암 세포 선 종양 Microenvironment에 Monocytes/대 식 세포의 모집 연구에서 유전자 발현의 조건부 최저

이 프로토콜의 전반적인 내용은 암세포에서 유전자 발현의 조건부 녹다운을 활용하여 in vitro에서 종양 미세환경으로의 단핵구 및 대식세포의 동원을 연구하는 것입니다. 이 방법은 암세포와 면역 체계 세포 사이의 교차 스톡의 특성과 관련된 종양 미세환경 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 여기에 사용된 시스템이 단일 벡터 클로닝을 필요로 하고, 여러 클론을 빠르게 생성할 수 있으며, 매우 낮은 수준의 두께를 나타낸다는 것입니다.

또한 항체와 직접 접촉하지 않고 인간 단핵구를 정제하는 방법이 입증되어 우발적인 활성화를 피하면서 인간 단핵구의 순도를 95% 이상 증가시킵니다. 바이러스 입자를 생성하기 위해 HEK-293 세포의 70%confluent 150mm 접시를 pLKO-tet-on shRNA 25마이크로그램, psPAX 패키징 플라스미드 25마이크로그램 및 엔벨로프 발현 플라스미드 pMD2 5마이크로그램으로 transfection합니다. G는 표준 프로토콜에 따라 transfection 시약을 사용합니다.

150mm 접시에 믹스를 추가합니다. 다음날, 배지를 10 밀리몰 나트륨 부티레이트와 20 밀리몰 HEPES가 보충된 DMEM으로 변경하여 세포에서 렌티바이러스 생산을 유도합니다. 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소에서 8시간 동안 배양합니다.

8시간 후, PBS로 세포를 세척하고 20밀리몰 HEPES와 부티르산나트륨이 없는 신선한 DMEM 배지 25ml를 추가합니다. 48시간 동안 배양한 후 피펫으로 바이러스 함유 배지를 조심스럽게 수집합니다. 안정적인 세포주를 생성하려면 HCT-116 대장암 세포와 MDA-MB-231 유방암 세포를 12-well plate와 well당 50,000개의 cell에 seeding하는 것으로 시작합니다.

섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 배양합니다. 세포가 60-70% 합류하면 PBS로 세포를 세척하고 각 웰에 1밀리리터의 바이러스 함유 배지를 추가합니다. 다음날, 흡인에 의해 바이러스 함유 배지를 조심스럽게 제거합니다.

그런 다음 PBS로 세포를 세척한 후 테트라사이클린이 없는 FBS를 함유한 배지를 추가합니다. 72시간 후, 이전과 같이 세포를 세척하고 바이러스 형질주입된 세포를 선택하기 위해 밀리리터당 1마이크로그램의 퓨로마이신이 보충된 배지를 추가합니다. 3일에서 14일 동안 퓨로마이신이 있는 곳에서 세포를 배양하여 바이러스 형질도입 세포를 선택합니다.

바이러스가 형질도입된 세포를 가진 세포에서 퓨로마이신(puromycin)에 의한 웰의 부분적 사멸을 관찰합니다. 형질도입되지 않은 세포는 퓨로마이신이 있는 곳에서는 성장하지 않습니다. 이러한 대조 세포가 사멸하면 항생제가 있는 상태에서 2주 동안 조건부 조절 세포주의 배양을 계속하여 조건부 조절 세포주를 생성합니다.

퓨로마이신 내성 HCT-116 대장암 및 MDA-MB-231 유방암 세포에서 농도가 다른 독시사이클린의 배지를 첨가하고 세포를 72시간 동안 배양하여 조건부 knockdown의 효율성을 검증합니다. Cell lysate를 준비한 후 Western Blot 분석을 통해 Knockdown 수준을 확인합니다. PAI-1의 수준은 다음과 같습니다.

말초 혈액 단핵구를 분리하려면 먼저 15ml의 밀도 구배 용액을 포함하는 50ml 튜브 3개를 준비합니다. 그런 다음 중력 흐름에 설정된 피펫 컨트롤러를 사용하여 밀도 구배 용액 위에 30ml의 희석된 혈액을 천천히 층을 이룹니다. 실온에서 400g의 스윙 로터에 25분 동안 쉬지 않고 원심분리기를 넣습니다.

원심분리 후 최상층을 폐기하고 말초 혈액 단핵 세포를 포함하는 중간층을 새로운 50ml 튜브로 옮기고 FBS 보충 PBS를 최대 50ml까지 첨가합니다. 120g의 실온에서 10분간 원심분리기를 사용합니다. 스핀 후 함유된 혈소판 함유 상층액을 제거합니다.

최종 원심분리 및 채취 후, FBS가 보충된 PBS 50ml에 펠릿을 재현탁하고 혈구계를 사용하여 말초 혈액 단핵 세포를 계수합니다. 120g에서 세포를 원심분리한 후, 1밀리몰 EDTA를 함유한 FBS가 보충된 PBS에서 펠릿을 밀리리터당 5천만 세포의 최종 농도로 재현탁합니다. 그런 다음 세포 현탁액 및 혼합물 1밀리리터에 대해 50마이크로리터의 음성 선택 항체 칵테일을 추가하여 단핵구를 농축하기 시작합니다.

실온에서 10분 동안 배양합니다. 배양 후 밀리리터당 50마이크로리터의 마그네틱 비드를 추가하고 혼합하여 10분 더 배양합니다. 그런 다음 FBS 및 EDTA가 포함된 PBS를 최대 25ml까지 첨가하고 말초 혈액 단핵 혼합물을 50ml 튜브를 수용할 수 있는 자석에 넣습니다.

실온에서 10분 동안 배양한 후 마그네틱 비드가 튜브 벽에 부착되어 용액에서 비단핵구 세포를 격리합니다. 25ml 피펫을 사용하여 튜브에서 단핵구가 포함된 용액을 제거하면서 피펫으로 튜브 측면을 만지지 않도록 주의하십시오. 상층액을 원심분리하고 제거한 후, 10%TET-free FBS 및 1%pen-strep을 함유하는 RPMI 배지에 단핵구를 함유한 펠렛을 재현탁합니다.

24웰 플레이트의 웰에 0.5ml 용량의 HCT-116 또는 MDA-MB-231 세포 40, 000개를 3회 시딩하여 분석을 시작합니다. 다음 날, 우물에 필터를 추가합니다. 그런 다음 암세포 상단에 배치된 BSA 처리된 다공성 멤브레인 인서트에 0.3 밀리리터 부피의 단핵구 8, 000개를 플레이트하고 섭씨 37도와 5% 이산화탄소에서 배양합니다.

48시간 후에 삽입물을 수집합니다. 여분의 배지를 털어내고 솜 끝이 있는 애플리케이터로 내부 표면을 정밀하게 문질러 이동하지 않은 세포를 제거합니다. Wright-Giemsa 방법을 사용하여 인서트의 바깥쪽을 염색합니다.

마이그레이션된 대식세포가 위로 향하게 하여 필터를 장착한 후 20배율 대물렌즈가 있는 광학 현미경을 사용하여 슬라이드를 이미지화합니다. 필터당 9개 필드의 사진을 찍고 모든 필드에서 마이그레이션된 대식세포를 계산합니다. Boyden Chamber Assay는 암세포로의 단핵구의 이동을 정량화하는 데 사용되었습니다.

MDA-MB-231 유방암 세포가 있는 경우, PAI-1을 하향 조절하기 위해 공동 배양에 독시사이클린을 첨가한 후 단핵구의 이동을 33% 억제했습니다. 이러한 단핵구 이동의 억제는 HCT-116 대장암 세포가 있을 때 더욱 두드러졌는데, 독시사이클린 투여에 의한 PAI-1의 녹다운은 단핵구 이동을 74% 감소시켰으며, 독시사이클린 처리된 암세포의 배지를 화학유인물질의 공급원으로 웰 바닥에 배치했을 때 유사한 결과가 관찰되었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 인간 암 세포주에서 유전자 발현 녹다운을 위해 기능적 tet-on 시스템을 사용하여 인간 단핵구에 대한 암 유래 분비 단백질 PAI-1의 화학유인 효과를 연구하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.