Ultralow 입력된 게놈 시퀀싱 단일 Tardigrade 견본에서 라이브러리 준비

이 프로토콜의 목표는 완보동물(tardigrades)이라고 하는 미세한 유기체의 게놈 염기서열을 분석하는 것입니다. 우리는 전체 게놈 응용 프로그램을 통해 50 피코그램의 게놈 DNA를 가진 단일 표본에서 완보동물인 Hypsibius dujardini의 게놈 염기서열을 분석하는 방법을 확립했습니다. 완보동물 한 마리를 분리한 후 항생제와 육안 검사를 사용하여 박테리아 오염을 최소화합니다.

우리는 또한 두 가지 균질화 방법을 활용했습니다. 첫 번째이자 가장 일반적으로 사용되는 예쁜꼬마선충은 동결 및 해동 주기를 사용하고, 두 번째는 피펫 팁으로 완보동물을 수동으로 분쇄하는 것입니다. 그런 다음 DNA를 사용하여 염기서열분석 라이브러리를 구성한 다음 MiSeq 기기에서 염기서열분석을 수행합니다.

프로토콜의 전체 요약입니다. 단일 개체를 격리한 후 균질화를 위해 세 번의 동결 및 해동 주기를 거칩니다. 게놈 DNA는 추출 및 정제되고 초음파 처리에 의해 단편화됩니다.

그런 다음 염기서열분석 라이브러리(sequencing library)를 구성하고 라이브러리 크기 분포를 검증한 후 염기서열분석 기기로 염기서열분석을 수행합니다. 90mm 플라스틱 배양 접시에 증류수를 용매로 사용하여 2% 아가로스 젤을 준비하고 증류수로 10mm 1% 페니실린 스트렙토마이신을 준비합니다. 젤은 18도로 설정된 인큐베이터에서 2-3주 동안 보관할 수 있습니다.

완보동물 하나를 모아 준비된 한천 플레이트에 놓고 증류수로 2-3회 씻어 남은 입자를 제거합니다. 완보동물 하나를 페니실린 스트렙토마이신 항생제에 2-6시간 동안 넣어 박테리아 오염을 제거하고, 오염이 제거된 동물을 P10 피펫을 사용하여 깨끗한 슬라이드 유리에 놓습니다. 완보동물을 500배 배율로 현미경으로 관찰하고 잔류 박테리아가 없는지 확인합니다.

최대 5마이크로리터의 액체가 담긴 P10 피펫을 사용하여 개인을 수집하여 결합이 낮은 PCR 튜브에 넣고 과도한 액체를 최대한 제거합니다. 균질화 및 DNA 추출. 다음 방법 중 하나로 동물을 균질화하여 게놈 DNA를 얻습니다.

동결 및 해동 주기를 통한 균질화. 2.5단계 직후, 완보동물이 들어 있는 PCR 튜브에 100마이크로리터의 용해 완충액을 추가합니다. PCR 튜브를 액체 질소에 10분 동안 놓고 열 블록으로 이동하여 37도까지 10분 동안 예열합니다.

이 단계를 세 번 반복합니다. 수동 분쇄. 실체 현미경에서 P10 피펫 팁으로 동물을 PCR 튜브 벽에 대고 눌러 개인을 분쇄하고 즉시 100마이크로리터의 용해 완충액을 추가합니다.

용해가 일어날 수 있도록 실온에서 30분 동안 배양합니다. 용해 혼합물의 전체 부피를 깨끗한 1.5ml 저결합 마이크로튜브로 옮깁니다. 100마이크로리터의 용해 완충액을 균질화에 사용되며 현재 비어 있는 low-binding PCR 튜브에 추가합니다.

그리고 피펫팅 후 혼합물을 1.5 저결합 마이크로튜브로 옮깁니다. 이 단계를 두 번 반복합니다. 300마이크로리터의 용해 완충액을 저결합 PCR 튜브에 추가하고 피펫팅 후 혼합물을 1.5mL 저결합 마이크로튜브로 이동합니다.

수집 관에서 둔 회전급강하 란에 600 마이크로리터 용해 혼합물의 총계를 추가하고, 10, 1 분 동안 000 G에 분리기를 설치한다. 란에 교류를 처음부터 끝까지 Reapply, 및 1 분 동안 10, 000 G에 분리기. 이 단계는 대부분의 게놈 DNA가 컬럼에 결합되도록 하는 데 중요합니다.

스핀 컬럼에 500마이크로리터의 세척 버퍼를 추가하고 1분 동안 10, 000G에서 원심분리합니다. 스핀 컬럼을 깨끗한 1.5ml 마이크로튜브로 옮깁니다. 20마이크로리터의 10밀리몰 첫 번째 ACL을 스핀 컬럼에 적용하고 실온에서 5분 동안 기다립니다.

10, 1 분 동안 000 G에서 원심 분리기. 희석 완충액에는 EDTA가 함유되어 있으면 안 되며, EDTA는 실험실 준비 효소를 방해하기 때문입니다. 스핀 란에 흐름을 처음부터 끝까지 다시 적용하고, 실내 온도에 5 분 외피 후에, 10, 000 G.Sequencing 도서관 건축에 1 분 동안 분리기

DNA 단편화. DNA 단편화를 위해 15마이크로리터의 게놈 DNA 용리를 15마이크로리터 마이크로튜브로 옮기고, 탁상용 원심분리기를 사용하여 1분 동안 원심분리합니다. 게놈 DNA를 550개의 염기쌍으로 단편화합니다.

피펫팅 후 10마이크로리터의 단편화된 DNA 혼합물을 깨끗하고 결합력이 낮은 PCR 튜브로 옮깁니다. 여기서 실험을 멈출 수 있습니다. DNA를 4도 또는 영하 20도에서 보존합니다.

라이브러리 구성 시퀀싱. 낮은 입력 DNA로 인해 다음 절차에서 지정된 키트를 사용하는 것이 절대적으로 중요합니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 필요한 시약을 준비하고 어떠한 수정도 없이 염기서열분석 라이브러리를 구성합니다.

라이브러리 합성 혼합물에 라이브러리 증폭 혼합물을 도포한 후 열 순환기에서 PCR 반응을 수행합니다. PCR 반응은 도시된 바와 같이 실시하였다. PCR 반응의 정제.

50마이크로리터의 마그네틱 비드와 피펫을 10회 첨가하고 탁상용 마이크로 원심분리기로 잠시 원심분리합니다. 실온에서 2분 동안 배양합니다. 마그네틱 스탠드에서 5분 동안 또는 용액이 완전히 투명해질 때까지 배양하고 상층액을 제거합니다.

제조업체의 프로토콜을 따릅니다. 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 새로운 저결합 PCR 튜브로 옮깁니다. DNA 품질 검사 및 정량화, 염기서열분석.

DNA 라이브러리 크기 분포 검증. 3마이크로리터의 샘플 물과 1마이크로리터의 염기서열분석 라이브러리를 첨가하고 소용돌이로 1분 동안 철저히 혼합한 다음 탁상용 원심분리기로 잠시 원심분리합니다. 전기영동을 수행하고 관련 소프트웨어를 사용하여 라이브러리 크기 분포를 검증합니다.

주요 단편 피크는 약 300 내지 1,000 염기쌍의 범위여야 합니다. DNA 정량화. 796마이크로리터의 용액 완충액과 4마이크로리터의 형광 시약을 넣고 완전히 혼합합니다.

190마이크로리터의 작업 용액을 두 개의 분석 튜브에 분배하고 197마이크로리터를 하나의 분석 튜브에 분배합니다. 190마이크로리터의 작업 용액을 포함하는 각 분석 튜브에 알려진 농도의 DNA 농도를 가진 10마이크로리터의 표준물질을 추가하고, 197마이크로리터의 작업 용액을 포함하는 분석 튜브에 준비된 라이브러리 3마이크로리터를 추가합니다. 간단히 소용돌이를 치고 탁상용 원심 분리기에서 원심 분리기를 사용합니다.

3마이크로리터 설정의 형광측정기를 사용하여 DNA를 정량화합니다. DNA 라이브러리의 염기서열분석. 제조업체의 프로토콜에 따라 염기서열분석 라이브러리를 준비합니다.

시약 카세트와 플로우 셀을 염기서열분석 기기에 설정하고 제조업체의 프로토콜에 따라 염기서열분석 실행 정보를 입력합니다. 염기서열분석을 실행합니다. 결과를 나타냅니다.

고품질 DNA 추출에서 오염 물질의 노출은 프로토콜에서 중요한 포인트로 남아 있습니다. 오염 여부를 육안으로 검사하기 위해 완보동물을 페니실린과 스트렙토마이신과 같은 항생제에 배양하고 500회 현미경으로 개인을 검사했습니다. 여기에서 볼 수 있듯이 완보동물 주변에서 보이는 미생물은 완전히 조명됩니다.

효율적인 균질화, DNA 추출, 단편화 및 라이브러리 준비에 따릅니다. 라이브러리의 크기 분포는 품질 관리를 위해 고감도 전기영동을 사용하여 검증됩니다. 보라색 선과 녹색 선은 각각 1, 500 및 25 염기 쌍의 위쪽 및 아래쪽 마커를 나타냅니다.

L레인은 사다리 마커이고, S 레인과 N1에서 N4 레인은 동일한 실험의 5회 반복이며, 모두 단일 완보동물 표본에서 시작합니다. 200에서 1, 000 염기쌍 사이의 광범위한 균일 및 분포에서 볼 수 있듯이, 당사의 프로토콜은 매우 낮은 입력값에서도 재현성이 높습니다. 다음은 단일 시퀀싱 실행에서 얻은 동기화된 읽기에 대한 빠른 QC의 결과입니다.

판독은 300 염기 쌍의 예비 끝으로 얻어지며, 여기서 정방향 및 역방향 판독은 각각 상단과 하단에 표시됩니다. 여기에 표시된 분포는 300 쌍의 엔드 리드의 전형적인 분포이며, 매우 높은 품질의 염기는 처음 200 염기쌍에 대해 Q30 이상을 호출하고 끝으로 갈수록 점차 감소합니다. 따라서 이 방법은 하나의 샘플에 대해 단일 개체만 사용합니다.

이전의 완보동물 게놈 염기서열 분석 프로젝트에서 요구되었던 것과 같은 엄청난 양의 동물에 대한 요구 사항은 없습니다. 대부분의 완보동물에 대한 배양 방법은 아직 확립되지 않았습니다. 그러므로, 현장 조사에서 직접 얻은 것과 같이 단일 개체로부터 유전체학 염기서열 분석을 가능하게 하는 것은 완보동물 분자생물학에 큰 영향을 미칠 것이며, 다른 작은 동물에게도 큰 영향을 미칠 수 있습니다.

당사의 DNA 염기서열분석 방법은 희귀 돼지풀, 선충류, 전나무 등 아직 염기서열분석이 이루어지지 않은 수많은 미생물을 구역의 일부와 더 넓은 공공 구역을 연결하여 분석할 수 있도록 하여 다양한 생물학적 메커니즘이 가능할 수 있는 환경을 더욱 넓힐 수 있습니다.