대뇌 Organoids 파생 Zika 바이러스 감염 개발 인간의 두뇌에는 생체 외에서 줄기 세포를 사용 하 여 모델링
September 19th, 2017
이 프로토콜 개발 인간의 두뇌의 Zika 바이러스 감염을 모델링 하는 데 사용 되는 기술을 설명 합니다. Wildtype 또는 설계 된 줄기 세포를 사용 하 여, 연구원은 다양 한 메커니즘 또는 초기 뇌 감염 및 결과 microcephaly Zika 바이러스에 감염 된 태아에 영향을 미칠 수 있는 치료를 밝히기 위해이 기술을 사용할 수 있습니다.
이 절차의 전반적인 목표는 줄기세포 유래 대뇌 오가노이드를 사용하여 발달 중인 인간 뇌에서 지카 바이러스 감염을 모델링하는 것입니다. 이 방법은 어떤 세포가 감염될 수 있는지, 어떤 단백질이 감염 경로에 관여하는지와 같은 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 초기 인간 감염을 모방하고, 고처리량 분석에 활용할 수 있으며, CRISPR과 같은 집중 유전 기술과 결합할 수 있다는 것입니다.
이 방법은 지카 바이러스 감염 메커니즘에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 약물 스크리닝 및 바이러스 의사 타이핑과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 정기적인 줄기세포 유지 관리 방법을 사용하여 배양액을 50%에서 70% 사이의 합류점으로 가져옵니다.
10-20배 배율의 명시야 현미경을 사용하여 배양물을 검사하고 집락이 검출 가능한 분화가 없는 건강한 형태를 가지고 있는지 확인합니다. 이종 자유 줄기세포 유지 배지를 뜨거운 물에서 섭씨 37도로 가져오고 2ml의 효소 박리 시약과 50마이크로리터의 스톡 암석 억제제 바이알을 실온에서 해동합니다. 다음으로, 초저 부착 U bottom 96 웰 플레이트, 다중 채널 p200 피펫 및 25ml 시약 저장소를 준비합니다.
다음으로, 45ml의 매체를 50ml 원뿔형 튜브로 분취합니다. 45 마이크로 리터의 암석 억제제를 첨가하고 혼합물을 triterating하여 억제제를 철저히 혼합 한 다음 2-4 개의 버전을 혼합합니다. 줄기세포가 포함된 6웰 플레이트의 2웰을 진공 흡입하고 각 웰에 1ml의 무효소 분리 시약을 빠르게 첨가한 다음 플레이트를 섭씨 37도에서 4분 동안 배양합니다.
다음으로, 처리된 웰을 진공 흡입하고 각 웰에 1ml의 효소 박리 시약을 추가합니다. 섭씨 37도에서 5분 동안 배양한 후 인큐베이터에서 플레이트를 꺼냅니다. 플레이트를 부드럽게 두드려 응집된 세포를 분해합니다.
다음으로, 현미경으로 세포를 검사합니다. 큰 세포 클러스터가 여전히 보이면 섭씨 37도에서 2분 더 플레이트를 배양합니다. 클러스터가 육안으로 더 이상 보이지 않을 때까지 단계를 반복합니다.
세포가 적절하게 해리되면 각 웰에 1ml의 이종 자유 줄기 세포 유지 배지를 추가하여 해리 효소를 비활성화합니다. 세포 현탁액을 50ml 원뿔형 튜브로 당기고 세포 계수를 위해 작은 부분 표본을 취합니다. 분리기를 설치하는 동안, 세포를 세고 60, 밀리리터 현탁액 당 000개의 세포를 달성하기 위하여 필요로 한 re-suspension 양을 결정하십시오.
주의깊게 상등액을 제거하고 60, 바위 억제물을 포함하는 매체에 있는 밀리리터 당 000의 세포에 세포를 재 현탁시키십시오. 5ml 피펫을 사용하여 세포를 5-10회 부드럽게 혼합하여 균일한 세포 현탁액을 보장합니다. 즉시 세포 현탁액을 시약 저장소에 추가하고 다중 채널 p200 피펫을 사용하여 150마이크로리터를 바닥 96웰 플레이트의 초저 부착물의 각 웰로 이동합니다.
그런 다음 150 x G에서 플레이트를 1분 동안 원심분리한 다음 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣습니다. 48시간 동안 접시를 방해하지 마십시오. 둘째 날부터 50ml 원뿔형 튜브에 17마이크로리터의 스톡 록 억제제가 포함된 17ml의 배지를 준비합니다.
뜨거운 물로 혼합물을 섭씨 37도로 데웁니다. 인큐베이터에서 오가노이드 플레이트를 꺼내 멀티 채널 p200 피펫을 사용하여 첫 번째 줄의 웰 가장자리에서 75마이크로리터의 배지를 천천히 빨아들입니다. 그런 다음 재빨리 웰로 다시 배출하여 느슨한 세포와 오가노이드를 들어 올립니다.
각 행에 대해 이 분산 프로세스를 반복합니다. 오가노이드가 각 웰의 바닥으로 가라앉았는지 15초 동안 기다린 다음 멀티 채널 p200 피펫을 사용하여 각 웰에서 75마이크로리터의 배지를 천천히 조심스럽게 흡입하고 폐기물 저장소로 분배합니다. 다음으로, 암석 억제제를 포함하는 배지를 시약 저장소로 옮기고, 150마이크로리터의 배지를 각 오가노이드 웰에 분배한 다음 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다.
17 밀리리터의 신선한 배양 매체를 섭씨 37도까지 가열, 이번에는 암석 억제제없이 가열합니다. 100마이크로리터로 설정된 다중 채널 p200 피펫을 사용하여 이전에 표시된 분산 과정을 반복하고 15초 동안 기다렸다가 오가노이드가 웰 바닥으로 가라앉았는지 확인합니다. 그런 다음 각 웰에서 125마이크로리터의 배지를 조심스럽게 흡입하고 150마이크로리터의 예열된 매체로 교체합니다.
플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣습니다. 여기에 표시된 레시피에 따라 매체를 준비한 다음 500 밀리리터 필터에서 혼합 용액을 멸균 여과합니다. 4일째부터 약 24일째에 세포가 감염될 때까지 신경 유도 배지를 사용하여 격일로 정기적인 유지 관리를 수행합니다.
여과가 완료되면 신경 유도 배지 17ml를 섭씨 37도로 데우고 나머지는 섭씨 4도에서 보관합니다. 100 마이크로리터로 설정된 다중 채널 p200 피펫을 사용하여 이전에 보여준 것처럼 오가노이드 플레이트의 모든 웰을 분산시킵니다. 오가노이드가 웰 바닥으로 가라앉았는지 확인할 때까지 15초 동안 기다립니다.
각 웰에서 125마이크로리터의 배지를 조심스럽게 흡입하고 125마이크로리터의 새로운 신경 유도 배지로 교체합니다. 오가노이드가 지카 바이러스에 감염될 준비가 될 때까지 이 신경 유도 묘기를 격일로 반복합니다. 얼의 1x 균형 잡힌 소금 용액, 1x PBS 및 신경 유도 배지를 뜨거운 물 욕조에서 섭씨 37도까지 가져옵니다.
다음으로, 1x earle's solution에 있는 알려진 농도의 지카 바이러스를 감염의 목표 다중도(일반적으로 0.1에서 10 사이)로 희석합니다. p200 피펫을 사용하여 각 오가노이드 웰에서 모든 배지를 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 200마이크로리터의 예열된 1x PBS로 오가노이드를 빠르게 세척합니다.
각 웰에서 매체를 제거할 때 오가노이드를 만지거나 피펫으로 빨아들이지 않는 것이 중요합니다. 이는 오가노이드에 돌이킬 수 없는 손상을 일으킬 수 있습니다. 이 경우 오가노이드를 버리는 것이 가장 좋습니다.
다음으로, 단일 채널 p200 피펫을 사용하여 각 오가노이드 웰에서 남아 있는 모든 액체를 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 모의 감염을 위한 50x earle's 용액 또는 지카 바이러스 용액을 각 웰에 빠르게 추가합니다. 완료되면 각 오가노이드가 완전히 잠겼는지 확인하고 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 다시 2시간 동안 넣습니다.
바이러스 노출이 완료된 후 오가노이드의 각 웰을 200마이크로리터의 PBS로 세척합니다. 오가노이드가 15초 동안 안정화될 때까지 기다린 다음 단일 채널 p200 파이펫을 사용하여 PBS를 제거합니다. 마지막으로 각 웰에 200마이크로리터의 새로운 신경 유도 배지를 추가하고 플레이트를 다시 인큐베이터에 넣습니다.
DAPI, phospho-vimentin, TBR2 및 MAP2를 사용한 염색을 결합하여 오가노이드 내에서 형성되는 피질 구조를 보여줄 수 있습니다. 이러한 구조에는 각 로제트 내의 심실 영역(ventricular zone), 심실하영역(sub-ventricular zone), 중간 영역(intermediate zone) 및 피질 플레이트(cortical plate)가 포함됩니다. 오가노이드를 108일째까지 배양하면 발달의 후반 단계를 관찰할 수 있습니다.
이러한 유형의 오가노이드에서는 피질 층상이 두드러지지는 않지만, 신경교형성으로의 자연스러운 전환은 생체 내에서와 마찬가지로 발생합니다. 지카 바이러스에 감염된 지 3일이 지나면 오가노이드 크기의 차이가 눈에 띄게 나타납니다. 이 차이의 규모는 오가노이드에 적용되는 감염의 바이러스 다양성에 따라 다릅니다.
이러한 오가노이드 크기의 차이는 감염된 오가노이드가 분해되기 시작할 때까지 다음 주에 걸쳐 증가할 것입니다. 3일 후에는 모의 우물에 비해 감염된 우물에서 세포 파편이 증가할 것입니다. 이 절차를 시도하는 동안에는 생존 가능한 감염 물질이 사용되기 때문에 안전한 실험실 관행을 따르는 것이 중요합니다.
이 절차에 따라 신경 발달 지카 바이러스 감염과 관련된 생물학에 대한 추가 질문에 답하기 위해 면역조직화학 또는 RNAC와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.
개요
이 연구는 줄기세포 유래 오가노이드를 활용하여 발달 중인 인간 뇌에서 지카 바이러스 감염을 모델링하는 프로토콜을 제시합니다. 연구자들은 감염에 민감한 세포와 감염 경로에 관여하는 단백질을 조사하여 지카 바이러스 감염 메커니즘과 소두증과의 연관성에 대한 통찰을 제공합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 바이러스학
- 줄기세포 생물학
배경
- 지카 바이러스는 감염된 배아에서 소두증과 같은 심각한 신경 장애를 일으킬 수 있습니다.
- 감염 메커니즘을 이해하는 것은 치료 개입 개발에 매우 중요합니다.
- 줄기세포 유래 대뇌 오가노이드는 초기 인간 뇌 발달을 위한 효과적인 모델로 작용합니다.
- 이 연구는 고처리량 분석과 CRISPR과 같은 유전자 기술의 장점을 탐색합니다.
연구 목적
- 발달 중인 인간 뇌에서 지카 바이러스 감염을 모델링하는 것.
- 감염된 세포 유형을 식별하고 감염 경로를 탐구하는 것.
- 약물 스크리닝 및 신경학적 영향을 이해하기 위한 플랫폼을 개발하는 것.
사용된 방법
- 이 연구는 줄기세포 유래 대뇌 오가노이드를 주요 플랫폼으로 사용합니다.
- 줄기세포 라인을 조작하여 감염 연구를 위한 오가노이드를 생성합니다.
- 다중 오믹스 워크플로우는 언급되지 않았으며; 초점은 세포 감염 역학에 있습니다.
- 주요 단계에는 오가노이드 배양 준비, 성장 유지, 바이러스 감염 도입이 포함됩니다.
- 실험 기간 내내 최적의 성장 조건을 보장하기 위해 정기적인 배지 교체가 수행됩니다.
주요 결과
- 이 프로토콜은 오가노이드에서 지카 바이러스 감염 메커니즘을 관찰할 수 있게 합니다.
- 초기 평가는 세포 감염 경로와 반응 메커니즘을 강조합니다.
- 세포 분화와 바이러스 요인에 대한 취약성에 대한 통찰력을 얻습니다.
- 이 연구는 지카 바이러스에 대한 미래 치료 평가를 위한 기초적인 통찰력을 제공합니다.
결론
- 이 연구는 발달 중인 뇌에 대한 지카 바이러스 영향에 대한 상세한 탐구를 가능하게 합니다.
- 감염 메커니즘에 대한 이해는 뇌 발달에 대한 바이러스 영향과 싸우기 위한 미래 치료 전략에 정보를 제공할 수 있습니다.
- 함의는 신경발달 질환 모델에 대한 더 광범위한 조사로 확장됩니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Modeling Zika virus infection in human cerebral organoids provides a species-matched system to evaluate neurotropic mechanisms and assess antiviral interventions. This approach supports target validation by identifying susceptible neural progenitor cells and infection pathways relevant to neurodevelopmental risk. The model enables mechanistic de-risking in early discovery by linking viral exposure to phenotypic outcomes such as cell death and microcephaly-like phenotypes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Identifies neural progenitor cells as primary targets of Zika virus infection, supporting hypothesis testing of viral tropism.
- Operational Value: Enables interrogation of infection mechanisms using stem cell-derived systems that reflect human-specific biology.
- Strategic Value: Supports target confidence by clarifying which cell types and proteins are involved in the infection pathway.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a three-dimensional platform for quantifying viral load and cytopathic effects over time.
- Operational Value: Compatible with high-throughput formats and genetic perturbation tools like CRISPR for pathway interrogation.
- Strategic Value: Enables scalable screening of compounds that modulate viral entry, replication, or host response.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models microcephaly-associated phenotypes including organoid size reduction and cellular debris accumulation post-infection.
- Operational Value: Supports longitudinal assessment of infection outcomes from early exposure to later developmental stages.
- Strategic Value: Improves predictive confidence in preclinical models by recapitulating human-specific cortical layering and gliogenesis timing.
Pipeline & Workflow Integration
The cerebral organoid model fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical assessment of neurotropic compounds.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of which cells are infectable and which proteins mediate viral entry and pathogenesis.
- Screening: Supports assay readiness through standardized organoid generation, maintenance, and infection protocols in ultra-low attachment plates.
- Analytics: Generates quantitative readouts including organoid size, cell death markers, and viral antigen expression for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects early infection events to downstream phenotypes like disrupted cortical structure and gliogenesis, supporting biomarker-aligned evaluation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying other neurotropic viruses or genetic modifiers of viral susceptibility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct observation of virus-host interactions in a human-relevant system.
- Operational Value: Standardized differentiation and infection workflows reduce variability and support cross-experiment reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing early insight into neurological liability of viral pathogens or therapeutic candidates.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of antiviral compounds based on efficacy in preventing organoid dysplasia and cell loss.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, organoid generation, and virology under biosafety-level appropriate conditions.
- Dependent on ultra-low attachment plates, enzymatic dissociation tools, and controlled incubation systems for organoid formation.
- Necessitates standardization of media changes, rock inhibitor use, and neural induction timing across batches.
- Adaptation to other models may require optimization of infection timing and multiplicity based on differential progenitor susceptibility.
- Practical limitations include organoid variability and the need for careful handling to avoid mechanical disruption during medium exchange.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:43
Creating Cerebral Organoids from iPSC / hESC 2D Culture (Day 0)
3:30
Cerebral Organoid Maintenance (Day 2)
4:37
Cerebral Organoid Maintenance (Day 3)
5:14
Cerebral Organoid Maintenance (Day 4+)
6:13
Organoid Infection with ZIKV (~Day 24)
7:45
Results: Characterization of ZIKB-infected Organic Degradation
8:47
Conclusion
