Name: 면역 형광 분석 및 Intratumoral+ PD-1 팀-3+ CD8의 정량화를 다중화+ T 세포 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: 배우세요 다중 면역형광 분석을 통해 종양 미세환경에서 CD8+ T 세포 표현형을 자동 계수하는 방법을. 이 기술은 면역치료 반응 예측 바이오마커를 식별하여 대규모 암 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 인 국가 뒤 암 (잉카) (동부 표준시), 리그 죄수 르 암 (동부 표준시), 대학교 소 르 본 파리 시 테 (동부 표준시), ANR (Selectimmunco) (동부 표준시), Labex 면역-종양학 (동부), SIRIC CARPEM (CG, 동부 표준시)에서 교부 금에 의해 지원 되었다. EdG은 Fondation 아크의 친교에 의해 투자 되었다. EV 및 CD APHP (증권 거래소 검색 대회)의 친교에 의해 투자 되었다. 조흥은 대학교 소 르 본 파리 시 테 (성립 박사)의 친교에 의해 자금이 다. 저자는이 프로젝트에 그들의 자금에 대 한 브리스톨 마이어스 스 퀴 브를 감사 합니다. 저자는 병원 Européen 조르주 퐁피두의 병 리 및 Necker (Laurianne 챔 블, 엘 로디 미셸 Gisèle Legall)의 부를 감사합니다. 저자는 PARCC, 병원 Européen 조르쥬 퐁피두 (코 린 Lesaffre)의 조직학 플랫폼을 감사합니다.

이 연구는 헬싱키의 선언에 따라 실시 되었다과 지역 윤리 위원회 (CPP Ile 드 프랑스 nr. 2012-05-04)에 의해 승인 되었다. 동의 동료에 포함 된 참가자 로부터 얻은 것입니다.
1. 조직 자료
<ol><li>수술 당일에 RCC 조직 샘플을 수집 합니다. 실 온 (병 리과)에서 외과 견본을 처리 합니다.</li>
	<li>약 0.5 c m x 0.5 cm x 건조 관에 0.5 cm 크기의 종양 샘플을 수집 합니다. 스냅 액체 질소에서 냉동 고-80 ° c.에 저장</li>
	<li>최적의 절삭 온도 화합물 샘플 코트. 4-6 µ m 두께 섹션으로-20 ° C에서 cryostat와 샘플 섹션. 12 h에 대 한 슬라이드에 건조 한 공기를 직접 건조를 피하기 위해-80 ° C에서 그들을 저장 하는 예제를 보자.</li>
	<li>보고는 되며 샘플의 품질을 확인 하 고 오신 스테인드 섹션.</li>
</ol>2. 제자리에서 TILs의 면역 형광 염색
<ol><li>
절차 지침
	<ol>
<li>실 온에서 모든 실험 단계를 수행 합니다.</li>
		<li>모든 단계에 대 한 희석 Tris 버퍼 염 분 (TBS, 참조 테이블의 재료)를 수행 합니다.</li>
		<li>1 차적인 항 체 외피 후 제외 하 고 모든 단계에 대 한 큰 술에 씻어를 수행 합니다. 후자에 대 한 사용 Tris 버퍼 염 Tween20 (TBST, 재료의 표참조). 버퍼 구성 및 재구성에 대 한 보충 표 1을 참조 하십시오.</li>
		<li>습도 챔버를 사용 하 여 항 체 외피와 세척을 위한 착 색 병에 대 한.</li>
		<li>섹션을 절차 동안 건조 하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
전처리
	<ol>
<li>조직 샘플을 포함 하는 슬라이드를 해 동 하 고 신중 하 게 건조 종이 타월 견본 주위 슬라이드. 소수 성 장벽 펜 조직을 포함 하는 반응 지역 delimitate ( 재료의 표참조). 2 분 동안 건조입니다.</li>
		<li>5 분, 2 분, 건조에 대 한 100% 아세톤에 샘플을 수정 하 고 10 분 TBS로 세척.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
채도 봉쇄
	<ol>
<li>Avidin 0.1%의 3 방울과 10 분에 대 한 슬라이드를 pretreat, 탭 및/또는 영화는 avidin 배포 공기 방울을 제거 하 고 다음 biotin 0.01%의 3 방울과 10 분 동안 치료를 슬라이드 (참조 테이블의 자료), 탭, 및/또는 영화. 워시와 함께 tbs.</li>
		<li>Fc 수용 체 봉쇄를 수행 합니다. 100 µ L의 정상적인 혈 청에 tbs. 사용 레이블된 2 차 또는 3 차 항 체로 동일한 호스트 종에서 혈 청 희석의 5% 볼륨/볼륨 적용 ( 재료의 표참조). 여기, 당나귀 혈 청 사용 되었다. 30 분 동안 품 어.</li>
		<li>부 화, 동안 안티 CD8, PD-1, 그리고 팀-3 항 체 (자료 테이블)을 스핀 짧게. 추가 표 2에 설명 된 대로 TBS에서 기본 항 체의 믹스를 준비 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
면역 염색 법으로 CD8, PD-1, 그리고 팀-3
	<ol>
<li>1 차적인 항 체 혼합물을 준비 합니다. 사용 하는 항 체에 대 한 테이블의 자료 와 보충 표 2 를 참조 하십시오 (안티 CD8, PD-1 팀-3, 그리고 그들의 해당 보조 항 체) 및 그들의 농도.</li>
		<li>탭 및 나머지 당나귀 혈 청 (단계 2.3.2에서에서 추가) 영화. 100 µ L 1 h 습도 챔버에 대 한 1 차 항 체 라는 비 혼합의와 슬라이드를 품 어.</li>
		<li>부 화, 동안 짧게 Cyanine 5 반대로 토끼, AF488-안티-염소, 그리고 biotinylated 반대로 마우스 항 체, 회전 하 고 보충 표 2에 설명 된 대로 2 차 항 체의 믹스를 준비.</li>
		<li>워시 5 분 건조에 대 한 TBST에 슬라이드 슬라이드.</li>
		<li>습도 상공에서 30 분 2 차 항 체의 100 µ L로 슬라이드를 품 어.</li>
		<li>보충 표 2에 설명 된 대로 Cy3 streptavidin를 포함 하는 제 3 항 체의 혼합물을 준비 합니다.</li>
		<li>씻고 10 분 건조에 대 한 TBS에 슬라이드 슬라이드.</li>
		<li>30 분 동안 3 차 항 체 혼합물의 100 µ L로 슬라이드를 품 어.</li>
		<li>씻고 10 분 건조에 대 한 TBS에 슬라이드 슬라이드.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
셀 마운트
	<ol>
<li>슬라이드 4'를 탑재, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride DAPI-포함 된 매체 (1.5 µ g/mL DAPI) 형광 현미경 검사 법에 대 한 호환 coverslip로 장착 (참조 테이블의 자료). 참고: 각 실험에 대해 부정적인 컨트롤, 항 체 isotype 일치 한 슬라이드가 해당 항 체로 같은 농도에서 사용 되었다. 이 착 색 사용 마우스 IgG1, 토끼 IgG, 및 염소 IgG 부정적인 제어 항 체 ( 재료의 표참조). 긍정적인 통제로 우리는 각 실험에 대 한 테스트 표식에 대 한 긍정적인 것으로 알려져 인간 hyperplasic 편도 선 사용. 전형적인 얼룩 결과 (그림 1)에 설명 되어 있습니다. 모노-CD8의 얼룩, PD-1, 그리고 팀-3 수행 해야 개별적으로 (슬라이드 당 한 얼룩) 같은 전처리와 DAPI 없이. 어떤 항 체만 DAPI 장착 매체 없이 동일한 실험 조건에서 슬라이드도 수행 되어야 합니다. 슬라이드는 어떤 항 체와 DAPI 없이 동일한 실험 조건을 사용 하 여 몇 군데 한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 형광 분석 및 자동화 된 셀 수
<ol><li>자동 현미경 이미지 수집
	<ol>
<li>프로토콜을 만듭니다.<ol>
<li>자동된 현미경 소프트웨어 및 형광 조명 기를 켭니다.</li>
			<li>메뉴 모음에서 "파일", "프로토콜을 만들기"를 클릭 선택 "DAPI," "FITC," 및 "TRITC"</li>
			<li>"다음," "조직 섹션," 클릭 하 고 클릭 합니다 "," "프로토콜 이름입니다." 선택한 이름, 예를 들어 "CD8-PD-1-팀-3," 클릭 "다음" "저장."</li>
			<li>직접 무대에 슬라이드를 놓습니다.</li>
			<li>메뉴 모음에서 "설정", "설정" 클릭 새 창에서 "홈 Z 설정"을 클릭 합니다.</li>
			<li>노출 시간 조정 긍정적인 제어 즉 는 CD8 슬라이드, PD-1, 팀-3 트리플-스테인드 DAPI 샘플.</li>
			<li>제어 막대에서 클릭 "설정 노출."</li>
			<li>충분 하지만 포화 하지 신호를 얻을 때까지 각 필터에 대 한 노출 시간을 조정 합니다.</li>
			<li>흑백 영상에 대 한 다음을 수행 합니다.</li>
			<li>인수를 선택 하 고 '자동 초점'에서 DAPI 필터를 선택 합니다.</li>
			<li>"검색 지역 제한"에서 객관적인 상단 슬라이드의 상단 왼쪽된 모서리에 이동 합니다. "마크"를 클릭 합니다. 오른쪽 아래 모서리에 대 한 같은 마십시오. 참고:이 단계 delimitates 저전력 (lp로 영상) 4 X; 이미징의 영역 시리즈의 모든 샘플을 서라운드로 잘 마크를 알고 있어야 합니다.</li>
			<li>고 출력 (HP) 이미징에 대 한 다음을 수행 합니다.</li>
			<li>'자동 초점'에서 "DAPI"을 선택 합니다.</li>
			<li>'수집' 밴드에서 "DAPI", "FITC", "Cy3", 및 "Cy5"를 선택 합니다. "확인"을 클릭 합니다. 메뉴 모음에서 "프로토콜" 저장 "파일"을 클릭 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>슬라이드를 검사 합니다.<ol>
<li>"파일" 메뉴 막대에서 "프로토콜 로드"를 클릭 하 여 프로토콜을 로드 합니다. "시작"을 클릭 합니다.</li>
			<li>' 실험실 ID' (이미지 저장을 위한 폴더 위치)를 입력 합니다. 슬라이드 슬라이드를 식별 하기 위해 ID를 입력 합니다. "다음"을 클릭 합니다.</li>
			<li>"흑백 영상" (필드 밝은 빛 아래에서 전체 슬라이드를 스캔 4 x 목표를 사용 하 여 순차 이미지)를 클릭 합니다. 참고:이 슬라이드의 회색조 개요를 생성합니다.</li>
			<li>"표본 찾기"를 클릭 합니다. 낮은 해상도 (4 배)에서 스캔을 조직 영역 선택: 'Ctrl' 키를 누른 클릭 필드는 커서를 사용 하 여 선택 하거나 선택 취소 필드 (그림 2A).</li>
			<li>각 필드의 형광 레드 블루 그린 이미지 수집을 위한 "LP 이미징" (영상 x 4)을 클릭 합니다.</li>
			<li>HP 필드 선택 'Ctrl' 키 고 선택 하거나 선택 취소 (20 배)의 높은 해상도에서 스캔 될 조직의 영역에 해당 하는 필드는 커서를 사용 하 여 필드에 클릭 하십시오. 5 분야 (그림 2B)를 선택 합니다.</li>
			<li>각 필드 (그림 2C)의 multispectral 이미지 수집을 위한 "HP 이미징" (영상 x 20)을 클릭 합니다.</li>
			<li>LabID에서 처음에 선택 된 폴더에 이미지를 저장 하려면 "데이터 저장"을 클릭 합니다. 참고: 프로세스 요약 이며 그림2. (조직 감지, 필드 선택) 각 단계에 대 한 알고리즘 증가 고 전체 자동 검색 프로세스에 대 한 사용자에 의해 훈련 될 수 있습니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>형광 이미지 분석 및 자동화 된 셀 결합된 분석 소프트웨어와 계산
	<ol>
<li>스펙트럼 라이브러리를 빌드하십시오.<ol>
<li>이미지 분석 소프트웨어를 엽니다.</li>
			<li>왼쪽된 패널에서 "라이브러리"를 구축 엽니다. '이미지 로드', 아래 "찾아보기"를 클릭 하 고 하나의 모노-스테인드 이미지 (예를 들어, CD8/Cyanine 5)를 선택 합니다.</li>
			<li>(예를 들어, Cyanine 5) fluorophore를 선택 합니다. "추출"을 클릭 합니다. 라이브러리에 저장할 수 "저장" 클릭 합니다. "저장"을 클릭 합니다.</li>
			<li>PD-1, 같은 과정을 반복 팀-3, 그리고 DAPI 모노 스테인드 슬라이드의 각 fluorophore의 스펙트럼을 통합 하기 위하여. 참고: 각 fluorophore (여기, 신장), 특정 조직에 대 한 사용에 대 한 스펙트럼 통합 스펙트럼 라이브러리를 구축 하지만 이미 존재 하는 "합성" 라이브러리를 사용할 수 있습니다. Autofluorescence 스펙트럼은 조직 기준으로 엄격 하 게, 그것은 하나의 자동 형광 스펙트럼 라이브러리 프로젝트를 수행 하는 것이 중요.</li>
		</ol>
</li>
		<li>새 프로젝트를 만듭니다.<ol>
<li>메뉴 모음에서 "파일", "새로운 프로젝트"를 클릭 합니다. '찾기 기능' 탭에서 "셀 분할"을 선택 합니다. '형질' 탭에서 "형질"을 선택 합니다. "생성"을 클릭 합니다.</li>
			<li>통합 프로젝트에서 대표 이미지.<ol>
<li>'파일' 탭에서 "이미지 열기"를 클릭 합니다. 전체 시리즈의 10 ~ 30 대표 이미지를 선택 합니다. Autofluorescence 제거 하 비-얼룩진 슬라이드를 추가 합니다. 오른쪽 패널에서: 선택 라이브러리 소스. Fluorophore를 선택 하 고 이전 빌드 스펙트럼 라이브러리에 해당 하는 그를 선택.</li>
			</ol>
</li>
			<li>조직 autofluorescence를 제거 하려면 "AF 버튼"을 클릭 하 고 빈 슬라이드에 autofluorescence의 영역을 선택 합니다.</li>
			<li>이미지 처리와 합성 이미지 생성<ol>
<li>"모든" 형광 라이브러리와 복합 이미지 (그림 3)를 생성 하는 autofluorescence 스펙트럼 통합 준비를 클릭 합니다. '눈' 아이콘 '보기 편집기' 패널을 열고 표시 하는 데이터 선택을 클릭: 선택 마커 CD8, PD-1, 팀-3, 및 DAPI. autofluorescence를 제거 합니다. 소프트웨어에 의해 제시 하는 단계를 따릅니다.</li>
			</ol>
</li>
			<li>세그먼트 셀.<ol>
<li>'칸'에 셀 세그먼트 "핵"과 "막"을 선택 합니다. "핵" 탭에 DAPI 핵 counterstain로 설정 합니다.</li>
				<li>'최대 및 최소 크기 (픽셀)' 탭에서 입력 "40"와 "176" 최소 및 최대 크기로 각각. '최소' 신호에 대 한 "0.13"을 설정 합니다. "분할" 탭에서 "2.60"을 설정 합니다. "핵" 탭에서 "0.81"을 설정 합니다. "막 신호 사용 하 여 분할을 지원"을 선택 합니다.</li>
				<li>"세그먼트 셀" 화면의 하단 부분을 클릭 합니다. 핵의 세분화 및 세포의 막을 확인 하 고 셀의 DAPI과 막 형광 일치 하지 않는 경우 다른 매개 변수와 함께 다시 시도. 참고: 소프트웨어 핵 DAPI 얼룩 및 셀 크기를 기준으로 셀을 인식 합니다. 프로젝트에 따라 셀 매개 변수 (크기, 분할, 픽셀)를 조정 합니다.</li>
			</ol>
</li>
			<li>형 셀.<ol>
<li>'표현 형' 탭에서 "추가"를 클릭 합니다. 셀 형 카테고리 생성: CD8 (블루 도트) / CD8-PD-1 (빨간 점) / CD8-PD-1-팀-3 (녹색 점) / 기타 (검은 점) (그림 4).</li>
				<li>각 카테고리의 셀의 5 개 이상의 예제를 선택 합니다. "분류자 기차"를 클릭 합니다. 참고:이 소프트웨어는 통계 분류 알고리즘을 생성합니다.</li>
				<li>"모든" 각 세포의 표현 형을 얻기 위해 형을 클릭 합니다. 참고: 소프트웨어는 정확도의 신뢰 구간 (CI)와 함께 한 셀의 표현 형을 제공합니다.</li>
				<li>눈 및 자동된 수의 차이 조화 된 때까지 소프트웨어를 학습 하 여 알고리즘을 개선 (오류 < 5%). 선택은 관심의 셀에 대 한 CI. 참고: 우리는 허용으로 55 %CI 기초 훈련을 만들 하기로 결정 했습니다.</li>
			</ol>
</li>
			<li>알고리즘 및 프로젝트를 저장 합니다.</li>
			<li>'파일' 아래에서 "프로젝트"를 선택 합니다. 이름을 지정 하 고 "저장"을 클릭 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>일괄 처리는 일련의 분석을 수행 합니다.<ol>
<li>"일괄 분석"을 선택 합니다. 프로젝트를 선택 합니다. 분석 이미지를 추가 합니다. 데이터 저장소의 폴더를 선택 합니다. "실행"을 클릭 합니다. 복합 이미지의 품질을 확인 합니다. 시리즈의 모든 이미지에 대 한 형질을 확인 합니다. 참고: 결합 된 이미지 분석 소프트웨어는 모든 셀 구획 (막/세포질/핵) 신호를 통합합니다. 형질 단계 알고리즘의 훈련 수 시간이 걸리는 단계 이기는 하지만 결정적 이다. 각 이미지의 모든 데이터는 한.txt 파일에 있습니다. 한 셀 (특히 그것의 표현 형의 CI와 주어진)의 모든 데이터는 한 줄에 있습니다. 각 슬라이드는 이미지 수집 및 후속 5 필드에 수행 했다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>원시 데이터와 자동된 세포 수의 세대의 통합
	<ol>
<li>통계 프로그램을 사용 하 여 데이터를 계산 합니다.<ol>
<li>1 환자에 대 한 분석 5 필드에 해당 하는 5 이미지에서 모든 데이터를 계산 합니다. 통계 플랫폼을 사용 하 고 경험된 통계, 데이터 관리자 또는 분석을 수행 하는 데이터 과학자. 자동으로 CI > 55%를 선택 하면, 그들의 표현 형에 따라 셀을 계산 하는 스크립트를 빌드하십시오.</li>
			<li>시리즈의 모든.txt 파일을 같은 폴더에 넣어.</li>
		</ol>
</li>
		<li>데이터를 압축을 풉니다.<ol>
<li>한 폴더의 모든.txt 파일을 넣어. 3.3.1 단계에서 내장 자동 스크립트를 실행 합니다. R 스크립트에 의해 생성 된 출력.csv 파일을 엽니다. .Xl 형식으로 저장 합니다. 출력 각 환자에 대 한 (즉, CD8 혼자, CD8-PD-1, CD8-PD-1-팀-3) 각 표현 형에 대 한 셀의 수를 수집합니다.</li>
			<li>필드 당 각 환자에 대 한 셀의 평균 수를 계산: 필드 각 환자에 대 한 셀의 수를 정규화 (즉, 5) 필드의 수는 셀 수를 나눕니다.</li>
			<li>총 CD8 중 PD-1+ 세포의 비율을 계산+ T 세포, 및 총 CD8 중 PD-1+ 팀-3+ 셀+ T 세포. 이 단계의 요약 그림 5 를 참조 하십시오. 참고: R 언어 (또는 선택의 다른 프로그래밍 소프트웨어) 제대로 작성 하 고, 명령을 실행 하는 데 필요한 이며 그래서 경험 많은 사용자 또는 통계/데이터 과학자 필수적 이다. R 프로그램 같은 환자 데이터를 계산할 수 있습니다 하지만 한 환자의 5.txt 파일의 이름을 고유한 환자 id에 해당 하는 동일한 시작 있어야 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>통계 분석
	<ol>
<li>통계 소프트웨어를 사용 하 여 결과의 통계 분석을 위해.</li>
		<li>통계의 도움으로 적절 한 통계 분석을 수행 합니다.<ol>
<li>사용 비패라메트릭 Wilcoxon 두 셀 고기 (그림 6) 경찰-1 MFI의 비교에 대 한 순위 테스트 서명. Pearson의 카이 제곱 테스트 covariate 및 조직학 특성 상관.</li>
			<li>진행 성 자유로운 생존, 그리고 콕스 회귀 모델 등 전반적인 생존과 질병-무료 생존 시간 이벤트 결과에 covariate 효과 추정을 추정 하는 카 플 란-마이어 메서드를 사용 합니다.</li>
			<li>고려 하십시오 p-값은 중요 한로 0.05 보다 낮은.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Borghaei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nivolumab+versus+Docetaxel+in+Advanced+Nonsquamous+Non-Small-Cell+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> N Engl J Med. 373 (17), 1627-1639 (2015).</li>
<li>Granier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunotherapy%3A+Rational+and+recent+breakthroughs%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Med+Interne%22%5BJournal%5D)">Cancer immunotherapy: Rational and recent breakthroughs.</a> Rev Med Interne. 37 (10), 694-700 (2016).</li>
<li>Motzer, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nivolumab+for+Metastatic+Renal+Cell+Carcinoma%3A+Results+of+a+Randomized+Phase+II+Trial%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Nivolumab for Metastatic Renal Cell Carcinoma: Results of a Randomized Phase II Trial.</a> J Clin Oncol. 33 (13), 1430-1437 (2015).</li>
<li>Robert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nivolumab+in+previously+untreated+melanoma+without+BRAF+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Nivolumab in previously untreated melanoma without BRAF mutation.</a> N Engl J Med. 372 (4), 320-330 (2015).</li>
<li>Robert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ipilimumab+plus+dacarbazine+for+previously+untreated+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Ipilimumab plus dacarbazine for previously untreated metastatic melanoma.</a> N Engl J Med. 364 (26), 2517-2526 (2011).</li>
<li>Rosenberg, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atezolizumab+in+patients+with+locally+advanced+and+metastatic+urothelial+carcinoma+who+have+progressed+following+treatment+with+platinum-based+chemotherapy%3A+a+single-arm%2C+multicentre%2C+phase+2+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Atezolizumab in patients with locally advanced and metastatic urothelial carcinoma who have progressed following treatment with platinum-based chemotherapy: a single-arm, multicentre, phase 2 trial.</a> Lancet. 387 (10031), 1909-1920 (2016).</li>
<li>Schadendorf, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pooled+Analysis+of+Long-Term+Survival+Data+From+Phase+II+and+Phase+III+Trials+of+Ipilimumab+in+Unresectable+or+Metastatic+Melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Pooled Analysis of Long-Term Survival Data From Phase II and Phase III Trials of Ipilimumab in Unresectable or Metastatic Melanoma.</a> J Clin Oncol. 33 (17), 1889-1894 (2015).</li>
<li>Ribas, A., Hu-Lieskovan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+does+PD-L1+positive+or+negative+mean%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">What does PD-L1 positive or negative mean?</a> J Exp Med. 213 (13), 2835-2840 (2016).</li>
<li>Rizvi, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunology.+Mutational+landscape+determines+sensitivity+to+PD-1+blockade+in+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer immunology. Mutational landscape determines sensitivity to PD-1 blockade in non-small cell lung cancer.</a> Science. 348 (6230), 124-128 (2015).</li>
<li>Roussel, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composite+biomarkers+defined+by+multiparametric+immunofluorescence+analysis+identify+ALK-positive+adenocarcinoma+as+a+potential+target+for+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22OncoImmunology%22%5BJournal%5D)">Composite biomarkers defined by multiparametric immunofluorescence analysis identify ALK-positive adenocarcinoma as a potential target for immunotherapy.</a> OncoImmunology. 6 (4), e1286437(2017).</li>
<li>Pages, F., Granier, C., Kirilovsky, A., Elsissy, C., Tartour, E. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0007455116303733">Biomarqueurs prédictifs de réponse aux traitements bloquant les voies de costimulation inhibitrices.</a> Bull Cancer. 103, Suppl 1. S151-S159 (2016).</li>
<li>Tumeh, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+blockade+induces+responses+by+inhibiting+adaptive+immune+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance.</a> Nature. 515 (7528), 568-571 (2014).</li>
<li>Fourcade, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+Tim-3+and+PD-1+expression+is+associated+with+tumor+antigen-specific+CD8%2B+T+cell+dysfunction+in+melanoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Upregulation of Tim-3 and PD-1 expression is associated with tumor antigen-specific CD8+ T cell dysfunction in melanoma patients.</a> J Exp Med. 207 (10), 2175-2186 (2010).</li>
<li>Koyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+resistance+to+therapeutic+PD-1+blockade+is+associated+with+upregulation+of+alternative+immune+checkpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Adaptive resistance to therapeutic PD-1 blockade is associated with upregulation of alternative immune checkpoints.</a> Nat Commun. 7, 10501(2016).</li>
<li>Wherry, E. J., Kurachi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+insights+into+T+cell+exhaustion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular insights into T cell exhaustion.</a> Nat Rev Immunol. 15 (8), 486-499 (2015).</li>
<li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tim-3+expression+represents+dysfunctional+tumor+infiltrating+T+cells+in+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Urol%22%5BJournal%5D)">Tim-3 expression represents dysfunctional tumor infiltrating T cells in renal cell carcinoma.</a> World J Urol. 34 (4), 561-567 (2016).</li>
<li>Sakuishi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Tim-3+and+PD-1+pathways+to+reverse+T+cell+exhaustion+and+restore+anti-tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Targeting Tim-3 and PD-1 pathways to reverse T cell exhaustion and restore anti-tumor immunity.</a> J Exp Med. 207 (10), 2187-2194 (2010).</li>
<li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+immunohistochemistry%2C+imaging%2C+and+quantitation%3A+a+review%2C+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification%2C+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li>
<li>Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoprofiling+as+a+predictor+of+patient%27s+response+to+cancer+therapy-promises+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunoprofiling as a predictor of patient's response to cancer therapy-promises and challenges.</a> Curr Opin Immunol. 45, 60-72 (2017).</li>
<li>Badoual, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1-expressing+tumor-infiltrating+T+cells+are+a+favorable+prognostic+biomarker+in+HPV-associated+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer.</a> Cancer Res. 73 (1), 128-138 (2013).</li>
<li>Nizard, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28537262">Induction of resident memory T cells enhances the efficacy of cancer vaccine.</a> Nat Commun. 8, 15221(2017).</li>
<li>Nghiem, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+Blockade+with+Pembrolizumab+in+Advanced+Merkel-Cell+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">PD-1 Blockade with Pembrolizumab in Advanced Merkel-Cell Carcinoma.</a> N Engl J Med. 374 (26), 2542-2552 (2016).</li>
<li>Roussel, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composite+biomarkers+defined+by+multiparametric+immunofluorescence+analysis+identify+ALK-positive+adenocarcinoma+as+a+potential+target+for+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Composite biomarkers defined by multiparametric immunofluorescence analysis identify ALK-positive adenocarcinoma as a potential target for immunotherapy.</a> Oncoimmunology. (4), (2017).</li>
<li>Woods, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mismatch+in+epitope+specificities+between+IFNgamma+inflamed+and+uninflamed+conditions+leads+to+escape+from+T+lymphocyte+killing+in+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mismatch in epitope specificities between IFNgamma inflamed and uninflamed conditions leads to escape from T lymphocyte killing in melanoma.</a> J Immunother Cancer. 4, 10(2016).</li>
<li>Granier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tim-3+Expression+on+Tumor-Infiltrating+PD-1%2BCD8%2B+T+Cells+Correlates+with+Poor+Clinical+Outcome+in+Renal+Cell+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tim-3 Expression on Tumor-Infiltrating PD-1+CD8+ T Cells Correlates with Poor Clinical Outcome in Renal Cell Carcinoma.</a> Cancer Res. 77 (5), 1075-1082 (2017).</li>
<li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multispectral+Imaging+of+T+and+B+Cells+in+Murine+Spleen+and+Tumor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor.</a> J Immunol. 196 (9), 3943-3950 (2016).</li>
<li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multispectral+imaging+of+formalin-fixed+tissue+predicts+ability+to+generate+tumor-infiltrating+lymphocytes+from+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma.</a> J Immunother Cancer. 3, 47(2015).</li>
<li>Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+contexture+in+human+tumours%3A+impact+on+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome.</a> Nat Rev Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).</li>
<li>Nizard, M., Roussel, H., Tartour, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resident+Memory+T+Cells+as+Surrogate+Markers+of+the+Efficacy+of+Cancer+Vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Resident Memory T Cells as Surrogate Markers of the Efficacy of Cancer Vaccines.</a> Clin Cancer Res. 22 (3), 530-532 (2016).</li>
<li>Sandoval, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+imprinting+of+vaccine-induced+CD8%28%2B%29+T+cells+is+crucial+to+inhibit+the+growth+of+mucosal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Mucosal imprinting of vaccine-induced CD8(+) T cells is crucial to inhibit the growth of mucosal tumors.</a> Sci Transl Med. 5 (172), 172ra120(2013).</li>
<li>Carstens, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+computation+of+intratumoral+T+cells+correlates+with+survival+of+patients+with+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer.</a> Nat Commun. 8, 15095(2017).</li>
</ol>

모든 저자는 선언에 충돌의 관심 있다.

수정 및 문제 해결:
조직의 품질은 중요 한 매개 변수; 그것은 쉽게 되며 고 오신 채색에 의해 확인할 수 있습니다.
기술의 장점 중 하나는 다중화 된 stainings의 가능성 하지만 10 nm 최소의 델타 방출 파장을 선택 하는 것 권장 fluorophore 넘침을 방지 하려면. 여기, 우리가 4 stainings DAPI를 포함 하기 때문에, 우리는 하기로 파장 밖으로 확산 (DAPI: 460 nm, AF488: 519 nm, Cyanine 3: 570 nm, Cyanine 5: 670 nm). 자동된 이미지 분석을 함께 혼합된 방출 신호에서 fluorophore의 순수한 스펙트럼을 계산 하는 소프트웨어를 사용 하 여 다양 한 fluorophores에서 신호를 중복의 위험을 피 한다. 모노 스테인드 슬라이드는 또한 스펙트럼 라이브러리 덕분에 보상으로 fluorophores 행위 사이 오버랩의 부...

지난 몇 년 동안, immunotherapy RCC를 포함 하 여 암의 많은 종류에 대 한 매우 유망 치료로 등장 했습니다. 특히, immunotherapy 금지 검사점의 억제에 따라 PD 1 좋아하고 CTLA-4은 임상적으로 효과적인1,2,3,,45, 것으로 보고 되었습니다. 6. 단일 클론 항 체 CTLA-4에 대 한 PD-1, 또는 프로그램 죽음 Ligand 1 (PD-L1) 이미 여러 암에 승인 되 고 오래 견 딘 임상 응답 환자7의 20% 이상으로 이어질. 그럼에도 불구 하 고, 모든 환자는 초 동 조치, 치료의 비용은 높다, 되며 이러한 치료 독성, 잠재적인 심각한 면역 같은 부작용을 선도. 따라서, 현재 도전 예측 마커 그 새로운 immunotherapies 식별 것입니다. 종양, PD-L1, 표현 또는+ T 세포 침투 intratumoral CD8의 수준에서 돌연변이의 속도와 임상 응답 상관 관계를 보고 되었습니다. 그러나,이 협회는 아직도 너무 약 비 작은 세포 폐 암 (NSCLC) 환자8 에서에서 Pembrolizumab의 관리 전에 PD L1 동반자 테스트 제외 임상 연습에서 이러한 임상 생체의 사용을 권장 해 ,91011,12. 그것은 많은 금지 수용 체의 공동 식 같은 PD-1, 팀 3, 지연-3, 고 CTLA-4 유도 세포 소모 형 그리고 치료13,,1415저항 증명 되었습니다. 말 초 혈액 종양 microenvironment의 대표 이므로, 셀 제자리의 phenotypic 특징을 분석 하 고 관심입니다. PD-1 팀-3 공동 표현 T 세포 기능 장애가 여러 컨텍스트13,,1617셀 수 알려져 있습니다. 이 연구에서 두 금지 수용 체 PD 1의 공동 식과 CD8-3 팀의 전조 영향+ T 세포를 평가 했다.
종양 침투 림프 톨 (TILs)에 여러 마커의 공동 식 공부는 지금까지 최대 주로 신선한 종양 및 따라서 제외 회고전 분석에 작동 하는 데 필요한 만드는 흐름 cytometry 분석에 의해 수행 되었습니다. 기존의 현장에 얼룩, 한 번에 하나의 얼룩 수행할 수 있습니다와 공동 마커를 표현 하는 셀 형식의 특성은 불가능 하다. 예를 들어 PD L1 기존의 immunohistochemistry 분석 표현 PD L1 셀은 더 많은 상호 연구 관련 하 여 정의 하 고 어려운 종양 microenvironment의 많은 세포 유형으로 표현 됩니다. 이 작품에서는, 우리는 혁신적인 위치에 multiparametric 면역 형광 검사 방법을 개발 CD8 침투 종양에 의해 PD-1 팀-3의 공동 식 연결할 컴퓨터 계산+ T-세포 RCC에서 임상 결과. 이 기술은 여러 이점이 있다, 단일 셀 수준 및 여러 표식에 제한 된 간격을 캡처할 수 있는 multispectral 카메라를 사용 하 여 동시에 분석 하는 가능성을 포함 하 여 > 10 nm 액정을 통해 필터18. 또한, 절차는 자동 간 연산자 재현성 및 수동 기법19에 비해 단축된 분석 수 있습니다. 암 분야에서 여러 연구 보고에 메르켈 세포 암, 폐 암, 머리와 목 암20,,2122, 같은 PD-1, PD-L1, 및 CD8 면역 분자의 여러 stainings를 설득 23. 자동된 세포 수는 사용자 (형질 단계) 교육 가능 하다. 형광은 다른 세포 격실 (핵, 세포질, 막)에서 측정 됩니다.
여기, CD8 종양 침투의 다른 하위 집합+ T 세포 표현 PD-1 및 RCC의 대형 코 호트에서 팀-3 계산 했다 고 결과 임상 중력 점수 및 생존 매개 변수 연관 되었다. 그것은 또한 cytometry에 같은 의미 형광 강도 (MFI) 데이터는 셀룰러 해상도에서 막 형광 강도 분석 가능. 우리가 아는 첫 번째 연구 보고 전조 결과를이 multispectral 영상 기반된 수 기술을 사용 하 여 나타냅니다.

<table><tbody><tr><td>Vectra 3 자동 정량적 병리학 이미징&nbsp;</td><td>Perkin Elmer</td><td>CLS142338</td><td></td></tr><tr><td>inForm 세포 분석 2.1.</td><td>Perkin Elmer</td><td>CLS135781</td><td></td></tr><tr><td>R 소프트</td><td>https://www.r-project.org</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dakopen 구분 펜</td><td>Dako</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Tris Buffer Salin TBS 정제</td><td>Takara, Bio Inc.</td><td>TAKT9141Z</td><td>pH7.6 100</td></tr>정 <tr><td>트리스 버퍼 살린 트윈 20 TBS(+Tween20)</td><td>Takara, Bio Inc.</td><td></td><td>TAKT9142Z pH 7.6 100</td></tr>정 <tr><td>비오틴 차단 시스템</td><td>Dako</td><td>X0590</td><td>Avidin 0.1% 및 비오틴 0.01%</td></tr> <tr><td>일반 당나귀 혈청</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>017-000-001</td><td>5% vol./vol. 농도</td></tr><tr><td>Fluoroshield with DAPI</td><td>Sigma-aldrich</td><td>F6057</td><td>1.5 &micro; g/mL 농도</td></tr><tr><td>Knittel 유리 커버슬립</td><td>Knittel Gl&auml; ser,</td> <td>100039</td><td>24x60 mm 100 커버 슬립</td></tr><tr><td>토끼 안티 CD8 클론 P17-V</td><td>novus</td><td>NBP1-79055</td><td>4 &micro에서 사용; g/mL</td></tr><tr><td>마우스 anti-PD-1 Clone NAT</td><td>abcam</td><td>ab52587</td><td>2 &micro에서 사용; g/mL</td></tr><tr><td>염소 안티 Tim-3</td><td>R& D</td><td>AF2365</td>는 <td>3 &micro에서 사용합니다. g / mL</td></tr><tr><td>토끼 안티 PD-L1 클론 SP142</td><td>Roche</td><td>7309457001</td><td>1 &micro에서 사용; g/mL</td></tr><tr><td>마우스 AF647 표지 pan- Keratin Clone C11</td><td>Cell Signalling</td><td>4528</td><td>0.5 &micro에서 사용; g/mL</td></tr><tr><td>염소 안티 휴먼 gal9</td><td>R& D</td><td>AF2045</td>는 <td>0.3 & 마이크로에서 사용합니다. g/mL</td></tr><tr><td>시안 5 활용 당나귀 안티 토끼</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>711-175-152</td><td>5 &micro에서 사용; g/mL</td></tr><tr><td>비오틴화 F(ab' 2) 당나귀 안티 마우스 IgG</td><td>잭슨 Immunoresearch</td><td>715-066-150</td><td>3 &micro에서 사용; g/mL</td></tr><tr><td>Alexa Fluor488 활용 당나귀 안티 염소 IgG</td><td>abcam</td><td>ab150133</td><td>5 &micro에서 사용; g/mL</td></tr><tr><td>Cy3 표지된 streptavidin</td><td>Amersham</td><td>PA43001</td><td>3 &마이크로에서 사용; g/mL</td></tr><tr><td>음성 대조군 마우스 IgG1</td><td>Dako</td><td>X0931</td><td>2 &micro에서 사용; </td></tr><tr><td>염소 혈청</td><td>Sigma-aldrich</td><td>I5256</td>에서 추출한 g/mL IgG<td>는 3 &micro에서 사용합니다. </td></tr><tr><td>토끼 혈청</td><td>시그마 알드리치</td><td>I5006</td>에서 g/mL IgG는 <td>4&micro에 사용합니다; g/mL</td></tr></tbody></table>

면역 형광 분석 및 intratumoral+ pd-1 팀-3+ cd8의 정량화를 다중화+ t 세포

Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells

면역 세포 종양 microenvironment의 중요 한 구성 요소 이며 발암의 모든 단계에서 종양 성장과 진화에 영향. 특히, 그것 지금 잘 설립 인간의 종양에 면역 침투 예 후와 치료에 응답을 상호 연결할 수 있습니다. 종양 microenvironment에 면역 침투의 분석은 환자와 치료에 대 한 응답의 분류에 대 한 주요 도전 되고있다.
억제 수용 체 프로그램 세포 죽음 단백질 1 (PD1; 일컬어 CD279), 세포 독성 T 림프 구 관련 4 (CTLA-4) 단백질, T 세포 면역 글로불린 및 Mucin 포함 단백질-3 (팀 3, 일컬어 CD366), 림프 구 등의 공동 식 활성화 유전자 3 (지연-3, 일컬어 CD223), T 세포 소모의 특징 이다. 우리는 multiparametric 제자리에 면역 형광 식별 하 고 이러한 억제 수용 체의 공동 식 세포 수준에서 계량 얼룩을 개발 했다. 신장 세포 carcinomas (RCC)의 냉동된 조직의 회고전 시리즈, 이미지 분석 소프트웨어와 결합 된 형광 multispectral 이미징 기술을 사용 하 여, 종양 CD8 침투에 PD 1 팀 3의 공동 식 찾아냈다+ T 세포 RCC에서 가난한 예 후와 상관 된다. 하 우리의 지식,이 대표가 자동 멀티플렉스 현장 기술 시연 첫 번째 연구는 몇 가지 임상 관련성 있을 수 있습니다.

위에서 설명한 일반적인 프로토콜을 사용 하 여, 우리 intratumoral CD8 계량을 목적으로+ T 세포 금지 수용 체 PD-1, 팀-3와 상관 관계를 결과 임상 결과25RCC, 환자에서 냉동된 조직에 공동 표현.
CD8/PD-1/팀-3 얼룩의 최적화:
종 항 체 (마우스, 토끼, 염소, 재료의 표참조)의 다른 항 체 간의 교차 반응을 피하기 위하여 선택 되었다. 프로토콜은 편도 선, 인 조직된 림프 조직에 확인 했다. PD-1 얼룩에서 찾을 수 본 원 센터 (그림 1), 반면...

종양 microenvironment 공부 immunotherapy 임상 응답의 전조 또는 예측 생체를 식별할 수 있습니다. 여기에 제시, 혁신적인 방법을 기반으로 현장에서 형광 multispectral 이미징 분석 하 고 CD8의 자동으로 다양 한 부분 모집단을 계산+ T 세포. 이 재현 하 고 신뢰할 수 있는 기술은 대형 코 호트 분석에 적합 합니다.

면역 형광 분석 및 Intratumoral+ PD-1 팀-3+ CD8의 정량화를 다중화+ T 세포

Immune cells are important components of the tumor microenvironment and influence tumor growth and evolution at all stages of carcinogenesis. Notably, it ...

이 다중화 면역형광 분석의 전반적인 목표는 표현형을 기반으로 세포를 자동으로 계수하는 것입니다. 이 방법을 사용하면 다형광 및 자동 세포 계수를 통해 종양 미세환경 내에서 종양 면역 세포의 표현형과 기능을 분석할 수 있습니다. 이 기술은 종양 미세환경에서 직접 파생된 마커에 의해 예측할 수 있는 두 가지 유형의 복합 예후를 생성하는 데 도움이 되었습니다.일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 개인은 표현형 절차가 매우 길고 결과 원시 데이터에 추가 처리가 필요하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 이 방법에 대한 아이디어는 annhodge miranty 세포의 표현형과 면역학적 상호 작용을 특성화하려고 할 때 처음 떠올랐습니다. 해동 후 종이 타월을 사용하여 조직 섹션 주위의 슬라이드를 조심스럽게 말린 다음 소수성 장벽 펜으로 조직을 동그라미로 그립니다.장벽이 건조되면 샘플을 100% 아세톤으로 5분 동안 고정한 다음 2분 동안 공기 건조시킨 다음 TBS에서 10분 동안 슬라이드를 세척합니다. 어두운 곳에서 10분 동안 0.1% Avidin을 3방울 떨어뜨려 슬라이드를 전처리한 다음 슬라이드를 두드리거나 튕겨 Avidin 용액으로 조직을 덮습니다. 각 샘플에 01%비오틴 3방울을 추가한 다음 샘플에 비오틴을 두드리거나 튕긴 다음 방금 시연한 대로 TBS 세척을 수행합니다.그런 다음 실온에서 30분 동안 TBS에 100마이크로리터의 5% 정상 혈청으로 비특이적 결합을 차단합니다. 배양이 끝나면 슬라이드를 탭하여 여분의 혈청을 제거하고 가습실에서 1시간 동안 100마이크로리터의 주요 관심 항체 칵테일에 슬라이드를 배양합니다. TBST에서 슬라이드라고 표시된 항체를 5분 동안 세척합니다.건조 후, 가습된 챔버에서 30분 동안 100마이크로리터의 관심 2차 항체 칵테일로 세포에 라벨을 부착한 다음 TBS에서 10분 동안 세척합니다.건조된 2차 항체 표지된 슬라이드를 관심 3차 항체 칵테일 100마이크로리터로 30분 동안 배양한 후 10분 동안 TBS 세척을 수행합니다. 세탁이 끝나면 슬라이드를 건조시키고 dapi가 보충된 장착 매체로 조직을 장착합니다.그런 다음 커버 슬립으로 각 슬라이드를 클로버링하고 장착 매체를 최소 2시간 동안 고정합니다. 슬라이드를 스캔하려면 현미경 소프트웨어를 열고 이미지 스캐닝 프로토콜을 로드합니다. 첫 번째 슬라이드를 현미경 스테이지에 로드합니다.그런 다음 제어 표시줄에서 노출 설정을 클릭하

multiplexed-immunofluorescence-analysis-quantification-intratumoral

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 동영상은 종양 조직에 침투하는 T 세포의 다양한 하위 집단을 분석하기 위한 현장 형광 다중 스펙트럼 이미징 기술을 보여줍니다. 신세포암 조직 동결절제술은 특이적 억제 수용체를 발현하고 면역요법 내성 표현형을 나타내는 CD8+ T 세포를 표지하는 항체로 처리됩니다. 표지된 섹션은 뚜렷한 CD8+ T 세포 하위 집단을 식별하기 위해 다중 스펙트럼 현미경을 사용하여 시각화됩니다.

면역요법 내성 T 세포 하위 집단을 분석하기 위한 다중방향 면역형광 이미징

자세한 프로토콜 6-마커 멀티플렉스 면역 형광 패널 최적화 수행 위한 더 일관 된 결과를 짧은 절차 시간 자동된 염색기를 사용. 이 방법은 종양 면역 연구에 대 한 모든 실험실에 의해 직접 적응 될 수 있다.

포 르 말린 고정 암 조직 표본에 면역-종양학 연구를 위한 자동화 된 다중 면역 형광 패널

순환 종양 세포의 특성 (CTC)는 번역 연구에서 인기있는 주제입니다. 이 프로토콜은 비소세포 폐암(NSCLC) 환자 샘플에서 CTC의 PD-L1 특성화 및 열거에 대한 반자동 면역형광(IF) 분석방법을 기술한다.

면역형광에 의한 비소세포 폐암 환자의 순환 종양 세포의 반자동 PD-L1 특성화 및 열거

여기에서는, 우리는 포르말린 고정된 파라핀 내장된 종양 조직 단면도에 있는 면역 세포를 구상하고, 정량화하고, 매핑하기 위한 간단하고 접근가능한 전략을 기술합니다. 이 방법론은 기존의 이미징 및 디지털 분석 기법과 이미징 분석의 다중 분석 기능 및 다중 매개 변수 분석을 확장하는 목적으로 결합합니다.

종양 미세 환경에서 면역 세포 집단의 시각화, 정량화 및 매핑

다중화 바코드 이미지 분석은 최근 종양 미세 환경의 특성을 개선하여 세포 구성, 기능 상태 및 세포-세포 상호 작용에 대한 포괄적인 연구를 가능하게 했습니다. 본 명세서에서는 올리고뉴클레오티드 접합 항체의 바코딩을 사용하는 염색 및 이미징 프로토콜과 고차원 이미지 분석 기술을 사용할 수 있는 사이클 이미징을 설명합니다.

파라핀 조직 샘플의 단일 세포 분석에서 면역 프로파일링 및 공간 매핑 특성 분석을 위한 멀티플렉스 바코드 이미지 분석

이 기사에서는 이미지 분석 및 공간 분석과 결합된 수동 티라마이드 신호 증폭(TSA) 다중 면역형광(mIF)을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 실험실에서 사용할 수 있는 슬라이드 스캐너에 따라 슬라이드당 2-6개의 항원을 염색하기 위해 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 섹션과 함께 사용할 수 있습니다.

종양 미세 환경의 임상 및 생물학적 평가를 위한 공간 이미지 분석과 결합된 Multiplex Immunofluorescence

이 프로토콜은 다중 면역조직화학을 사용하여 종양 미세환경의 면역 세포 특성 분석을 수행하는 방법을 자세히 설명합니다.

종양 미세환경의 공간 면역 세포 풍경에 대한 다중 면역조직화학적 분석

이 실험 프로토콜은 주로 단일 채널 항체 배양 조건을 최적화하고 항체 및 채널의 설정을 조정하여 임상 기원 폐암 조직의 자가형광 및 채널 누화 문제를 해결함으로써 다중 면역조직화학(IHC) 염색 방법을 설명하고 최적화합니다.

파라핀 포매된 폐암 조직을 위한 다중 면역조직화학 염색

다중 순환 면역조직화학은 반복적인 항원-항체 배양, 이미지 스캐닝, 이미지 정렬 및 통합을 사용하여 여러 마커를 동시에 현장에서 검출할 수 있습니다. 여기에서는 폐암과 쌍을 이루는 뇌 전이 샘플에서 이 기술로 면역 세포 기질을 식별하기 위한 운영 프로토콜을 제시합니다.

Multiplex Cyclic Fluorescent Immunohistochemistry(다중 순환 형광 면역조직화학)

이 보고서는 자동 슬라이드 염색기에서 다중 면역형광(mIF) 분석을 위한 자동 프로토콜에 대해 설명합니다. 이는 표준 고처리량 조직 자동염색기 및 전체 슬라이드 형광 이미저에서 공간 단백질체학의 높은 재현성을 보여주며, 이는 중개 연구에서 많은 수의 조직 슬라이드에 걸친 맞춤형 mIF 분석에 이상적입니다.

중개 연구를 위한 High-Throughput Automated Multiplex Immunofluorescence Assay

이 프로토콜은 쥐 FFPE 흑색종 조직의 DNA 바코드 기반 이미징을 위한 다중 면역형광 항체 패널을 설계하기 위한 단계별 가이드를 제공합니다. 또한 쥐 흑색종 종양 면역 미세환경에 대한 공간 단백질체학 통찰력을 생성하기 위해 오픈 소스 도구를 사용하는 이미지 분석 파이프라인에 대해 설명합니다.

유전적으로 재프로그래밍된 쥐 흑색종의 FFPE 검체를 분석하기 위한 DNA 바코드 기반 다중 면역형광 이미징

배우세요 다중 면역형광 분석을 통해 종양 미세환경에서 CD8+ T 세포 표현형을 자동 계수하는 방법을. 이 기술은 면역치료 반응 예측 바이오마커를 식별하여 대규모 암 연구에 활용됩니다.

면역 형광 분석 및 Intratumoral⁺ PD-1 팀-3⁺ CD8의 정량화를 다중화⁺ T 세포

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