해 부 및 마우스 뇌 개발의 코로나 슬라이스 준비

이 절차의 전반적인 목표는 개발 중인 마우스에서 잘 보존된 조직 구조를 가진 적절한 뇌하수체 관상 절편을 달성하는 것입니다. 이 절차는 뇌하수체 조직학, 세포 분화, 증식 및 세포사멸과 같은 뇌하수체 발달 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 발병하는 쥐 뇌하수체를 눈에 보이는 손상 없이 절개할 수 있고 관상 절편을 달성하기 위해 적절하게 방향을 잡을 수 있다는 것입니다.

우리는 쥐 뇌하수체를 개발하기 위해 적절한 관상 절편을 얻는 것이 기술적으로 어렵다는 것을 발견했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 갖게 되었습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 마우스를 마취하고 고정한 후 가위를 사용하여 두개골 뼈를 잘라냅니다. 다음으로, 집게를 사용하여 두개골 기저부에서 뒷뇌를 부드럽게 들어 올립니다.

그런 다음 셀라 투르시카의 첫 징후가 나타나면 들어 올리는 것을 멈추고 뒷뇌를 잡고 가는 가위를 사용하여 뇌 기저부에 연결된 뇌하수체 줄기와 신경 섬유를 자릅니다. 뇌하수체를 완전히 드러내기 위해 뇌 전체를 계속 들어 올리고 제거합니다. 뇌하수체는 접형골의 등쪽 표면에 있으며 측면으로 삼차 신경으로 둘러싸여 있습니다.

그런 다음 가위를 사용하여 뇌하수체, 외측 삼차 신경, 접형골 아래를 포함한 전체 셀라 부위를 자릅니다. 조직을 4% PFA가 함유된 35mm 접시에 넣고 연령에 따라 섭씨 4도에서 40분에서 3시간 동안 배양합니다. 그런 다음 10mL의 PBS를 사용하여 각각 15분씩 5회 교체하여 고정 조직을 세척합니다.

고정 조직을 1mL의 PBS가 들어 있는 35mm 접시에 옮기고 실체 현미경으로 뇌하수체를 해리합니다. P5에서 P14 뇌하수체의 경우 미세한 집게와 가위로 신경과 뼈 사이의 결합막을 제거하고 외측 삼차 신경 전체와 함께 뇌하수체를 조심스럽게 분리하되 sella turcica는 남겨 둡니다. P21 및 성인 뇌하수체의 경우 뇌하수체 주변의 신경과 결합막을 제거하고 주변 조직에서 분비샘을 분리합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 수행된 탈수, 자일렌 세척 및 왁스 침투 후 조직 포매 콘솔 시스템에서 카세트에서 표본을 제거하고 용융된 파라핀 왁스로 반쯤 채워진 기본 주형에 놓습니다. P21 및 성인 뇌하수체의 경우, 데워진 가는 집게를 사용하여 짧은 축이 기본 주형의 바닥 표면에 수직인 뇌하수체를 배치합니다. P0에서 P4 뇌하수체의 경우, 접형골이 기본 주형의 바닥 표면에 수직인 표본의 방향을 지정합니다.

P5에서 P14 뇌하수체의 경우, 삼차 신경이 기본 주형의 바닥 표면에 수직인 표본의 방향을 지정합니다. 글랜드를 배치한 후 예열된 가는 집게를 사용하여 왁스가 냉각판에서 반고체가 될 때까지 조직을 원하는 위치에 부드럽게 잡습니다. 용융된 파라핀 왁스로 금형을 채웁니다.

왁스가 완전히 응고될 때까지 파라핀 블록을 식히십시오. 파라핀 블록을 섭씨 영하 20도에서 10-20분 동안 냉각한 다음 마이크로톰을 사용하여 얇은 조각으로 자르고 절단하는 동안 파라핀 블록의 위치를 미세 조정합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 면역 라벨링을 수행합니다.

여기에서 볼 수 있듯이, 신생아 쥐의 뇌하수체를 해부하기 위해 뇌하수체, 삼차신경, 그 아래의 접형골을 포함하는 전체 셀라 부위를 두개골 기저부에서 해부했습니다. 작고 섬세한 뇌하수체는 그 과정에서 손상되지 않은 채로 남아 있었습니다. 생후 5일 이상 된 쥐의 경우, 외측 삼차신경에 부착된 뇌하수체를 분리했다.

P7 마우스에서 분리된 뇌하수체의 성장 구조는 잘 보존되었습니다. 여기에서 P21 마우스의 뇌하수체는 주변 조직을 제거하면서 눈에 띄는 손상 없이 성공적으로 분리되었습니다. 이 그림에서 적절하게 배향된 관상동맥 절편의 H&E 염색은 P0, P7 및 P21 뇌하수체에서 선하수체와 신경하수체의 형태가 잘 보존되어 있음을 보여줍니다.

마지막으로, 처리된 슬라이드는 면역형광 라벨링과도 호환되었습니다. 예를 들어, adenohypophysis와 neurohypophysis는 각각 GH와 GFAP의 특이적 면역 표지를 보여주었습니다. 일단 숙달되면 박리에서 포매까지 과정은 성체 마우스의 경우 7.5시간 내에 완료할 수 있으며 제대로 수행되면 어린 마우스의 경우 훨씬 더 짧습니다.

이 절차를 시도하는 동안 수술 도구로 뇌하수체를 만지지 않도록 전체 셀라 부위를 절개하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 접두사가 없는 뇌하수체도 분리할 수 있습니다. 이 경우 원치 않는 손상을 방지하기 위해 더 많은 주의를 기울여야 합니다.

분비샘도 가능한 한 빨리 절개해야 합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 쥐 뇌하수체를 절개하고 다양한 발달 단계에서 뇌하수체 관상 절개를 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.