Name: 해 부 및 마우스 뇌 개발의 코로나 슬라이스 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: 학습하세요 발달 중인 마우스 뇌하수체를 해부하고 관상면 슬라이스를 준비하는 방법을. 조직 구조를 보존하여 호르몬 조절 및 세포 분화 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 국립 자연 과학 재단의 중국 (31201086, 31470759 및 31671219) 및 상하이 자연 과학 재단 (12ZR1436900)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

C57BL/6 마우스 특정 병원 체 자유로운 조건에서 사육 된다. 동물 관리 및 두 번째 군사 의학 대학에서 윤리 위원회에 의해 승인 지침 준수는 모든 동물 실험 방법.
 1. 해 부의 출생 후 개발 뇌 <ol><li>수행 마 취: 저체온증을 유발 하 얼음에 신생아 쥐 (P0-P5) 장소. 쥐 나이의 5 일 보다 오래 된, 대 한 마 취를 유도 하기 위해 5% 우 레 탄 (몸 무게의 30 µ L/g)을 intraperitoneally 주사. 꼬리/발가락 pinches 응답을 평가 합니다. 마우스는 유해 자극에 반응 하는 후에 진행.</li>
	<li>부드럽게 녹화는 forepaws에 의해 (얼굴 위쪽으로 뒤에 누워) 부정사 위치에 마우스를 확보 하 고 되 고 수 있는 작업 표면에 hindpaws (즉, 스티로폼) 화학 증기 두건 안쪽 고정.</li>
	<li>Transcardial 관류 수행.
	<ol><li>마우스 흉 곽을 마음 (및 기타 흉부 장기) 노출 수술가 위로 잘라.</li>
		<li>무딘 집게와 뛰는 심장을 장악 하 고 좌 심 실에 26 G (0.45 m m) 바늘을 삽입. 버퍼링 heparinized 인산 염 분 가득한 10 mL 주사기 바늘 연결 (PBS; 5 mg/mL 나트륨 아 질산염 및 10 U/mL 헤 파 린 보충, pH 7.4, 따뜻하게 사용 하기 전에 37 ° C). 즉시 오른쪽 아 트리 움 잘가 위로 자르고 오른쪽 아 트리 움 종료 액체는 분명 때까지 따뜻한 PBS 가진 시체를 perfuse 시작. 
		참고: 대략 5-10 mL PBS 신생아 쥐에 대 한 필요와 성인 쥐에 대 한 10-20 mL PBS.</li>
		<li>바늘 그 자리에 유지 하 고 다른 주사기 4 %paraformaldehyde (PFA; pH 7.4)으로 가득 변경 합니다. 10 mL과 대 한 정착 액의 20 mL perfuse 신생아와 P21 마우스, 각각. 
		주의: PFA 독성이 있다. 그것은 피부 및 호흡기 자극, 눈 손상 일으킬 수 있습니다. 장갑을 착용 하 고 화학 후드 작업.</li>
	</ol></li> <li>PFA-고정 마우스 목을 벨 및 두개골 뼈가 위로 자르면.
	<ol><li>는 부드럽게 리프트는 두개골의 기지에서 hindbrain 작은 집게. Sella turcica의 첫 징후, 정지 해제 하지만 보류 hindbrain, 뇌 줄기 및 좋은 위 두뇌의 기지에 연결 하는 신경 섬유 절단. 이 단계는 뇌 하 수 체는 뇌와 멀리 리프트 되지 않습니다 보장 하기 위해 중요 하다.</li>
		<li>다음 두뇌 운동 계속 하 고 뇌를 완전히 노출 하는 뇌를 제거 합니다. 뇌 하 수 체, 측면 trigeminal 신경를 포함 하 여 전체 sella 지역 잘라 고 설상 뼈가 (약 3 x 5 m m 2) 위 아래.</li>
	</ol></li> <li>35 m m 음식 또는 찬 4 %2 mL를 포함 하는 6-잘 접시의 한 잘 해 부 조직 넣어 PFA (pH 7.4). P0-p 7 pituitaries, P14 pituitaries, P21-P28 pituitaries, 및 성인 pituitaries 3 h 1.5 h에 대 한 1 시간 40 분 동안 4 ° C에서 조직 수정.</li>
	<li>뇌 하 수 체의 추가 분리 <ol><li>씻어 10 mL PBS, 5 변화, 15 분 함께 고정된 조직. 그 주변 조직 함께 신생아 뇌와 설상 뼈 아래 탈수에 직접 처리할 수 있습니다. 그러나 5 일 보다 오래 된 쥐에서 뇌 하 수 체 동맥 해리 될는, 스테레오 현미경 더.</li>
		<li>1 mL PBS를 포함 하는 35 mm 접시에 고정된 조직을 넣어. P5-P14 pituitaries에 대 한 신경 및 미세 집게와가 위, 뼈 사이 연결 막 제거 하 고 신중 하 게 전체 하지만 sella turcica 떠나 함께 측면 trigeminal 신경 뇌 하 수 체를 분리 합니다. 절연된 선 및 신경으로 연결 막으로 연결 되는 &#34; H &#34;-같은 모양 ( 그림 1B).</li>
		<li>위한 P21 및 성인 pituitaries, 신경 및 뇌 하 수 체는 주위 연결 막 제거 하 고 주변 조직에서 선 무료. 렌즈 청소 티슈 페이퍼와 뇌 조직을 포장 하 고 포함 카세트에 넣어. 
		참고: 작은 뇌 하 수 체 렌즈 청소 티슈 페이퍼 감싸기 표본의 어떤 잠재적인 손실을 방지 하 고 다음 파라핀 포함 절차에서 조직의 무결성을 유지 도움이 됩니다. 곳을 알아내는 포함 절차에서 작은 병에서 처리 하는 경우는 뇌 하 수 체를 포장 하는 데 필요한 되지 않을 수 있습니다.</li>
	</ol></li></ol> 2. 소스 및 단면화 파라핀 <ol><li>탈수 15 분에 대 한 50%, 65%, 75%, 및 95% 에탄올 솔루션 카세트 포함에 표본. 그 후 탈수 순수 에탄올, P0-으로 각 3 분의 3 변화 땀 샘 P4, P5-P14 땀 샘, 그리고 5 분으로 각 4 분 P21 및 이전에 대 한. 크 실 렌와 명확한 3 변경, P0-으로 각 3 분 땀 샘 P4, P5-P14 땀 샘, 그리고 5 분으로 각 4 분 P21 및 이전 합니다. P0-P4 땀 샘에 녹은 파라핀 왁 스, 3 변화, 7 분 침투 그리고 8 분 두 번 6 분 한 번 P5 및 오래 된 샘. 
	참고: 조직 처리에 대 한 최적의 조정할 수 있다 경험. 높은 품질 섹션을 얻으려면, 부족 또는 이상 탈수를 피해 야 한다. 크 실 렌을 사용 하 여 조직 삭제에 대 한 마찬가지입니다.</li>
	<li>방향을 포함 하는 때 <ol><li>콘솔 시스템을 포함 하는 조직에 카세트에서 표본 제거 고 그것 기본 몰드 반 녹은 파라핀 왁 스로 가득 합니다. 포함 뇌 하 수 체의 올바른 방향 코로나 섹션을 만족 시키기 위해 필수적 이다.</li>
		<li>위한 P21 및 성인 뇌 하 수 체 동맥, 뇌 하 수 체의 짧은 축 기준 형 (단면)의 하단 표면에 수직으로 위치. 설상 뼈와 삼차 신경 해부학 랜드마크로 서 P0-p 4와 P5-P14 pituitaries에 대 한 각각 사용 합니다. 동양 그들의 trigeminal 신경 또는 횡단 lamina 기본 몰드의 하단 표면에 수직인 설상 뼈의 표본.</li>
		<li>부드럽게 잡고 조직 원하는 위치에 따뜻하게 잘 집게로 왁 스 냉각 접시에 반 고체 될 때까지. 녹은 파라핀 왁 스 몰드를 가기. 왁 스가 완전히 경화 될 때까지 냉각 파라핀 블록 허용. 
		참고: 같은 방법으로 신생아 뇌 하 수 체는 뇌 하 수 체 배아 일 18.5에서 (E18.5)을 치료 수 있습니다. pituitaries 하지만 (Rathke &#39; s 파우치) E16.5 전체 머리 포함 해야 하 고 기본 몰드의 하단 표면에 수직 (미가 입)에서 화살 축 중심 보다 젊은.</li>
	</ol></li> <li>10-20 분 동안-20 ° C에 파라핀 블록을 진정 하 고 다음 컷에 얇은 조각 (4 µ m 두께 선호)는 톰으로. 만족을 코로나 섹션, 정밀한 단면 중 파라핀 블록의 위치를 조정 합니다. 다음 절차에서 분할의 분리를 방지 하기 위해 polylysine 코팅 유리 슬라이드에 조직의 조각을 마운트. 
	참고: 또는, 표본 수 탈수 있을 15%에서 30% (W/V) 자당 솔루션 (PBS) 그들은 동일한 방향 메서드를 사용 하는 곳을 알아내는 포함 화합물에 포함 하 고 신속 하 게 드라이 아이스에 냉동 바닥에 침 몰 될 때까지 4 ° C에서. 다음 8-10 µ m는 cryostat를 사용 하 여 조각으로 냉동된 조직 블록을 잘라. 그러나 곳을 알아내는-섹션의 형태, 파라핀 섹션을 열 등 한 자주는.</li>
</ol> 3. H &#38; E 얼룩이 지 고 면역 형광 라벨 <ol><li>따뜻한 열에 슬라이드 55 ° C에서 차단 및 크 실 렌, 2 변화, 4 분 각 dewax. 95% 에탄올 두 번와 75% 에탄올 두 번, 3 분 샘플을 탈수. 세척 통에 5 분 증류수와 슬라이드.</li>
	<li>H에 대 한 &#38; 전자 얼룩, 얼룩 졸업생 되며 솔루션 6 분에 대 한 섹션, runn에 씻어ing 수돗물 2 분 45 s, 및 2 분 동안 물에 씻어 다시 0.2% 암모니아 물으로 구분 합니다. 1 분 2 분에 오신으로 얼룩 순차적으로 탈수, 취소, 그리고 탑재 다음 섹션 95% 에탄올을 탈수.</li>
	<li><ol><li>면역 형광 라벨 3% H 2 O 2와 0.01% 할머니 3 생 peroxidases을 비활성화를 실 온에서 20 분을 포함 하는 메탄올을 가진 섹션을 취급 합니다. 검색 끓는 2 분 품에 대 한 압력 밥 솥에서 검색 버퍼 (1 mM EDTA와 1 mM Tris HCl, pH 7.4)에 섹션 37에서 30 분 동안 차단 버퍼 (PBS에 5% 염소 혈 청) 섹션 항 ° c.</li>
		<li>토끼 반대로 성장 호르몬 (GH) 항 체 (1:2, 000) 또는 토끼 (GFAP) 안티 폐해 fibrillary 산 성 단백질 항 체 (1:2, 000) 섹션 4에서 하룻밤 블로킹 버퍼에 희석을 품 어 ° c.</li>
		<li>37 35 분 이차 항 체 (염소-토끼 IgG-HRP, 블로킹 버퍼에 1:300) 섹션을 품 어 ° c.</li>
		<li>실 온에서 15 분 동안 Biotinyl Tyramide (0.3% H 2 O 2를 포함 하는 Tris 버퍼 식 염 수에 1:50)를 사용 하 여 신호를 증폭 및 시각화 Streptavidin Alexa594 또는 488 (차단 버퍼, 30 분, 37 ° C에 1:300).</li>
		<li>Counterstain 실 온에서 5 분 동안 DAPI (PBS에 50 mg/L)와 핵. 
		참고: 그것은 수 없습니다 Tyramide 신호 증폭 (TSA) 시스템을 사용 하 여 신호를 증폭 하는 데 필요한. 또는, 형광 활용 된 이차 항 체는 신호를 시각화 하기 위해 사용할 수 있습니다.</li>
	</ol></li> <li>형광 현미경을 사용 하 여 취득 이미지 갖춘 DAPI, 텍사스, 빨강과 FITC 필터 세트 × 4/0.13 × 40/0.75 목표 5.0 메가 픽셀 카메라. 사용 하 여 360, 488, 594 nm 레이저 파장 이미징 DAPI, 알 렉 사 488-, 및 알 렉 사 594 스테인드 섹션, 각각. 레이저 파워 최적화 (0.8은 일반적으로 사용 되었다) 및 각 채널에 대해 원하는 수준으로 노출 시간. 이미지 수집 소프트웨어 제어 아래 이미지 및 이후 이미지 프로세싱 소프트웨어를 사용 하 여 형광 이미지 오버레이.</li>
</ol>

<ol><li>Fauquier, T., Lacampagne, A., Travo, P., Bauer, K., Mollard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hidden+face+of+the+anterior+pituitary%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Hidden face of the anterior pituitary.</a> Trends Endocrinol Metab. 13 (7), 304-309 (2002).</li>
<li>Haedo, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+pituitary+function+by+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Horm+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of pituitary function by cytokines.</a> Horm Res. 72 (5), 266-274 (2009).</li>
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<li>Cao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZBTB20+is+required+for+anterior+pituitary+development+and+lactotrope+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">ZBTB20 is required for anterior pituitary development and lactotrope specification.</a> Nat Commun. 7, 11121(2016).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

Murine pituitaries 개발, 그것은 그들의 작고 연약한 기능 및 독특한 해 부 특성6,8적절 한 코로나 섹션을 기술적으로 어려운 되었습니다. 일부 연구 그룹 따라서 배아와 신생아 뇌11,12의 형태를 분석 하 중반 화살 섹션을 선택 했다. 하지만 뇌 하 수 체의 중반 화살 섹션 앞쪽, 중간, 수 이며 또한 단일 조각에서 후부 엽 코로나 섹션은 매우 선호 이러한 3 개의 돌출부의 최대 보기를 표시할 수 있습니다. 특히, 볼륨의 결정 등 뇌와 apoptotic의 수를 계산 및 셀, 확산의 지역 정량화 연구 코로나 섹션 그들의 대표자에서 중반 화살 섹션 보다 우량 하다. 여기, 우리는 하 부 뇌 하 수 체 땀 샘 고 마우스 개발에서 뇌 코로나 섹션을 준비 하는 방법 제시.
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뇌 하 수 체 또는 hypophysis 항상성1,2에 필수적인 호르몬을 분 비 하는 중요 일 분 비 기관 이다. 해부학, 뇌 하 수 체는 neurohypophysis와는 adenohypophysis 구성 된 ' 2-에-하나 ' 구조 이다. 이 부분 매우 다르게 다른 배아 기원과 기능 있다. neurohypophysis 신경 ectoderm에서 파생 되 고 옥 시 토 신과 antidiuretic 호르몬을 secretes. adenohypophysis Rathke의 주머니에서 유래 되며 성장 호르몬, 갑 상선-자극 호르몬, 여 포-자극 호르몬, 황 호르몬, prolactin adrenocorticotropic 호르몬 등 호르몬의 출시에 대 한 책임 및 melanocyte-자극 호르몬3,,45.
뇌 하 수 체 마우스 두개골의 설상 골 (sella turcica)의 등 쪽 표면에 그리고 연약한 줄기로는 뇌의 바닥에 연결. 삼차 신경 및 anteriorly 광학 chiasm6,7옆으로 포위 된다. 선 그것의 긴 축 머리의 수직으로 길쭉한 타원형 모양이 있다. 그것의 등 쪽 표면에는 neurohypophysis와는 adenohypophysis 수 쉽게 수 구분, 등 쪽 중간 지역 및 옆으로 및 ventrally 후자의 확장 점령 전와. 출생 후 개발 하는 동안 뇌 하 수 체의 크기 출생8,9후 첫 번째 달에서 급속 하 게 증가 한다. 그럼에도 불구 하 고, 마우스 뇌 하 수 체는 여전히 매우 작습니다 1.9 mg의 평균 무게와 긴 축 직경 3 m m의 크기에 성인10, 21 (P21), 출생 후 하루에 2-2.5 mm P0에만 1-1.5 m m의 긴 축 직경에.
마우스 뇌 하 수 체의 단일 조각에 adenohypophysis 및 neurohypophysis를 표시 하는 코로나 섹션 선호 된다. 그러나, 몇 가지 기술은 개발 하는 그것의 매우 작은 크기와 뚜렷한 해부학 쥐에서 뇌 하 수 체 땀 샘의 코로나 섹션 만족을 얻을 해야 합니다. 이 비디오 자료 마우스 뇌 하 수 체 동맥 해 부 다른 개발 단계에서 뇌 코로나 섹션을 준비 하는 방법을 보여 줍니다.

<table><tbody><tr><td>Tools/Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors-straight</td><td>JinZhong</td><td>J21010</td><td>은 다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>고급 가위-strainght</td><td>JinZhong</td><td>WA1010</td><td>은 다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>둔기 집게</td><td>JinZhong</td><td>JD1020</td><td>은 다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>Fine forceps</td><td>뇌하수체 분리용</td> <td>Dumont</td><td>RS-5015</td></tr><tr><td>26G(0.45mm) 바늘</td><td>HongDa</td><td></td><td>경막 관류용</td></tr><tr><td>주사기(1mL)</td><td>BD</td><td>300841</td><td>다른 공급업체에서 구매 가능</td></tr><tr><td>주사기(10mL)</td><td>BD</td><td></td><td>는 다른 공급업체에서 구매 가능</td></tr><tr><td>35mm 접시</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>다른 공급업체에서 구매 가능</td></tr><tr><td>렌즈 청소지</td><td>ShuangQuan</td><td></td><td>은 다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다</td></tr><tr><td>해부학 현미경</td><td>OLYMPUS</td><td>SZX-ILLB2-200</td><td>은 다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다</td></tr><tr><td>임베딩 카세트</td><td>Thermo Fisher</td><td>22-272423</td>은 <td>다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다</td></tr><tr><td>조직 임베딩 콘솔 시스템</td><td>KEDEE</td><td>KD-BM11</td><td>은 다른 공급업체</td></tr><tr>에서 구입할 수 있습니다.<td>Microtome</td><td>Thermo Fisher</td><td>HM315R</td><td>은 다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>Superfrost-Plus 슬라이드</td><td>Thermo Fisher</td><td>22-037-246</td><td>은 다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>커버 유리</td><td>Thermo Fisher</td><td>12-543</td><td>은 다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다</td></tr><tr><td>. 형광 현미경</td><td>OLYMPUS</td><td>BH2-RFCA</td><td>는 다른 공급업체<strong에서 구입할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>>이름</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Urethane</td><td>BBI</td><td>EB0448</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>for PBS</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>PBS용</td></tr><tr><td>Na2HPO4.12H2O</td><td>시그마</td><td>71650</td><td>PBS</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>시그마</td><td>P2222</td><td>PBS</td></tr><tr><td>NaNO2</td><td>시그마</td><td>237213</td><td></td></tr><tr><td>헤파린 나트륨 주입</td><td>SPH</td><td>H31022051</td><td>관류 식염수</td></tr><tr><td>파라포름알데히드(PFA)</td><td>시그마</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>SCR</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>SCR</td><td>10023418</td><td></td></tr><tr><td>파라핀</td><td>써모 피셔</td><td>8330</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>시그마</td><td>H9627</td><td>H& E 염색</td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>시그마</td><td>E4009</td><td>H& E 염색</td></tr><tr><td>토끼 반대로 성장 호르몬 (GH)</td> <td>immunostaining</td>항체를 위한 <td>국가 호르몬</td><td></td></tr><tr><td></td><td>뇌하수체 프로그램</td><td></td><td></td></tr><tr><td>immunostaining</td>염소 반대로 토끼 IgG를 위한 토끼 반대로 쥐<td>GFAP 항체</td><td>시그마</td><td>G9269</td></tr><tr><td>,</td><td>immunostaining</td>TSA 체계를 위한 HRP <td>잭슨</td><td>111-035-003</td></tr><tr><td></td><td>NEN 생명 과학 제품</td>스트렙타비딘 <td>면역염색을 위한</td> <td>NEL700</td></tr><tr><td>, 알렉사 플루어 594</td><td>써모 피셔</td><td>S32356</td> 면역<td>염색</td></tr><tr><td>방지 FITC 알렉사 플루어 488</td><td>써모 피셔</td><td>A11090</td> 면역<td>염색을 위한</td></tr></tbody></table>

해 부 및 마우스 뇌 개발의 코로나 슬라이스 준비

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

뇌 하 수 체 또는 hypophysis 항상성에 필수적인 호르몬을 분 비 하는 중요 일 분 비 기관 이다. 그것은 별도 배아 기원과 기능을 가진 두 개의 동맥 이루어져 있다-는 neurohypophysis와는 adenohypophysis. 개발 마우스 뇌 하 수 체는 길쭉한 타원형 모양으로 섬세 하 고 작은. 마우스 뇌 하 수 체의 단일 조각에 adenohypophysis 및 neurohypophysis를 표시 하는 코로나 섹션 선호 된다.
이 프로토콜의 목표 달성 마우스 개발에서 잘 보존 된 조직 구조와 적절 한 뇌 코로나 섹션 것입니다. 이 프로토콜에서 우리 자세히 해 부 제대로 개발 하는 쥐에서 뇌 하 수 체 분 비를 처리 하는 방법을 설명 합니다. 첫째, 쥐 해 부 하기 전에 포름알데히드의 transcardial 관류에 의해 고정 됩니다. 다음 세 가지 다른 해 기술 쥐의 나이 따라 그대로 뇌 하 수 체 땀 샘을 얻을에 적용 됩니다. 태아 쥐 세 일 최대 배아 일 (전자) 17.5-18.5와 신생아, trigeminal 신경, 동맥, 설상 골을 포함 하 여 전체 sella 지구는 해 부. 강아지에 대 한 세 출생 후 일 (P) 5 월 14 일, 뇌 하 수 체 땀 샘 삼차 신경으로는 전체적으로 해 부. 마우스 3 주 이상, 뇌 하 수 체 분 비는 신중 하 게 해 부 무료 주변 조직에서. 우리는 또한 코로나 섹션 만족을 얻기 위해 주변 조직 랜드마크로 서 사용 하 여 적절 한 방향에서 뇌 하 수 체 땀 샘을 포함 하는 방법을 표시 합니다. 이 메서드는 마우스 개발에 뇌 하 수 체 동맥의 조직학 및 발달 기능 분석에 유용 합니다.

이 프로토콜 개발 쥐에서 뇌 하 수 체 동맥 해 부 하는 메서드를 제공 합니다. 신생아 마우스, 뇌 하 수 체, 삼차 신경 및 아래를 포함 하는 전체 sella 지역 설상 뼈 두개골의 기지에서 밖으로 해 부 했다. 작고 섬세 한 뇌 하 수 체 (그림 1A) 과정에서 그대로 남아. 5 일 보다 오래 된 마우스 측면 trigeminal 신경에 연결 된 뇌 하 수 체 분 비 했다 다음 격리. 마우스 잘 보존 되었다 p 7에서 고립 된 뇌 (그림 1B)의 총 구조. P21 마우스에 대 한 뇌의 크기는 신생아 마우스에 비해 현저 하 게 증가 되었다. 뇌 하 수 체의 주변 조직 (그림 1C)을 제거 하는 동안 성공적으로 보이지 않는 피해와 절연 했다.
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우리는 뇌 하 수 체 동맥 해 부 개발 쥐에서 뇌 코로나 섹션을 준비 하는 프로토콜을 제시.

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

이 절차의 전반적인 목표는 개발 중인 마우스에서 잘 보존된 조직 구조를 가진 적절한 뇌하수체 관상 절편을 달성하는 것입니다. 이 절차는 뇌하수체 조직학, 세포 분화, 증식 및 세포사멸과 같은 뇌하수체 발달 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 발병하는 쥐 뇌하수체를 눈에 보이는 손상 없이 절개할 수 있고 관상 절편을 달성하기 위해 적절하게 방향을 잡을 수 있다는 것입니다.우리는 쥐 뇌하수체를 개발하기 위해 적절한 관상 절편을 얻는 것이 기술적으로 어렵다는 것을 발견했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 갖게 되었습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 마우스를 마취하고 고정한 후 가위를 사용하여 두개골 뼈를 잘라냅니다. 다음으로, 집게를 사용하여 두개골 기저부에서 뒷뇌를 부드럽게 들어 올립니다.그런 다음 셀라 투르시카의 첫 징후가 나타나면 들어 올리는 것을 멈추고 뒷뇌를 잡고 가는 가위를 사용하여 뇌 기저부에 연결된 뇌하수체 줄기와 신경 섬유를 자릅니다. 뇌하수체를 완전히 드러내기 위해 뇌 전체를 계속 들어 올리고 제거합니다. 뇌하수체는 접형골의 등쪽 표면에 있으며 측면으로 삼차 신경으로 둘러싸여 있습니다.그런 다음 가위를 사용하여 뇌하수체, 외측 삼차 신경, 접형골 아래를 포함한 전체 셀라 부위를 자릅니다. 조직을 4% PFA가 함유된 35mm 접시에 넣고 연령에 따라 섭씨 4도에서 40분에서 3시간 동안 배양합니다. 그런 다음 10mL의 PBS를 사용하여 각각 15분씩 5회 교체하여 고정 조직을 세척합니다.고정 조직을 1mL의 PBS가 들어 있는 35mm 접시에 옮기고 실체 현미경으로 뇌하수체를 해리합니다. P5에서 P14 뇌하수체의 경우 미세한 집게와 가위로 신경과 뼈 사이의 결합막을 제거하고 외측 삼차 신경 전체와 함께 뇌하수체를 조심스럽게 분리하되 sella turcica는 남겨 둡니다. P21 및 성인 뇌하수체의 경우 뇌하수체 주변의 신경과 결합막을 제거하고 주변 조직에서 분비샘을 분리합니다.텍스트 프로토콜에 따라 수행된 탈수, 자일렌 세척 및 왁스 침투 후 조직 포매 콘솔 시스템에서 카세트에서 표본을 제거하고 용융된 파라핀 왁스로 반쯤 채워진 기본 주형에 놓습니다. P21 및 성인 뇌하수체의 경우, 데워진 가는 집게를 사용하여 짧은 축이 기본 주형의 바닥 표면에 수직인 뇌하수체를 배치합니다. P0에서 P4 뇌하수체의 경우, 접형골이 기본 주형의 바닥 표면에 수직인 표본의 방향을 지정합니다.P5에서 P14 뇌하수체의 경우, 삼차 신경이 기본 주형의 바닥 표면에 수직인 표본의 방향을 지정합니다. 글랜드를 배치한 후 예열된 가는 집게를 사용하여 왁스가 냉각판에서 반고체가 될 때까지 조직을 원하는 위치에 부드럽게 잡습니다. 용융된 파라핀 왁스로 금형을 채웁니다.왁스가 완전히 응고될 때까지 파라핀 블록을 식히십시오. 파라핀 블록을 섭씨 영하 20도에서 10-20분 동안 냉각한 다음 마이크로톰을 사용하여 얇은 조각으로 자르고 절단하는 동안 파라핀 블록의 위치를 미세 조정합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 면역 라벨링을 수행합니다.여기에서 볼 수 있듯이, 신생아 쥐의 뇌하수체를 해부하기 위해 뇌하수체, 삼차신경, 그 아래의 접형골을 포함하는 전체 셀라 부위를 두개골 기저부에서 해부했습니다. 작고 섬세한 뇌하수체는 그 과정에서 손상되지 않은 채로 남아 있었습니다. 생후 5일 이상 된 쥐의 경우, 외측 삼차신경에 부착된 뇌하수체를 분리했다.P7 마우스에서 분리된 뇌하수체의 성장 구조는 잘 보존되었습니다. 여기에서 P21 마우스의 뇌하수체는 주변 조직을 제거하면서 눈에 띄는 손상 없이 성공적으로 분리되었습니다. 이 그림에서 적절하게 배향된 관상동맥 절편의 H&E 염색은 P0, P7 및 P21 뇌하수체에서 선하수체와 신경하수체의 형태가 잘 보존되어 있음을 보여줍니다.마지막으로, 처리된 슬라이드는 면역형광 라벨링과도 호환되었습니다. 예를 들어, adenohypophysis와 neurohypophysis는 각각 GH와 GFAP의 특이적 면역 표지를 보여주었습니다. 일단 숙달되면 박리에서 포매까지 과정은 성체 마우스의 경우 7.5시간 내에 완료할 수 있으며 제대로 수행되면 어린 마우스의 경우 훨씬 더 짧습니다.이 절차를 시도하는 동안 수술 도구로 뇌하수체를 만지지 않도록 전체 셀라 부위를 절개하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 접두사가 없는 뇌하수체도 분리할 수 있습니다. 이 경우 원치 않는 손상을 방지하기 위해 더 많은 주의를 기울여야 합니다.분비샘도 가능한 한 빨리 절개해야 합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 쥐 뇌하수체를 절개하고 다양한 발달 단계에서 뇌하수체 관상 절개를 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

마우스 뇌 피질에서 translationally 활성화, 손상 synaptoneurosomes (SNS)를 준비하는 방법을 설명합니다. 이 메서드는 활성화된 SNS의 빠른 준비를 위해 허용하는 불연속 Percoll - 자당 밀도 기울기를 사용합니다.

불연속 Percoll - 자당 밀도 구배를 사용하여 마우스를 접속에서 Synaptoneurosomes의 준비

우리는 중간 entorhinal 피질 (멕)의 지느러미-복부 축을 유지 뇌 조각의 준비와 electrophysiological 레코딩을위한 절차를 설명합니다. 위치의 신경 인코딩 멕 내에서 지느러미-복부 조직을 따르기 때문에,이 절차는 탐색 및 메모리에 중요한 세포 메커니즘 조사를 용이하게합니다.

설치류 중간 Entorhinal 피질의 지느러미 - 복부 기관의 조사를 위해 Parasagittal 조각의 작성

이 비디오는 쥐 새끼의 뇌에서 콜리큘로-시상 피질 뇌 절편을 준비하는 방법을 보여줍니다. 고립된 뇌는 표시된 슬라이드에 정렬되고 청각 중뇌와 전뇌를 같은 평면에 정렬하기 위해 비스듬히 절단됩니다. 그런 다음 비브라톰을 사용하여 뇌를 절편화하고, 주요 청각 중뇌 및 전뇌 구조를 포함하는 절편을 보존을 위해 보관실로 옮깁니다.

Preparation of Colliculo-Thalamocortical Slices from a Mouse Pup Brain(쥐 강아지 뇌의 Colliculo-Thalamocortical Slices)

신경 전구 세포의 유사 분열은 신경의 중요한 매개 변수입니다. 신경 전구 세포의 유사 분열에 대한 우리의 이해의 대부분은 고정 된 조직의 분석을 기반으로합니다. 배아 뇌 조각의 라이브 영상은 통제 된 환경에서 높은 공간적 해상도로 유사 분열을 평가하기 위해 다양한 기술입니다.

개발 마우스 배아의 피질 유사 분열의 라이브 영상

유도만능줄기세포(iPSC), 일차 피질 뉴런 및 성상세포에서 유래한 뉴런으로 구성된 공동 배양 시스템을 생성하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 공동 배양 시스템을 통해 새로운 iPSC 유래 뉴런과 채널로돕신-2를 발현하는 기존 피질 뉴런 사이의 시냅스 접촉 및 회로 형성을 감지할 수 있습니다.

공동 문화 시스템에 신경 연결의 형성을 평가하기위한 Optogenetic 접근

여러 각도를 사용하여 마우스 강아지의 머리를 잘라, 우리는 주요 청각 중뇌와 전뇌 구조의 가장 사이의 연결을 캡처 이전에 설명 급성 뇌 조각을 개선.

Colliculo-thalamocortical 마우스 뇌 조각의 변경, 3 차원 챔버 구성 요소의 인쇄 및 멀티 스케일 광학 이미징을 통합

많은 유형의 인간 뇌종양은 뇌 내의 특정 영역에 국한되어 있으며 배양에서 성장하기 어렵습니다. 이 프로토콜은 종양 미세환경의 역할을 다루고 유기형 마우스 뇌 절편에서 자라는 형광 원발성 뇌종양 세포를 분석하여 신약 치료를 조사합니다.

약물 치료를 종양 미세 환경을 공부하고 대상에 대한 뇌종양 / Organotypic 슬라이스 공동 문화 시스템

이 기사에서는, 구체적으로, 메인 마우스 신경생성 틈새에서 유래된 산후 마우스 신경 줄기 세포로부터의 신경구 배양물의 생성을 위한 프로토콜을 설명한다. 신경구는 전구체 세포 수의 추정을 허용하는 두뇌 조직에서 신경 줄기 세포를 확인하기 위하여 이용됩니다. 더욱이, 이 3D 구조물은 세포 운명의 연구 결과허용하는 신경, oligodendrocytes 및 성상 세포를 초래하는 분화한 조건에서 도금될 수 있습니다.

산후 (P1−3) 마우스 신경성 틈새에서 신경구의 격리 그리고 확장

우리는 마우스 뇌 제거 및 신선한 뇌 조직에서 분리 된 영역의 해부를위한 실습, 단계별, 신속한 프로토콜을 제시합니다. 분자 분석을위한 뇌 영역을 얻는 것은 많은 신경 과학 실험실에서 일상화되었습니다. 이러한 뇌 영역은 시스템 레벨 분석을 위한 고품질 전사체 데이터를 얻기 위해 즉시 동결된다.

마우스 뇌를 기능적으로나 해부학적으로 다른 영역으로 미세 해부

우리는 마우스의 등간 중간 해마에서 급성 슬라이스를 준비하는 프로토콜을 제시한다. 우리는 기록의 품질과 기록 된 뉴런의 형태학적 특징의 보존 측면에서 관상 슬라이스와이 트랜스 버사제 준비를 비교합니다.

성인 마우스의 덴테이트 자이루스에서 전신 기록 및 신경 재건을위한 등산 해마에서 급성 슬라이스의 준비

뇌하수체는 신체의 내분비 시스템의 핵심 조절자입니다. 이 기사는 생물학과 기능이 제대로 이해되지 않은 땀샘의 줄기 세포 집단을 연구하기 위해 새로운 3D 시험관 내 모델로서 마우스 뇌하수체에서 오가노이드의 발달을 설명합니다.

뇌하수체 줄기 세포 생물학을 탐구하기 위해 시험관 내 모델로 마우스 뇌하수체에서 오가노이드 개발

학습하세요 발달 중인 마우스 뇌하수체를 해부하고 관상면 슬라이스를 준비하는 방법을. 조직 구조를 보존하여 호르몬 조절 및 세포 분화 연구에 활용할 수 있습니다.

해 부 및 마우스 뇌 개발의 코로나 슬라이스 준비

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