주 사용 Hydrogels 키토 산 기반 및 3D 세포 배양에서의 응용의 준비

이 프로토콜의 전반적인 목표는 궁극적으로 치료 치료에 사용하기 위해 3차원 세포 배양을 위한 주사 가능한 키토산 하이드로겔을 준비하는 것입니다. 이 방법은 자가 치유 하이드로겔을 통째로 담궈서 자가 치유 하이드로겔을 만드는 방법, 3D 세포 배양에 사용하는 방법 등 자가 치유 하이드로겔 분야의 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 장점은 호환 가능한 자가 치유 하이드로겔에 의해 매우 간단한 방법과 3D 세포 배양을 사용하여 제조할 수 있다는 것입니다.

이 하이드로겔은 주사형으로도 사용할 수 있으므로 세포 치료의 운반체로 사용할 수 있습니다. 이제 Mr.Yongsan Li가 하이드로겔을 만드는 방법과 이 하이드로겔을 사용하여 3D 세포 배양을 하는 방법을 보여드리겠습니다. 이용산 선생은 저희 연구실의 대학원생입니다.

하이드로겔을 만들려면 먼저 DF PEG를 합성합니다. 흄 후드에서 둥근 바닥 플라스크에 4g의 분자량 4, 000 PEG의 무게를 측정하고 100 밀리리터의 톨루엔을 추가합니다. 그런 다음 폴리머를 용해하려면 용액을 예열하십시오.

모든 폴리머가 용해된 후 증발기를 사용하여 모든 용매를 제거합니다. 그런 다음 톨루엔을 혼합하고 두 번 더 증발시키는 과정을 반복하여 건조 PEG 폴리머를 준비합니다. 다음으로, 자석 교반기와 100ml의 DHF를 사용하여 폴리머를 용해시킵니다.

그런 다음 0.9g의 4-Carboxybenzaldehyde를 용액에 용해시킵니다. 다음으로, 0.07g의 디메틸 아미노 피리 미드를 용액에 용해시킵니다. 이제 무수 염화칼슘으로 채워진 건조 튜브에 DCC 1.25g을 추가합니다.

이제 반응을 실온에서 약 12시간 동안 저어줍니다. 다음날 500ml의 차가운 디에틸 에테르를 사용하여 흰색 고체를 침전시키고 진공 여과를 사용하여 고체를 수집합니다. 용질을 버리고 통풍이 잘되는 곳에서 고체를 건조시킵니다.

다음으로, 흰색 고체를 THF 100ml에 용해시킵니다. 진행하기 전에 불용성 백색 고체를 걸러내야 합니다. 이제 신선한 차가운 디 에틸 에테르를 사용하여 용해 된 고체를 침전시킵니다.

그런 다음 진공 여과를 사용하여 고형물을 수집하고 다시 건조시킵니다. 이 과정을 두세 번 반복한 다음 흰색 고체를 진공 건조 오븐에 넣어 완전히 건조시킵니다. 생성된 백색 분말은 최종 제품인 벤즈알데히드 말단 DF PEG입니다.

배양을 위해 하이드로겔에 세포를 캡슐화하려면 먼저 0.44g의 DF PEG를 4ml 튜브에 2ml의 세포 성장 배지에 용해시킵니다. 혼합물을 20 중량의 용액으로 와류로 만듭니다. 다음으로 용액을 살균합니다.

10ml 주사기에 넣고 0.22미크론 박테리아 보유 필터를 통해 누릅니다. 이제 0.165g의 글리콜 키토산을 4 밀리리터의 세포 배양 배지와 혼합하여 와류를 사용하여 4 % 중량 기준 키토산 용액을 만듭니다. 그런 다음 다른 0.22미크론 박테리아 보유 필터를 사용하여 용액을 살균합니다.

다음으로, 트립신을 사용하여 L929 세포와 같은 세포를 수확합니다. 수집된 세포를 세척하고 밀리리터당 375만 개의 세포로 배지에 재현탁합니다. 다음 단계에서는 세포를 3D 매트릭스에 이식합니다.

이러한 단계를 정확하게 따르는 것이 성공을 거두는 데 중요합니다. 이제 와류를 사용하여 0.4 ml의 세포 현탁액과 0.4 ml의 키토산 용액을 혼합합니다. 이 혼합물을 직경 2cm의 페트리 접시 중앙에 피펫으로 넣고 DF PEG 용액 0.2ml를 접시에 피펫

그런 다음 부드러운 배관을 사용하여 하이드로겔 형성을 유도합니다. 접시를 기울이고 용액의 점도를 관찰하여 하이드로겔의 형성을 평가합니다. 캡슐화된 세포의 주입 가능성을 테스트하려면 10ml 주사기에서 동일한 제제를 만듭니다.

그런 다음 하이드로겔이 형성된 후 48게이지 바늘을 통해 하이드로겔을 페트리 접시로 천천히 배출합니다. 다음으로, 플레이트의 하이드로겔-세포 혼합물에 1ml의 배양 배지를 추가하고 플레이트를 배양을 위해 인큐베이터로 옮깁니다. 격일로 배지를 교체하여 3D 하이드로겔 세포 배양을 오버레이합니다.

이미징을 위해 하이드로겔로 캡슐화된 세포를 준비하려면 먼저 1ml의 PBS로 하이드로겔을 두 번 헹굽니다. 그런 다음 하이드로겔을 플루오레세인-디아세테이트 용액과 프로피듐 요오드화물 용액으로 염색합니다. 두 용액을 모두 0.5ml의 하이드로겔에 오버레이하고 실온에서 15분 동안 하이드로겔을 배양합니다.

염색 용액으로 잠시 배양한 후 모든 용매를 흡입합니다. 이제 컨포칼 현미경을 사용하여 하이드로겔을 관찰하고, 488나노미터에서 여기(excitation)를 통해 살아있는 세포를 관찰하고, 543나노미터에서 여기(excitation)를 통해 죽은 세포를 관찰합니다. 2미크론 슬라이스가 있는 이미지 스택을 수집하여 하이드로겔 내 세포의 분포를 검증합니다.

L929 세포. 약 5, 600 Pascals의 생체 내 환경 조직 강성을 가진 일반적인 마우스-유리 섬유 세포주를 하이드로겔에 캡슐화했습니다. 이들의 생존력은 배양 과정 전반에 걸쳐 매우 높았으며 놀라운 세포 밀도를 달성했습니다.

하이드로겔에서 7일 동안 배양한 후 세포 수가 200% 증가했습니다.48게이지 바늘을 통해 세포 배양 접시로 배출된 하이드로겔은 약 1시간 후에 통합 하이드로겔을 재형성하기 위해 자가 치유할 수 있었습니다. 배양한 지 7일이 지난 후, 이 세포들도 극적으로 증식했습니다. 일부 세포가 둘로 나뉘어 보이는 세포 분열 사건의 증거를 찾을 수 있습니다.

live-dead assay는 매우 높은 생존율을 보여 주입 후 3D 하이드로겔에서 성공적인 세포 증식을 입증했습니다. 이 세포 증식 속도는 배양 7일 후 주입되지 않은 세포의 약 3/4이었습니다. 따라서 주입 중 전단력은 측정 가능한 부정적인 영향을 미치지만 주입된 세포는 여전히 상당히 증식했습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 자가 치유 하이드로겔을 준비하는 방법과 이 하이드로겔을 3D 세포 배양에 사용하는 방법, 이 하이드로겔로 세포를 전달하는 방법을 알게 될 것입니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 1시간 이내에 완료할 수 있습니다. 최상의 절차에 따라 세포 요법 또는 약물 전달을 위한 생체 내 주입과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.