매를 제거합니다. 그 다음, 톨루엔을 혼합하고 증발시키는 과정을 두 번 더 반복하여 건조된 PEG 폴리머를 준비합니다. 이어서, 마그네틱 교반기와 100 milliliters의 DHF를 사용하여 폴리머를 용해시킵니다.그런 다음, 0.9 g의 4-Carboxybenzaldehyde를 용액에 녹입니다. 이어서 0.07 g의 dimethylaminopyrimide를 용액에 녹입니다. 이제 무수 염화칼슘이 채워진 건조관 내에서 1.25 g의 DCC를 첨가합니다.이제 상온에서 약 12시간 동안 반응물을 교반합니다. 다음 날, 500 milliliters의 차가운 diethyl ether를 사용하여 흰색 고체물을 침전시키고, 진공 여과를 통해 고체물을 수집합니다. 용질은 폐기하고, 통풍이 잘 되는 곳에서 고체물을 건조시킵니다.다음으로, 흰색 고형물을 100 milliliters의 THF에 녹입니다. 계속 진행하기 전에 용해되지 않은 흰색 고형물은 반드시 여과하여 제거해야 합니다. 이제 신선하고 차가운 diethyl ether를 사용하여 용해된 고형물을 침전시킵니다.그런 다음 감압 여과를 사용하여 고체물을 수집하고 다시 건조시킵니다. 이 과정을 2~3회 반복한 후, 흰색 고체물을 진공 건조 오븐에 넣어 완전히 건조시킵니다. 이렇게 얻은 흰색 분말이 최종 생성물인 benzaldehyde-terminated DF PEG입니다.배양을 위해 하이드로젤 내에 세포를 캡슐화하려면, 먼저 4 mL 튜브에 0.44 g의 DF PEG를 2 mL의 세포 성장 배지에 녹입니다. 혼합물을 볼텍싱하여 중량 대비 20% 용액으로 만듭니다. 그다음, 용액을 멸균합니다.이를 10-milliliter 주사기에 넣고, 0.22-micron 박테리아 제거 필터로 압축 여과합니다. 이제 glycol-chitosan 0.165 grams를 세포 배양 배지 4 milliliters와 혼합하고, vortex를 사용하여 중량 대비 4%의 chitosan 용액을 만듭니다. 그런 다음, 또 다른 0.22-micron 박테리아 제거 필터를 사용하여 용액을 멸균합니다.다음으로, 트립신을 사용하여 L929 세포와 같은 세포를 회수합니다. 수집된 세포를 세척하고, ml당 3.75 million cells 농도의 배지에 다시 현탁합니다. 다음 단계에서는 세포를 3D 매트릭스에 식립합니다.성공적인 결과를 얻으려면 다음 단계들을 정확하게 따르는 것이 매우 중요합니다. 이제 볼텍스 믹서를 사용하여 세포 현탁액 0.4 milliliters와 키토산 용액 0.4 milliliters를 혼합합니다. 이 혼합물을 지름 2 centimeter 페트리 접시의 중앙에 피펫으로 분주하고, DF PEG 용액 0.2 milliliters를 접시에 분주합니다.그런 다음, 부드럽게 피펫팅하여 하이드로젤 형성을 유도합니다. 디쉬를 기울여 용액의 점도를 관찰함으로써 하이드로젤의 형성 여부를 평가합니다. 캡슐화된 세포의 주입 가능성을 테스트하려면, 10-milliliter 시린지에서 동일한 준비 과정을 수행합니다.그런 다음 하이드로젤이 형성되면, 48게이지 바늘을 통해 하이드로젤을 페트리 접시에 천천히 밀어 넣습니다. 이어서 플레이트 내의 하이드로젤-세포 혼합물에 배양액 1 mL를 첨가하고, 플레이트를 배양기(incubator)로 옮겨 배양합니다. 이틀마다 3D 하이드로젤 세포 배양물 위에 배양액을 덮어 교체해 줍니다.이미징을 위해 하이드로겔에 캡슐화된 세포를 준비하려면, 먼저 하이드로겔을 1 mL의 PBS로 두 번 헹굽니다. 그 다음, fluorescein-diacetate 용액과 propidium iodide 용액으로 하이드로겔을 염색합니다. 두 용액을 각각 0.5 mL씩 하이드로겔 위에 얹고, 실온에서 15분 동안 배양합니다.염색액으로 짧게 배양한 후, 모든 용매를 흡입하여 제거합니다. 이제 공초점 현미경을 사용하여 하이드로젤을 관찰하며, 살아있는 세포를 보기 위해 488 nanometers에서 여기시키고, 죽은 세포를 보기 위해 543 nanometers에서 여기시킵니다. 하이드로젤 내 세포 분포를 확인하기 위해 2 micron 간격의 슬라이스로 이미지 스택을 수집합니다.L929 세포. 인비보(in-vivo) 환경의 조직 강성이 약 5,600 Pascal인 전형적인 마우스 섬유아세포 세포주를 하이드로젤 내에 캡슐화하였습니다. 배양 과정 전반에 걸쳐 세포 생존율이 매우 높았으며, 주목할 만한 세포 밀도를 달성하였습니다.하이드로젤에서 7일간 배양한 후, 세포 수는 200% 증가했습니다. 48게이지 바늘을 통해 세포 배양 접시에 분사된 하이드로젤은 약 1시간 후에 스스로 치유되어 통합된 하이드로젤로 재형성될 수 있었습니다. 배양 7일 후, 이 세포들 또한 급격히 증식했습니다. 일부 세포가 두 개로 나뉜 것처럼 보이는 세포 분열 현상의 증거를 확인할 수 있었습니다.생사 분석(live-dead assay) 결과 매우 높은 생존율이 나타났으며, 이는 주입 후 3D 하이드로젤 내에서 세포 증식이 성공적으로 이루어졌음을 입증합니다. 이러한 세포 증식률은 7일간의 배양 후 주입되지 않은 세포의 약 3/4 수준이었습니다. 따라서 주입 과정 중 발생하는 전단력이 측정 가능한 부정적인 영향을 미치기는 하지만, 주입된 세포들은 여전히 상당히 활발하게 증식했습니다.이 영상을 시청한 후에는 자가 치유 하이드로젤을 제조하는 방법과 이 하이드로젤을 3D 세포 배양에 이용하는 방법, 그리고 이 하이드로젤을 통해 세포를 전달하는 방법을 익히게 됩니다. 이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 1시간 이내에 완료할 수 있습니다. 최적의 절차를 따르면 세포 치료나 약물 전달을 위한 체내 주입과 같은 다른 방법들도 수행할 수 있습니다.

preparation-chitosan-based-injectable-hydrogels-its-application-3d

Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

현재 줄기 세포 치료에서 주요 장애물은 호스트 조직으로 이들 세포를 전달하는 가장 효과적인 방법을 결정합니다. 지방 파생 줄기 세포들이 multipotency을 유지할 수 있도록하면서 여기에서, 우리는 효과적이고 접근 간단 키토산 기반의 전달 방법을 설명합니다.

줄기 세포 - 로드된 키토산 Microspheres의 배달을 위해 콜라겐 히드로겔을 구축

bioprinter는 희생 형에 따라 패턴 하이드로 겔을 만드는 데 사용되었다. 폴록 사머 형은 두 번째 히드로 겔로 채워질 그리고 세 번째 하이드로 겔로 채워졌다 빈 공간을 남겨 용출되었다. 이 방법은 생체 고분자의 복잡한 구조를 생성하는 빠른 용출과 폴록 사머의 좋은 인쇄 적성을 사용합니다.

모방의 창조 3D 세포 배양을위한 두 구성 요소 히드로 겔에 대한 Thermoresponsive 역 금형 인쇄

연골 복구는 충족되지 않은 의학적 도전을 나타내며 인간의 관절 연골을 엔지니어링하기 위한 세포 기반 접근 방식은 유망한 솔루션입니다. 여기에서는 3차원(3D) 생체 모방 하이드로겔을 인간 관절 연골 세포의 확장 및 성숙을 위한 이상적인 도구로 설명합니다.

관절 연골 세포 문화와 연골 생성을위한 3D 하이드로 겔 공사장 공중 발판

폴리 (N- 이소 프로필 아크릴 아미드) - -graft 콘드로이틴 설페이트 이루어지는 주사 조직 공학적 지지체는 (PNIPAAm-g-CS) 함유 알긴산 미립자를 제조 하였다. 속성 및 생체 적합성 시험 관내에서 팽윤 접착력은 본 연구에서 분석된다. 여기서 개발 된 특성화 기술 thermogelling 다른 시스템들에 적용 할 수있다.

조직 공학 알긴산 미세 입자와 Thermogelling 폴리 (N- 이소 프로필) -graft - 콘드로이틴 황산 복합 재료의 합성

이 폐 세포 외 기질에서 3 차원 세포 배양 지지체를 제작하는 방법이다. 그대로 폐 세 차원 세포의 성장을 지원할 수있는 하이드로 겔로 처리된다.

3 차원 세포 배양을위한 폐 세포 외 매트릭스에서 조정 히드로 겔

단백질 기반 hydrogels 3 차원 구조를 조작 하는 다른 메서드 여기 소재 속성에 대해 계산 됩니다. 세포 접착 펩 티 드와 함께 macroporous 네트워크는 공업화 하 고 두 개의 서로 다른 모델 셀 라인을 사용 하 여 세포 배양에서 그들의 타당성을 평가.

셀 문화 응용 프로그램에 대 한 단백질 기반 Hydrogels 아키텍처의 쉬운 조작

이 프로토콜 cryogelation 기술로 제작을 통합 하 여 탄력 있는 3D macroporous microcryogels의 제작을 설명 합니다. 재생 치료를 촉진 하기 위하여 쉽게 주입된 비보 수 또는 생체 외에서 높은 처리량 마약 검사에 대 한 배열로 조립 셀 로딩 시 3D microtissues 생성 됩니다.

주 사용 재생 치료와 높은 처리량 마약 검사에 대 한 3D Microtissues

여기, 우리 자기 연골 같은 조직으로 dedifferentiated 인간의 관절 chondrocytes의 분화를 촉진 하는 펩 티 드 건설 기계 조립에 3D 문화 시스템을 얻기 위해 프로토콜을 제시.

3 차원 펩 티 드 건설 기계에 포유류 세포 배양

그들은 완전 한 tunability 폴리머 백본 및 따라서 셀 microenvironment의 허용으로 재조합 단백질 엔지니어링 hydrogels는 3D 세포 배양에 대 한 유리한 있습니다. 여기, 우리 재조합 엘라 스 틴 같은 단백질 정화의 과정 및 3 차원 하이드로 겔 셀 캡슐화에의 응용을 설명합니다.

캡슐화 및 3d에서 셀의 Immunostaining에 대 한 엘라 스 틴 같은 단백질 Hydrogels의 생산

여기에서, 우리는 키토산 필름에 의하여 인간 치주 인대 (PDL) 세포 스페로이드를 배양하는 프로토콜을 제시합니다. 3차원(3D) 세포 스페로이드의 배양은 기존의 조직 배양 폴리스티렌(TCPS) 배양 시스템에 대한 대안을 제공한다.

키토산 필름에 인간 치주 인대 세포 스페로이드의 형성

본 프로토콜은 키토산-제니핀 마이크로겔의 제조를 위한 비에멀젼 기반 방법을 기술한다. 이러한 마이크로겔의 크기는 정밀하게 조절할 수 있으며, pH 의존적 팽윤을 표시하고, 생체내에서 분해되며, 시간이 지남에 따라 지속적으로 방출되는 치료 분자로 로딩될 수 있어 조직 공학 응용에 매우 적합합니다.

조직 공학 응용 분야를 위한 크기 조절 및 무유제 키토산-제니핀 마이크로젤 제조

배우세요 동적 이민 화학을 이용하여 주사 가능한 키토산 기반 하이드로겔을 제조하는 방법을. 이 기술은 3D 세포 배양 및 세포 치료 운반체로 활용할 수 있으며, 자가 치유 특성과 기계적 강도 조절이 가능합니다.

주 사용 Hydrogels 키토 산 기반 및 3D 세포 배양에서의 응용의 준비

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