면역 형광 분석 및 Intratumoral+ PD-1 팀-3+ CD8의 정량화를 다중화+ T 세포

이 다중화 면역형광 분석의 전반적인 목표는 표현형을 기반으로 세포를 자동으로 계수하는 것입니다. 이 방법을 사용하면 다형광 및 자동 세포 계수를 통해 종양 미세환경 내에서 종양 면역 세포의 표현형과 기능을 분석할 수 있습니다. 이 기술은 종양 미세환경에서 직접 파생된 마커에 의해 예측할 수 있는 두 가지 유형의 복합 예후를 생성하는 데 도움이 되었습니다.

일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 개인은 표현형 절차가 매우 길고 결과 원시 데이터에 추가 처리가 필요하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 이 방법에 대한 아이디어는 annhodge miranty 세포의 표현형과 면역학적 상호 작용을 특성화하려고 할 때 처음 떠올랐습니다. 해동 후 종이 타월을 사용하여 조직 섹션 주위의 슬라이드를 조심스럽게 말린 다음 소수성 장벽 펜으로 조직을 동그라미로 그립니다.

장벽이 건조되면 샘플을 100% 아세톤으로 5분 동안 고정한 다음 2분 동안 공기 건조시킨 다음 TBS에서 10분 동안 슬라이드를 세척합니다. 어두운 곳에서 10분 동안 0.1% Avidin을 3방울 떨어뜨려 슬라이드를 전처리한 다음 슬라이드를 두드리거나 튕겨 Avidin 용액으로 조직을 덮습니다. 각 샘플에 01%비오틴 3방울을 추가한 다음 샘플에 비오틴을 두드리거나 튕긴 다음 방금 시연한 대로 TBS 세척을 수행합니다.

그런 다음 실온에서 30분 동안 TBS에 100마이크로리터의 5% 정상 혈청으로 비특이적 결합을 차단합니다. 배양이 끝나면 슬라이드를 탭하여 여분의 혈청을 제거하고 가습실에서 1시간 동안 100마이크로리터의 주요 관심 항체 칵테일에 슬라이드를 배양합니다. TBST에서 슬라이드라고 표시된 항체를 5분 동안 세척합니다.

건조 후, 가습된 챔버에서 30분 동안 100마이크로리터의 관심 2차 항체 칵테일로 세포에 라벨을 부착한 다음 TBS에서 10분 동안 세척합니다.건조된 2차 항체 표지된 슬라이드를 관심 3차 항체 칵테일 100마이크로리터로 30분 동안 배양한 후 10분 동안 TBS 세척을 수행합니다. 세탁이 끝나면 슬라이드를 건조시키고 dapi가 보충된 장착 매체로 조직을 장착합니다.

그런 다음 커버 슬립으로 각 슬라이드를 클로버링하고 장착 매체를 최소 2시간 동안 고정합니다. 슬라이드를 스캔하려면 현미경 소프트웨어를 열고 이미지 스캐닝 프로토콜을 로드합니다. 첫 번째 슬라이드를 현미경 스테이지에 로드합니다.

그런 다음 제어 표시줄에서 노출 설정을 클릭하고 충분하지만 포화되지 않은 신호를 얻을 때까지 각 필터의 노출 시간을 조정합니다. 상단 패널에서 시작을 클릭하고 LabID 폴더를 엽니다. 첫 번째 슬라이드의 ID를 입력하고 다음을 클릭합니다.

4배 배율에서 명시야 조명 아래에서 슬라이드의 개요를 얻으려면 흑백 이미징을 클릭하고 표본을 찾으십시오. 스캔할 조직을 선택하려면 control 키를 누르고 커서를 사용하여 4배 배율로 스캔할 관심 영역을 선택하거나 선택 취소합니다. 각 영역의 형광 빨간색/파란색/녹색 이미지를 얻으려면 저전력 imagine을 클릭하십시오.

고출력 자기장 선택의 경우, control 키를 누르고 20배 배율로 스캔할 조직의 영역에 해당하는 최소 5개의 관심 영역을 선택합니다. 그런 다음 각 필드의 다중 스펙트럼 이미지 획득을 얻으려면 High Power Imagine을 클릭하고 Data Storage를 클릭하여 이미지를 적절한 lab ID 폴더에 저장합니다. 파일 메뉴에서 새 프로젝트를 만들려면 새 프로젝트를 선택하고, 기능 찾기 메뉴에서 셀 세분화를 선택하고, 페노 타이핑 메뉴에서 페노 타이핑을 선택한 다음 구성을 클릭합니다.

이미지 형식에서 다중 스펙트럼을 선택합니다. Sample Format(샘플 형식)에서 Fluorescence(형광)를 선택합니다. 대표 이미지를 프로젝트에 통합하려면 파일 메뉴에서 이미지 열기를 클릭하고 전체 시리즈의 대표 이미지 10-30개를 선택합니다.

자동 형광을 제거하려면 염색되지 않은 슬라이드를 열고 라이브러리 소스와 적절한 형광단을 선택합니다. auto florescence를 클릭하고 빈 슬라이드에서 auto florescence 영역을 선택합니다. 합성 이미지를 생성하려면 Prepare all을 선택하여 형광 라이브러리와 자동 형광 스펙트럼을 통합합니다.

눈 아이콘을 클릭하여 뷰 편집기 패널을 열고 autoflourescence를 선택 취소하여 autoflourescence 신호를 자릅니다. 각 마커에 적합한 색상을 선택합니다. 세포를 분할하려면 compartment 메뉴에서 nuclei and membrane을 선택합니다.

핵 메뉴에서 DAPI를 핵 계수기 염색으로 설정합니다. 세그먼트 세포를 클릭하고 세포막에서 핵의 분할을 확인합니다. 세포를 표현형으로 분류하려면 phenotype 메뉴에서 add를 클릭합니다.

세포 표현형 범주를 만들려면 형광체와 형광체 조합에 대한 대표를 5개 이상 선택하고 train classifier를 클릭합니다. 분류기는 신뢰 구간을 사용하여 각 셀에 대한 표현형을 속성하는 알고리즘을 만들고 있습니다. 확대/축소하여 세포의 표현형을 확인합니다.

그런 다음 phenotype all을 클릭하여 표현형 알고리즘과 이미지 프로젝트를 저장하고 파일 메뉴에서 프로젝트 저장을 선택합니다. 그런 다음 프로젝트 이름을 지정하고 저장합니다. 계열의 배치 분석을 수행하려면 수조 분석을 선택하고 저장된 프로젝트를 선택합니다.

일괄 처리된 데이터를 저장할 폴더를 선택합니다. 분석할 이미지를 추가한 다음 실행을 클릭합니다. 분석이 끝나면 합성 이미지의 품질을 확인하고 시리즈 내 모든 이미지의 페노 유형을 확인합니다.

형광 다중 스펙트럼 영상에 의한 투명한 신세포 암종 검체에서 CD8 양성 T 세포에 침투하는 종양을 분석한 결과, CD8 양성 T 세포의 약 절반은 PD-1에 대해 단일 양성이고 약 1/3은 PD-1 및 Tim-3에 대해 이중 양성인 것으로 나타났습니다. 이러한 다양한 세포 신호를 조직 단면에 통합한 후, PD-1 양성 Tim-3 양성 대 PD-1 양성, Tim-3 음성 CD8 양성 T 세포에 대한 PD-1 형광 강도를 측정한 결과, Tim-3이 공동 발현될 때 PD-1 MFI가 더 높다는 것이 밝혀져 Tim-3 발현의 기능적 관련성이 강화됩니다. 이 대표적인 실험에서 신장 종양 환자의 66%는 PD-1 리간드 발현에 대해서도 양성이었고 100%는 Tim-3 리간드 갈락틴-9에 대해서도 양성이었습니다.

신세포암 환자의 종양 조직에 대한 임상적 점수는 PD-1 및 Tim-3을 발현하는 CD-8 양성 T세포에 침투하는 종양의 수와 비율과 예후 점수 매개변수(prognostic scoring parameter) 사이에 긍정적인 상관관계를 보여주었지만, PD-1 양성 CD-8은 Tim-3을 발현하지 않는 것 사이에 긍정적인 상관관계가 있음을 보여주었다. 흥미롭게도, PD1과 Tim 3이 함께 발현되는 CD-8 양성 T세포 발현이 중앙값 비율보다 높은 신세포암 환자는 재발 가능성이 더 높은 반면, Tim-3 co-expression 없는 PD-1의 발현은 환자의 재발과 상관관계가 없는 것으로 밝혀졌습니다. 이 절차를 시도했지만 가능하면 병리학자를 포함하여 두 명의 별도 조사관과 함께 세포의 표현형을 검토하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 x-vivo 자극 후 자가 표현형의 기능적 영향에 대한 추가 질문에 답하기 위해 세포 분석과 같은 다른 사항을 수행할 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 암 분야의 연구자들이 영향을 받은 장기의 면역 반응을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.