Name: Ultralow 입력된 게놈 시퀀싱 단일 Tardigrade 견본에서 라이브러리 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: 학습하세요 Hypsibius dujardini 단일 개체에서 50 피코그램의 초저입력 DNA로 게놈 시퀀싱을 수행하는 방법을 배우세요. 항생제 처리와 시각 검사로 오염을 최소화하고 MiSeq 기기로 분석하는 이 기술은 미세 생물학 연구에 활용됩니다.

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저자는 노조미 아베, 타 카 유키, 그리고 Nahoko이 시이 게놈 시퀀싱에 그들의 기술 지원에 대 한 감사합니다. 이 작품에 의해 지원 되었다 선진적인 일본 사회에 대 한 과학 진흥 (JSP) 연구원, 젊은 과학자 (No.22681029), KAKENHI 특정 한 KAKENHI 특정에 대 한 과학적 연구 (B), 제 17 H 03620는 JSP에서 여는 스미 토모 재단 (No.140340)에서 그리고 야마가타 현 쓰루 오카 시, 일본에서 연구 기금에 의해 부분적으로 기본적인 과학 연구 프로젝트에 대 한 그랜트. tardigrades를 피드 하는 데 사용 되는 클로렐라 vulgaris 클로렐라 산업 주식회사의 제공 했다

1입니다. 준비
<ol><li>2 %agarose 젤 90 m m 플라스틱 문화 접시, 그리고 1% 페니실린/스 DW와 칵테일의 10 mL에 용 매로 증류수 (DW)를 사용 하 여 준비 합니다. 젤 18 ° c.에 설정 하는 인큐베이터에 2-3 주 동안 저장 될 수 있다 참고: 낮은 온도 agarose 젤, 젤과는 tardigrades 갇혀 있을 수 있는 문화 접시 벽 사이의 소문자 간격의 결과로 축소에 대 한 10 ° c, 젤의 어떤 저장을 하지 마십시오.</li>
</ol>2. 샘플 준비 및 오염 물질 배제
<ol><li>단일 tardigrade 수집 하 고, 준비 한 접시에 그것을 배치 하 고 그것을 씻어 x-모든 나머지 입자를 제거 하는 DW와 함께 3 x 2.</li>
	<li>창 자에서 어떤 과잉 음식 든 지 제거를 24 h에 대 한 18-22 ° C에서 tardigrade 품 어.</li>
	<li>2-6 h P10 피 펫을 사용 하 여 깨끗 한 슬라이드 유리에 소독된 동물을 어떤 세균 오염 제거에 대 한 페니실린/스 항생제에 굶주린된 tardigrade를 놓습니다.</li>
	<li>500 X 확대 현미경 tardigrade 관찰 하 고 나머지 박테리아 없음 확인. 참고:는 stereomicroscope와 높은 확대 최적입니다, 하지만 광학 현미경 또는 coverslip를 적용 하지 않고 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>액체의 5 µ L의 최대 P10 피 펫을 사용 하 여 개인을 수집 하 고 낮은 바인딩 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 튜브에 배치 가능한 훨씬 초과 액체 제거. 참고: microtubes, PCR 튜브, 그리고 피 펫 팁 모두 이어야 한다 DNA의 손실을 최소화 하기 위해 낮은 바인딩. 참고: 빠른 건조에 대 한 균질 화 되도록 빨리 실시 또는 동물의 죽음 크게 게놈 DNA를 손상 시킬 수 있습니다.</li>
</ol>3. 균질 및 DNA 추출
<ol><li>다음 방법 중 하나를 그것의 게놈 DNA (gDNA)를 얻기 위해 동물을 균질. 참고: 다른 키트 (열과 구슬 기반)이 매우 낮은 입력에서 유효 하지 않습니다에 대 한 다음 DNA 추출 단계에서 재료의 테이블에 에서 표시 된 지정 된 키트를 사용 하 여 중요 한 이다. 게놈 세포의 용 해 버퍼 사용 하기 0.5% 베타-mercaptoethanol 전에 공급 되어 있다.<ol>
<li>그리고 freeze-thaw 주기18와 동물 균질<ol>
<li>바로 다음 단계 2.5, 포함 하는 tardigrade PCR 튜브에 세포의 용 해 버퍼의 100 µ L를 추가 합니다.</li>
			<li>37 ° c 예 열 열 블록 이동 10 분, 10 분, 액체 질소에 PCR 튜브를 배치 2 x이이 단계를 반복 합니다. 참고: 균질 충분 하지 않습니다 또는 수동 분쇄 후 수행할 수 있는 경우이 단계를 반복할 수 있습니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>수동으로 동물 호감.<ol>
<li>바로 다음 단계는 stereomicroscope에서 2.5, PCR 튜브 벽에 동물을 눌러 피펫으로 P10 팁 개인을 분쇄 하 고 즉시 100 µ L의 세포의 용 해 버퍼를 추가. 참고:이 tardigrade 수 쉽게 빠져나가, 비효율적인 분쇄 gDNA를 추출 실패 귀 착될 것 이다 때문에이 절차는 stereomicroscope 아래를 관찰 하는 중요 한. 세포의 용 해 버퍼는 유기 체에 침투 수 있도록 tardigrade 표 피 손상 되었는지 확인 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>발생 하는 세포에 대 한 실 온에서 30 분 동안 튜브를 품 어. 참고: 30 분의 최소 필요 효율적인 세포에 대 한 하지만 부 화 긴 될 수 있습니다.</li>
	<li>깨끗 한 1.5 mL 낮은 바인딩 microtube 세포 혼합물의 완전 한 볼륨 (100 µ L)를 전송.</li>
	<li>균질을 위해 사용 되었다 며 지금 비어, 낮은 바인딩 PCR 튜브에 세포의 용 해 버퍼의 100 µ L을 추가 하 고 단계 3.3에서에서 사용 하는 1.5 mL 낮은 바인딩 microtube 전송에 pipetting 혼합물, 후. 2 x이이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>3.4 단계에서 낮은 바인딩 PCR 튜브에 세포의 용 해 버퍼의 300 µ L을 추가 하 고 혼합물 1.5 mL 낮은 바인딩 microtube 이동 pipetting, 후. 1.5 mL 낮은 바인딩 microtube이이 단계 후에 혼합물의 600 µ L를 포함 해야 합니다. 참고:이 단계는 샘플을 여러 번 세척 하 여 PCR 튜브 벽에 바인딩된 gDNA의 손실을 극소화 하는.</li>
	<li>컬렉션 튜브에 배치 스핀 열 세포 혼합물의 600 µ L의 총을 추가 하 고 1 분 x 10000 g에서 원심.</li>
	<li>다시 열을 통해 흐름을 적용 하 고 1 분 x 10000 g에서 원심. 참고:이 단계는 되도록 중요 한 대부분은 gDNA의 열에 바인딩됩니다.</li>
	<li>스핀 열 워시 버퍼의 500 µ L을 추가 하 고 깨끗 한 1.5 mL microtube 스핀 십 분 전송에 대 한 10000 x g에서 원심.</li>
	<li>10 mm Tris HCl, pH 8.5, 스핀 열, 5 분 대기를 실 온에서 20 µ L을 적용 하 고 1 분 동안 10000 x g에서 원심. 참고: 차입 버퍼 라이브러리 준비 효소와 방해에 대 한, EDTA를 포함 해야 합니다 하지.</li>
	<li>다시 실 온에서 외피의 5 분 후 스핀 열을 통해 흐름을 적용, 10000 x g에서 1 분 동안 원심. 참고:이 단계는 열에 바인딩된 gDNA의 최대 차입을 보장 하기 위해 중요 한.</li>
</ol>4. 도서관 건설 순서
<ol><li>
DNA 파편
	<ol>
<li>DNA 파편에 대 한 15 µ L microtube gDNA eluant의 15 µ L를 전송 하 고 탁상 microcentrifuge를 사용 하 여 1 분 동안 튜브 원심. 참고: 테이블의 자료 에 표시 된 지정된 microtube 낮은 입력에 대 한 최적입니다. 낮은 볼륨 쥡니다와 조각화는 중요 한, 그리고이 효소 조각화 DNA의 매우 낮은 농도 때문에 대체 될 수 없습니다.</li>
		<li>550에 gDNA를 조각 혈압. 참고: 550 bp 설정 사용은 다음과 같습니다: 피크 사고 전원 30 W, 듀티 계수 = = 20%, 버스트 사이클 = 50, 처리 시간 = 23 s.</li>
		<li>철저 한 pipetting 후 깨끗 한 낮은 바인딩 PCR 튜브에 조각난된 DNA 혼합물의 10 µ L을 전송. 참고: 실험 여기 중지 될 수 있습니다. 4 ° C 또는-20 ° c.에 DNA를 보존</li>
	</ol>
</li>
	<li>
라이브러리 건설 순서 참고: 그것은 절대적으로 중요 한 테이블의 자료 입력된 DNA의 낮은 금액으로 인해 다음 절차에에서 지정 된 키트를 사용 하 여.<ol>
<li>서식 파일 준비 버퍼의 2 µ L 및 템플릿 준비 효소의 1 µ L을 추가 하 고는 피 펫 철저 하 게 그들을 믹스.</li>
		<li>다음 조건 열 cycler에 서식 파일 준비 반응을 수행: 25 분, 20 분, 4 ° C 보류, 그리고 101-105 ° c.에가 열된 뚜껑에 대 한 55 ° C 22 ° C 반응이 완료 되 면 다음 단계를 진행 합니다.</li>
		<li>서식 파일 준비 반응 제품에 라이브러리 합성 버퍼의 1 µ L 및 라이브러리 합성 효소의 1 µ L을 추가 하 고 (4 ° C 보류)와 40 분 동안 22 ° C에 혼합물을 품 어. 반응이 완료 되 면 다음 단계를 진행 합니다.</li>
		<li>라이브러리 증폭 마스터 믹스 (라이브러리 증폭 버퍼의 25 µ L, 라이브러리 증폭 효소의 1 µ L 및 nuclease 무료 물 4 µ L)의 30 µ L의 인덱싱 시 약 5 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>피 펫으로 모든 것을 철저 하 게 혼합 하 고 탁상 원심 분리기와 혼합물을 간단히 원심.</li>
		<li>표 1에서 제시 하는 조건으로 PCR을 수행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>온도</td>
			<td>시간</td>
			<td>사이클</td>
		</tr>
<tr>
<td>72 ˚C</td>
			<td>3 분</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>85 ˚C</td>
			<td>2 분</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>98 ˚C</td>
			<td>2 분</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>98 ˚C</td>
			<td>20 초</td>
			<td rowspan="3">4 사이클</td>
		</tr>
<tr>
<td>67 ˚C</td>
			<td>20 초</td>
		</tr>
<tr>
<td>72 ˚C</td>
			<td>40 초</td>
		</tr>
<tr>
<td>98 ˚C</td>
			<td>20 초</td>
			<td rowspan="2">16 주기</td>
		</tr>
<tr>
<td>72 ˚C</td>
			<td>50 초</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 ˚C</td>
			<td>보류</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: PCR 조건입니다.
<ol start="3"><li>
PCR 제품의 정화 참고:이 단계는 다른 정화 방법과 교체하실 수 있습니다. 다른 방법을 사용 하는 경우는 분 광 광도 계를 사용 하 여 결과 DNA의 순도를 확인 해야 합니다. 흡 광도 비율 260/280와 260/230 둘 다 1.8 이상 이어야 합니다.<ol>
<li>마그네틱 구슬의 50 µ L을 추가, 플라스틱 솔루션 10 x, 탁상 microcentrifuge와 함께 간단히 원심 및.</li>
		<li>실 온에서 2 분에 대 한 솔루션을 품 어.</li>
		<li>5 분 동안 마그네틱 스탠드에 품 어 또는 솔루션을 완전히 될 때까지 취소, 제거는 상쾌한.</li>
		<li>자석 스탠드에 낮은 바인딩 PCR 튜브에 갓된 80% 에탄올의 200 µ L를 추가, 30 s 및 제거는 상쾌한 대기. 2 x이이 단계를 반복 합니다. 비즈를 방해 하지 마십시오.</li>
		<li>짧게 탁상 원심 분리기와 낮은 바인딩 PCR 튜브 원심 고 마그네틱 스탠드에 어떤 과잉 에탄올을 제거 합니다. 구슬 건조 하지만 overdrying을 피하십시오.</li>
		<li>15 µ L 10 mm Tris HCl, pH 8.5와 구슬 resuspend, 철저 하 게 자기 구슬 균질 분산 되도록 솔루션을 플라스틱, 실내 온도에, 그리고 간단한 원심 분리 후 2 분 동안 튜브를 품 어, 2 마그네틱 스탠드에 품 어 솔루션까지 분은 분명 하다. 참고: 차입 버퍼 없어야 EDTA, 시퀀싱 화학으로 대 합니다.</li>
		<li>새로운 낮은 바인딩 PCR 튜브에 펠 렛을 방해 하지 않고 상쾌한, 전송. 참고: 실험 여기 중지 될 수 있습니다. 또는 장기간 저장용-20 ° C에서 4 ° C에서 DNA를 보존.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 품질 검사, 정량화, 및 DNA의 순서
참고: 품질 검사는 DNA의 낮은 금액으로 인해이 단계 전에 실시 하지.
<ol><li>
DNA 라이브러리 크기 분포의 유효성 검사 참고: 다른 높은-민감한 전기 시스템 크기 분포의 디지털 보고 사용할 수 있습니다.<ol>
<li>전기 이동 법 버퍼 시 약을 카트리지 (범위 25-1000 bp) 실내 온도를 젤.</li>
		<li>시퀀싱 라이브러리의 1 µ L로 전기 이동 법 버퍼 시 약의 3 µ L을 추가 하 고 소용돌이, 그들을 철저 하 게 1 분 동안 혼합 짧게 탁상 원심 분리기와 원심.</li>
		<li>전기 이동 법을 수행 하 고 관련된 소프트웨어와 라이브러리 크기 배포의 유효성을 검사 합니다. 주요 조각 피크 합니다 수 광범위 하 게까지 약 300에서 1000 bp.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DNA의 정량화 참고: 다른 형광 기반 방법 또는 양이 많은 PCR도 사용할 수 있습니다, 하지만 분 광 광도 법, 피해 야 한다 그것은 시퀀싱 라이브러리를 측정을 위해 충분히 정확 하지.<ol>
<li>버퍼 솔루션의 796 µ L 및 형광 시 약의 4 µ L을 추가 하 고 철저 하 게 그들을 믹스. 2 분석 결과 튜브를 작업 솔루션의 190 µ L 및 1 개의 분석 결과 관에 197 µ L를 분배.</li>
		<li>각 분석 결과 튜브 작업 솔루션의 190 µ L을 포함 하 게 DNA의 알려진 농도가 표준 10 µ L 및 작업 솔루션의 197 µ L를 포함 분석 결과 튜브를 준비 된 도서관의 3 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>소용돌이 관 짧게 탁상 원심 분리기에 원심 및. 3 µ L 설정으로는 fluorometer를 사용 하 여 DNA를 계량.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DNA 라이브러리 순서 참고: 시퀀싱 플랫폼 지정된 라이브러리 건설 키트와 호환 되어야 합니다.<ol>
<li>준비 제조 업체의 프로토콜에 따라 시퀀싱 라이브러리.</li>
		<li>시퀀싱에 시 약 카세트와 흐름 셀을 설정 하 고 시퀀싱 정보는 제조 업체의 프로토콜을 실행을 입력 합니다.</li>
		<li>시퀀싱을 실행 합니다. 참고: 우리는 두 개의 시퀀싱 실행 실시: 4 개의 샘플 한 실행에서 다중화로 한 샘플/실행.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 전산 분석
<ol><li>기본 전화 하 고, 필요한 경우 demultiplex는 읽기.</li>
	<li>FastQC19시퀀스 데이터의 품질을 확인 합니다. 주: 획득된 데이터의 자세한 유효성 검사에 대 한 우리의 이전 보고서16를 참조 하십시오.</li>
</ol>

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<li>Horikawa, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+rearing+system+of+the+extremotolerant+tardigrade+Ramazzottius+varieornatus%3A+a+new+model+animal+for+astrobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Astrobiology%22%5BJournal%5D)">Establishment of a rearing system of the extremotolerant tardigrade Ramazzottius varieornatus: a new model animal for astrobiology.</a> Astrobiology. 8 (3), 549-556 (2008).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

세균성 오염 미세한 생물의 게놈 시퀀싱에 위협이 포즈. Tardigrade 게놈 시퀀싱에 대 한 이전 연구는 오염 광범위 한 정보학 방법을12,20를 사용 하 여 필터링 하는 동안 우리는 오염 위험을 최소화 하기 위해 하나의 개별에서 게놈 시퀀싱. 개별 tardigrade genomic DNA16 의 약 50-200 pg 포함 되어 있기 때문에 키 틴 질 외 골격의 두꺼운 층에 쌌 다, 오염 물질 및 양질의 DNA 추출의 배제는이 프로토콜에 중요 한 포인트. 기존 tardigrades 문화는 무 균, 그리고 그 수집 된 야생 수행에서 오염 물질의 많은 그들의 창 자에 식품의 표면에. Tardigrades의 이전 게놈 시퀀싱 프로젝트 총칭 한 샘플12,14, 결과 세균 오염에 의해...

Tardigrades는 건조를 직면 하는 때 anhydrobiosis를 호출 하는 ametabolic 상태를 입력할 수 있는 미세한 동물 이다. 그들은 물1,2의 흡수에 의해 복구. Tardigrades는 ametabolic 상태에서 다양 한 극한 환경 극한의 온도 압력3 4,5, 자외선 빛6, x-레이, 그리고 감마선의 높은 복용량을 포함 하는 견 뎌 할 수 있다 7 , 8, 그리고 우주 공간9. 게놈 데이터는 anhydrobiosis의 분자 메커니즘의 연구에 대 한 필수적인 기초.
Tardigrades의 게놈을 시퀀싱 하는 이전 시도 세균 오염10,11,12,,1314의 흔적으로 나타났습니다. 같은 작은 유기 체에서 게놈 시퀀싱 동물의 많은 수를 요구 하 고 세균 오염; 하는 경향이 따라서, 우리는 오염15의 위험을 최소화 하기 위해 tardigrade, 단일 표본에서 시작 하는 ultralow 입력된 메서드를 사용 하 여 연속 프로토콜을 설치 이전 했다. 이러한 데이터를 사용 하 여 높은-품질 resequencing 및 리어셈블리 H. dujardini16,17의 게놈의 더 실시는 우리. 여기 우리가 자세하게에서 게놈 시퀀싱 한 tardigrade 개인 (그림 1에서이 방법을 설명). 이 시퀀싱 방법의 유효성 검사는이 문서의 초점을 넘어 이며 우리의 이전 보고서16이미 철저 하 게 논의 했다.
이 메서드는 두 부분으로 구성: 단일 tardigrade 오염 가능한 낮은와 DNA 그림 수준의 높은 품질 추출의 분리. tardigrade 굶 어 하 고 항생제로 서 물, 철저 하 게 씻어 서 이며 어떤 세균 오염 든 지의 제거를 보장 하기 위해 500 X 확대와 함께 현미경 관찰. 이전 견적 및 측정 tardigrade의 단일 개인 게놈 DNA16, freeze-thaw 주기 또는 수동 균질 키 틴 질 외 골격을 크래킹에 의해 추출 되는 약 50-200 pg 포함 되어 있음을 표시 합니다. 이 게놈 DNA 도서관 건설에 제출 하 고 DNA 시퀀싱 장비에서 시퀀스. 추가 정보 분석 고급 시퀀싱, 뿐만 아니라 오염 이전 tardigrade 시퀀싱 프로젝트에 비해 낮은 수준으로 표시 됩니다.

<table><tbody><tr><td>SZ61 현미경</td><td>OLYMPUS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BactoAgar</td><td>Difco Laboratories</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신(10,000 U/mL)</td><td>Gibco by life technologies</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>VHX-5000 System</td><td>Keyence</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2mL 실리콘 코팅 튜브</td><td>Bio Medical Science</td><td>BC-bmb20200</td><td></td></tr><tr><td>Quick-DNA 마이크로프렙 키트</td><td>ZYMO Research</td><td>D3021</td><td>이 키트의 사용은 절대적으로 중요합니다. 3.1 단계 참조</td></tr><tr><td>1.5 mL 마이크로튜브</td><td>greiner bio-one</td><td>616-201</td><td>4.1.1</td></tr><tr><td>HIgh speed rerigerated micro centrifuge</td><td>TOMY</td><td>MX-307</td><td></td></tr><tr><td>Covaris M220</td><td>Covaris Inc.</td> 참조<td></td><td></td>4482277</tr><tr><td>ThruPLEX DNA-Seq 키트</td><td>Rubicon Genomics</td><td>CAT. NO. R400406</td><td>이 키트의 사용은 절대적으로 중요합니다. 단계 4.2</td></tr><tr><td>Thermal Cycler</td><td>Bioer Technology</td><td>TC-96GHbC</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP 시약</td><td>BECKMAN COULTER Life Science</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Wako</td><td>054-027335</td><td></td></tr><tr><td>EB buffer</td><td>QIAGEN</td><td>19086 참조</td><td></td></tr><tr><td>2200 TapeStation</td><td>애질런트</td><td>G2965AA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D1000 시약</td><td>Agilent</td><td>5067-5583</td><td></td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Buffer/Reagent</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32850</td><td></td></tr><tr><td>Cubee Mini-Centrifuge</td><td>RecenttecGenereach</td><td>R5-AQBD01aqbd</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq 600 cycle v3</td><td>Illumina Inc.</td><td>MS-102-3003</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq 시퀀서</td><td>Illumina Inc.</td><td>SY-410-1003</td><td></td></tr></tbody></table>

ultralow 입력된 게놈 시퀀싱 단일 tardigrade 견본에서 라이브러리 준비

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Tardigrades는 ametabolic 상태가 물 제공 이라고 anhydrobiosis 건조 및 수를 직면 하는 때 그들의 원래 상태로 돌아가기 현미경 동물 이다. Tardigrades 위험 세균 오염 때로는 같은 미세한 동물의 게놈 시퀀싱이이 동물에서 수평 한 유전자 이동의 범위에 관한 예를 들어 잘못 된 해석에 지도 한다. 여기, 우리는 하나의 견본에서 tardigrade, Hypsibius dujardini의 게놈을 시퀀싱 하는 ultralow 입력된 방법을 제공 합니다. 50의 효율적인 추출 함께 엄격한 세척 및 오염 물질 제외를 채용 하 여 ~ 한 개인에서 200 pg genomic DNA, 우리 건설 DNA 시퀀싱 장비 시퀀싱 라이브러리. 이러한 라이브러리 높은 재현성 및 편견, 그리고 다른 H. dujardini 유전자와 시퀀스 읽기의 정보학 분석 오염의 최소한의 금액을 보여주었다. 이 메서드는 이전 방법을 사용 하 여 시퀀싱 할 하지 unculturable tardigrades을 적용할 수 있습니다.

오염 물질 배제:
이 프로토콜은 tardigrade와 오염을 최소화 하기 위해 항생제 치료와 살 균의 철저 한 씻기를 포함 한다. 그것은 또한 이러한 프로세스의 완전성을 보장 하기 위해 시각적 검사 과정을 포함 한다. 유효성 검사 (2.4/프로토콜 단계) 동안 현미경 이미지를 그림 2에 표시 됩니다. 500 X 배율에서 관찰 하는 경우 개별 tardigrade 주위에 이동 하는 작은 입자로 세균 세포를 볼 수 있습니다.
DNA 라이브러리 품질의 유효성 검사:
<p class="jove_content" fo:keep-together.wit...

미세한 생물의 게놈 시퀀싱 하는 동안 오염에는 큰 문제가 남아 있다. 여기, 우리가 오염 위험을 최소화 하기 위해 전체 게놈 증폭 없이 genomic DNA의 작은 50 세와 단일 표본에서 tardigrade의 게놈을 시퀀싱 하는 방법을 보여줍니다.

Ultralow 입력된 게놈 시퀀싱 단일 Tardigrade 견본에서 라이브러리 준비

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

이 프로토콜의 목표는 완보동물(tardigrades)이라고 하는 미세한 유기체의 게놈 염기서열을 분석하는 것입니다. 우리는 전체 게놈 응용 프로그램을 통해 50 피코그램의 게놈 DNA를 가진 단일 표본에서 완보동물인 Hypsibius dujardini의 게놈 염기서열을 분석하는 방법을 확립했습니다. 완보동물 한 마리를 분리한 후 항생제와 육안 검사를 사용하여 박테리아 오염을 최소화합니다.우리는 또한 두 가지 균질화 방법을 활용했습니다. 첫 번째이자 가장 일반적으로 사용되는 예쁜꼬마선충은 동결 및 해동 주기를 사용하고, 두 번째는 피펫 팁으로 완보동물을 수동으로 분쇄하는 것입니다. 그런 다음 DNA를 사용하여 염기서열분석 라이브러리를 구성한 다음 MiSeq 기기에서 염기서열분석을 수행합니다.프로토콜의 전체 요약입니다. 단일 개체를 격리한 후 균질화를 위해 세 번의 동결 및 해동 주기를 거칩니다. 게놈 DNA는 추출 및 정제되고 초음파 처리에 의해 단편화됩니다.그런 다음 염기서열분석 라이브러리(sequencing library)를 구성하고 라이브러리 크기 분포를 검증한 후 염기서열분석 기기로 염기서열분석을 수행합니다. 90mm 플라스틱 배양 접시에 증류수를 용매로 사용하여 2% 아가로스 젤을 준비하고 증류수로 10mm 1% 페니실린 스트렙토마이신을 준비합니다. 젤은 18도로 설정된 인큐베이터에서 2-3주 동안 보관할 수 있습니다.완보동물 하나를 모아 준비된 한천 플레이트에 놓고 증류수로 2-3회 씻어 남은 입자를 제거합니다. 완보동물 하나를 페니실린 스트렙토마이신 항생제에 2-6시간 동안 넣어 박테리아 오염을 제거하고, 오염이 제거된 동물을 P10 피펫을 사용하여 깨끗한 슬라이드 유리에 놓습니다. 완보동물을 500배 배율로 현미경으로 관찰하고 잔류 박테리아가 없는지 확인합니다.최대 5마이크로리터의 액체가 담긴 P10 피펫을 사용하여 개인을 수집하여 결합이 낮은 PCR 튜브에 넣고 과도한 액체를 최대한 제거합니다. 균질화 및 DNA 추출. 다음 방법 중 하나로 동물을 균질화하여 게놈 DNA를 얻습니다.동결 및 해동 주기를 통한 균질화. 2.5단계 직후, 완보동물이 들어 있는 PCR 튜브에 100마이크로리터의 용해 완충액을 추가합니다. PCR 튜브를 액체 질소에 10분 동안 놓고 열 블록으로 이동하여 37도까지 10분 동안 예열합니다.이 단계를 세 번 반복합니다. 수동 분쇄. 실체 현미경에서 P10 피펫 팁으로 동물을 PCR 튜브 벽에 대고 눌러 개인을 분쇄하고 즉시 100마이크로리터의 용해 완충액을 추가합니다.용해가 일어날 수 있도록 실온에서 30분 동안 배양합니다. 용해 혼합물의 전체 부피를 깨끗한 1.5ml 저결합 마이크로튜브로 옮깁니다. 100마이크로리터의 용해 완충액을 균질화에 사용되며 현재 비어 있는 low-binding PCR 튜브에 추가합니다.그리고 피펫팅 후 혼합물을 1.5 저결합 마이크로튜브로 옮깁니다. 이 단계를 두 번 반복합니다. 300마이크로리터의 용해 완충액을 저결합 PCR 튜브에 추가하고 피펫팅 후 혼합물을 1.5mL 저결합 마이크로튜브로 이동합니다.수집 관에서 둔 회전급강하 란에 600 마이크로리터 용해 혼합물의 총계를 추가하고, 10, 1 분 동안 000 G에 분리기를 설치한다. 란에 교류를 처음부터 끝까지 Reapply, 및 1 분 동안 10, 000 G에 분리기. 이 단계는 대부분의 게놈 DNA가 컬럼에 결합되도록 하는 데 중요합니다.스핀 컬럼에 500마이크로리터의 세척 버퍼를 추가하고 1분 동안 10, 000G에서 원심분리합니다. 스핀 컬럼을 깨끗한 1.5ml 마이크로튜브로 옮깁니다. 20마이크로리터의 10밀리몰 첫 번째 ACL을 스핀 컬럼에 적용하고 실온에서 5분 동안 기다립니다.10, 1 분 동안 000 G에서 원심 분리기. 희석 완충액에는 EDTA가 함유되어 있으면 안 되며, EDTA는 실험실 준비 효소를 방해하기 때문입니다. 스핀 란에 흐름을 처음부터 끝까지 다시 적용하고, 실내 온도에 5 분 외피 후에, 10, 000 G.Sequencing 도서관 건축에 1 분 동안 분리기.DNA 단편화. DNA 단편화를 위해 15마이크로리터의 게놈 DNA 용리를 15마이크로리터 마이크로튜브로 옮기고, 탁상용 원심분리기를 사용하여 1분 동안 원심분리합니다. 게놈 DNA를 550개의 염기쌍으로 단편화합니다.피펫팅 후 10마이크로리터의 단편화된 DNA 혼합물을 깨끗하고 결합력이 낮은 PCR 튜브로 옮깁니다. 여기서 실험을 멈출 수 있습니다. DNA를 4도 또는 영하 20도에서 보존합니다.라이브러리 구성 시퀀싱. 낮은 입력 DNA로 인해 다음 절차에서 지정된 키트를 사용하는 것이 절대적으로 중요합니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 필요한 시약을 준비하고 어떠한 수정도 없이 염기서열분석 라이브러리를 구성합니다.라이브러리 합성 혼합물에 라이브러리 증폭 혼합물을 도포한 후 열 순환기에서 PCR 반응을 수행합니다. PCR 반응은 도시된 바와 같이 실시하였다. PCR 반응의 정제.50마이크로리터의 마그네틱 비드와 피펫을 10회 첨가하고 탁상용 마이크로 원심분리기로 잠시 원심분리합니다. 실온에서 2분 동안 배양합니다. 마그네틱 스탠드에서 5분 동안 또는 용액이 완전히 투명해질 때까지 배양하고 상층액을 제거합니다.제조업체의 프로토콜을 따릅니다. 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 새로운 저결합 PCR 튜브로 옮깁니다. DNA 품질 검사 및 정량화, 염기서열분석.DNA 라이브러리 크기 분포 검증. 3마이크로리터의 샘플 물과 1마이크로리터의 염기서열분석 라이브러리를 첨가하고 소용돌이로 1분 동안 철저히 혼합한 다음 탁상용 원심분리기로 잠시 원심분리합니다. 전기영동을 수행하고 관련 소프트웨어를 사용하여 라이브러리 크기 분포를 검증합니다.주요 단편 피크는 약 300 내지 1,000 염기쌍의 범위여야 합니다. DNA 정량화. 796마이크로리터의 용액 완충액과 4마이크로리터의 형광 시약을 넣고 완전히 혼합합니다.190마이크로리터의 작업 용액을 두 개의 분석 튜브에 분배하고 197마이크로리터를 하나의 분석 튜브에 분배합니다. 190마이크로리터의 작업 용액을 포함하는 각 분석 튜브에 알려진 농도의 DNA 농도를 가진 10마이크로리터의 표준물질을 추가하고, 197마이크로리터의 작업 용액을 포함하는 분석 튜브에 준비된 라이브러리 3마이크로리터를 추가합니다. 간단히 소용돌이를 치고 탁상용 원심 분리기에서 원심 분리기를 사용합니다.3마이크로리터 설정의 형광측정기를 사용하여 DNA를 정량화합니다. DNA 라이브러리의 염기서열분석. 제조업체의 프로토콜에 따라 염기서열분석 라이브러리를 준비합니다.시약 카세트와 플로우 셀을 염기서열분석 기기에 설정하고 제조업체의 프로토콜에 따라 염기서열분석 실행 정보를 입력합니다. 염기서열분석을 실행합니다. 결과를 나타냅니다.고품질 DNA 추출에서 오염 물질의 노출은 프로토콜에서 중요한 포인트로 남아 있습니다. 오염 여부를 육안으로 검사하기 위해 완보동물을 페니실린과 스트렙토마이신과 같은 항생제에 배양하고 500회 현미경으로 개인을 검사했습니다. 여기에서 볼 수 있듯이 완보동물 주변에서 보이는 미생물은 완전히 조명됩니다.효율적인 균질화, DNA 추출, 단편화 및 라이브러리 준비에 따릅니다. 라이브러리의 크기 분포는 품질 관리를 위해 고감도 전기영동을 사용하여 검증됩니다. 보라색 선과 녹색 선은 각각 1, 500 및 25 염기 쌍의 위쪽 및 아래쪽 마커를 나타냅니다.L레인은 사다리 마커이고, S 레인과 N1에서 N4 레인은 동일한 실험의 5회 반복이며, 모두 단일 완보동물 표본에서 시작합니다. 200에서 1, 000 염기쌍 사이의 광범위한 균일 및 분포에서 볼 수 있듯이, 당사의 프로토콜은 매우 낮은 입력값에서도 재현성이 높습니다. 다음은 단일 시퀀싱 실행에서 얻은 동기화된 읽기에 대한 빠른 QC의 결과입니다.판독은 300 염기 쌍의 예비 끝으로 얻어지며, 여기서 정방향 및 역방향 판독은 각각 상단과 하단에 표시됩니다. 여기에 표시된 분포는 300 쌍의 엔드 리드의 전형적인 분포이며, 매우 높은 품질의 염기는 처음 200 염기쌍에 대해 Q30 이상을 호출하고 끝으로 갈수록 점차 감소합니다. 따라서 이 방법은 하나의 샘플에 대해 단일 개체만 사용합니다.이전의 완보동물 게놈 염기서열 분석 프로젝트에서 요구되었던 것과 같은 엄청난 양의 동물에 대한 요구 사항은 없습니다. 대부분의 완보동물에 대한 배양 방법은 아직 확립되지 않았습니다. 그러므로, 현장 조사에서 직접 얻은 것과 같이 단일 개체로부터 유전체학 염기서열 분석을 가능하게 하는 것은 완보동물 분자생물학에 큰 영향을 미칠 것이며, 다른 작은 동물에게도 큰 영향을 미칠 수 있습니다.당사의 DNA 염기서열분석 방법은 희귀 돼지풀, 선충류, 전나무 등 아직 염기서열분석이 이루어지지 않은 수많은 미생물을 구역의 일부와 더 넓은 공공 구역을 연결하여 분석할 수 있도록 하여 다양한 생물학적 메커니즘이 가능할 수 있는 환경을 더욱 넓힐 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

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완보동물 Hypsibius exemplaris에서 qRT-PCR을 통한 상대 전사체 수준 비교를 위한 단일 동물, 단일 튜브 RNA 추출

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Ultralow 입력된 게놈 시퀀싱 단일 Tardigrade 견본에서 라이브러리 준비

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