Name: 헬리 우스 진 건을 사용하여 양파 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용에 대한 Bimolecular 형광 Complementation (BiFC) 어세이 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-12T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: 배우세요 양파 세포에서 BiFC 기법을 활용한 단백질-단백질 상호작용 분석 방법을 Helios Gene Gun으로 유전자 전달하여 형광 현미경으로 상호작용을 검증하는 실험 기술입니다.

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우리는 DRS 감사합니다. 35S에 대한 스티브 마운트 및 Xiaoning 장 : GFP pGlowbug 구조 Z. L&#39;의 실험실에서 CH 연구에 Hokensen 박사 원정대는 미국 국립 과학 재단 (IOB0616096 및 MCB0744752)에 의해 지원됩니다. ZL는 부분적으로 메릴랜드 농업 실험 역 대학에 의해 지원됩니다.

I. 플라스미드 준비 폭격에 사용되는 플라스미드 DNA는 고순도 및 500ng/μl 이상의 농도에 있어야합니다. BiFC 두 플라스미드 구조를 포함한 각 플라스미드 25 μg이 필요합니다. 즉, 두 plasmids의 1시 1분 어금니 비율은 카트리지의 준비 50 μg 총 플라스미드 DNA을 일으키다로 혼합한다. 50 μg 이상의 DNA를 추가하면 황금 입자의 응집을 일으킬 수 있으며 피해야한다고 염두 수 있습니다. 상용 플라스미드 DNA 추출 키트 플라스미드 DNAs를 분리 권장됩니다. 플라스미드 벡터는 pUC19와 같은 크기가 비교적 작은되어야합니다. 우리는 겁쟁이와 LUH 각각 3 pUC19 - SPYNE와 pUC19 - SPYCE로 cDNA를 복제. Agrobacterium - 중재 변환에 대한 바이너리 벡터가 너무 큽니다과 폭격에 대한 부적 절한 있습니다. II. 카트리지 준비 카트리지 준비는 플라스미드 DNA와 이후 유전자 총 카트리지 홀더에 로드할 수 있습니다 이분의 일 인치 긴 조각으로 절단 플라스틱 튜브로 그들을 로딩과 코팅 골드 입자를 포함한다. 카트리지 준비는 별도의 조브 기사 4 훌륭한 세부 사항에서 설명하기 때문에 여기서 설명하지 않습니다. 양파 세포의 충격을 위해, 우리는 1 μg DNA/0.25 MG 골드 / 카트리지 50 카트리지에 대해 최대 산출 준비 당 금 입자의 12.5 MG와 플라스미드 DNA 50 μg을 혼합하는 것이 좋습니다. 각 카트리지는 한 번에입니다. 금 입자는 0.6 μm의 또는 직경 1.0 μm의 (; Biorad 고양이 # 1652262 또는 고양이 # 1652263) 중 하나가 될 수 있습니다. 우리는 또한 카트리지 준비 0.5 MG / ML PVP 솔루션을 사용하는 것이 좋습니다. BiFC 들어, 동일한 카트리지 준비의 각 putative 상호 작용하는 파트너의 두 플라스미드 DNAs를 결합. 카트리지 준비 후 페트리 접시 감싸있는 사각형 Parafilm에 150-200 PSI 사이의 헬륨 압력에서 새로 만들어진 카트리지를 발사하여 카트리지를 테스트하는 것이 중요합니다. 황금 입자가 카트리지에서 효율적으로 추진 될 수있다면 이것은 테스트 않으므로 Parafilm에 희미한 금 입자를 볼 수 있습니다. 이것은 각 방 표지 것이라는 지역의 아이디어를 제공합니다. 당신은 다른 헬륨 압력 (PSI 150-200 범위에서)에서 Parafilm에 추진 황금 입자의 서로 다른 양의있을 수 있습니다. 더 큰 차이가 없다면, 폭격에 대한 낮은 압력을 선택합니다. III. 준비 양파 조직 촬영 당일, 대형 노란 양파의 표피에서 껍질. 깨끗하고 날카로운 면도날을 사용하여 깊이 약 2 X 8cm의 사각형 영역을 4-5 레이어를 잘라. , 직사각형 양파 조직을 꺼내서 바깥 두 레이어를 삭제, 2X1.5 약 cm의 조각으로 양파의 나머지 레이어를 잘라. 여과지 (왓먼 3MM 종이가 빙빙로 상처)이있는 페트리 접시에 양파 조각을 장소 멸균 물 moistened. 페트리 접시를 커버하고 그들은 갈 준비가 된 것입니다. IV. 충격 <ol><li> 흰색 라운드 카트리지 홀더에 카트리지를로드합니다. 다른 플라스미드 구조를 포함하는 카트리지는 다른 카트리지 홀더에로드해야합니다. 각 카트리지 홀더 12 장면 12 카트리지까지 저장할 수 있습니다. </li><li> 헬리 우스 진 건에 배터리와 신선한 배럴 라이너를 삽입합니다. 총신 라이너와 총을 모두 붙어 O - 링 각을 가지고 있는지 확인합니다. </li><li> 첫째, 총 상단 직면하고있는 카트리지 홀더에 마르크 # 12, 유전자 총에 빈 카트리지 홀더를 삽입합니다. 사전 카트리지 홀더가 한 두번이 올바르게 삽입되었는지 확인합니다. </li><li> 헬륨 탱크에 총을를 첨부 150-200 PSI 사이의 압력을 조정합니다. </li><li> 총 상공 회의소를 청소하고 압력이 안정되어 있는지 확인하기 위해 빈 카트리지 홀더와 귀 보호 및 화재 총 몇 번 착용하십시오. </li><li> 빈 카트리지 홀더를 제거하고 로드된 카트리지 홀더를 삽입합니다. 해고하고자하는 카트리지는 카트리지 홀더의 (시, 6) 하단에 위치되도록 카트리지 홀더 사전. 여기에 양파 조각을 촬영하면 배경 형광에 대한 부정적인 통제의 형태를 제공합니다. </li><li> 최대 직면하고있는 양파의 내부 대부분의 레이어와 빈 페트리 접시의 중앙에 양파 조각을 놓으십시오. 페트리 접시에서 유전자 총을의 배럴의 라이너를 휴식과 방아쇠 당기는 동안 사이드 버튼을 누른하여 총을 발사. 촉촉한 3MM 여과지를 포함하는 페트리 접시에 포격 양파를 전송합니다. </li><li> 다음 카트리지에 미리와 다른 양파 조각을 해고. 양파의 4-5 조각이 총에 때까지이 단계를 반복합니다. 각 양파 조각이 총을 한 방입니다. </li><li> 다른 플라스미드 또는 다른 플라스미드 조합을 포함하는 카트리지와 함께 로드된 다른 카트리지 홀더로 변경합니다. 배럴 라이너를 변경하는 것을 잊지S는 잘 오염을 방지하기 위해. 4-5 양파 조각을 쏴. </li><li> 충격 후, perti 요리에 대한 모든 양파를 반환합니다. 뚜껑있는 페트리 접시를 커버. 건조 방지하기 Parafilm으로 그들을 바꿈. 16~48시간 동안 짙은 어둠 속에서 실온에서 양파 조각을 품어. </li><li> 헬륨 탱크에서 유전자 총을 분리하기 전에 가스 릴리스 압력을 해제합니다. 돌려서 배럴 라이너, 그리고 카트리지 홀더 및 (또는 미사용) 사용 카트리지를 제거합니다. </li><li> 비눗물로 비커에서 그들을 잠수함이 잠수하여 카트리지 홀더 및 배럴 라이너 청소. 목욕 sonicator에 비커를 놓고 20 분 동안 sonicate. 그 후, 모든 비누 잔류물을 제거하기 위해 물로 그들을 씻어. 시간 동안 70 % 에탄올에서 그들을 만끽하고 종이 타올에 올려 건조. </li></ol> V. 관측 <ol><li> 상온에서 16-20시간에 대한 폭격 양파 조각을 잠복기 후에, 우리는이 연구에 사용되는 등 자이스 혈구 Axio Observer.z1로 형광 현미경을 사용하여 GFP 또는 YFP 형광을 관찰할 수 있습니다. </li><li> 천천히하는 양파의 내부 표피 (직접 폭격하는 동안 총을 얼굴 레이어)에서 단세포 층 평면 껍질 끝을와 집게를 사용하십시오. 슬라이드에 물 한 방울로 껍질을 놓으십시오. coverslip을 추가하지만 거품을 최소화하기 위해주의하십시오. </li><li> 현미경의 밝은 분야에서 먼저 세포가 살아 있도록 세포질 스트리밍을위한 확인하십시오. 이렇게하려면, 이동 plastids 찾는 다음 양파 조직을 따뜻하게하는 데 몇 분 동안 명시야 조명에 슬라이드를 노출합니다. 세포질 스트리밍보고 항상 쉽지 않다, 그래서 당신은 아무것도 볼 수 없다면 낙담하지 마세요. </li><li> 형광 검출을위한 적절한 여기와 GFP 또는 YFP에 대한 검색 필터를 사용합니다. 이러한 아닌 형광 플라스미드로 촬영 양파 조각과 같은 부정적인 컨트롤을 포함하는 것이 중요합니다. 희미한 노란색 신호 부상 전지, 공기 방울, 또는 파편으로부터 나타날 수 있습니다. 긍정적인 컨트롤을 포함하는 것도 중요합니다. 같은 35S 같은 플라스미드가 포함된 constitutively 표현 형광 기자 : GFP는 훌륭한 긍정적인 컨트롤입니다. 양파 표피 세포 (그림 1A, D)에서 볼 수 GFP 신호는 카트리지, 양파 조직 및 유전자 총기 발사가 제대로 준비하고 실행하는 지적했다. : 겁쟁이 - pSPYNE 및 35S : : : LUH - pSPYCE의 DNAs 이후, 우리는 35S의 혼합물을 포함하는 카트리지 공세 양파 조각에 겁쟁이 - pSPYNE 및 LUH - pSPYCE 사이의 상호 작용을 관찰했다. 희미한 YFP의 형광이 핵에 함께 분할 YFP의 조각을 가져 겁쟁이와 LUH 사이의 직접적인 물리적 상호 작용을 나타냅니다 (그림 1 B, E) 만 핵에서 관찰되었다. : GFP : BiFC에서 YFP 신호가 35S에서 GFP 신호보다 훨씬 약한입니다. </li></ol> 대표 결과 우리의 연구에서, 여기 35S보고 : 플라스미드 GFP 긍정적인 컨트롤에서 핵 및 세포질 (그림 1A, D)을 모두 포함한 전체 세포를 채우고 강한 형광을 제공합니다. GFP 단백질은 핵 지방화 신호없이 핵에 확산 정도로 작습니다. 대조적으로, 겁쟁이와 LUH 이전 두 하이브리드 분석 2 누룩에 상호 작용하는 그림이 Arabidopsis transcriptional 요인입니다. 겁쟁이 - pSPYNE (겁쟁이가 YFP의 N - 터미널 파편 융합)와 LUH - pSPYCE (겁쟁이가 YFP의 N - 터미널 파편 융합), 핵에 확산 핵 지방화 신호에게 2,5를 포함 모두 너무 큽니다. 양파 세포 핵 (그림 1 B, E)에서 검색된 YFP 형광 신호는 겁쟁이 - pSPYNE 및 LUH - pSPYCE은 양파의 핵으로 상호 작용할 수 있음을 나타냅니다. 아무 형광 신호가 YFP 및 LUH - pSPYCE (그림 1C, F)의 N - 터미널 조각을 포함하는 플라스미드 벡터 pSPYNE의 플라스미드 혼합 공세 양파를 감지하지 않습니다. BiFC - 중재 YFP의 형광은 35S에서 GFP - 중재 형광보다 훨씬 약한입니다 : : GFP 플라스미드. 우리의 연구에서, 그들은 또한 (B와 그림 1A 비교) 다양한 subcellular 지방화을 보여주었다. 두 파트너 pl​​asmids이 성공적으로 입력하고 같은 양파 세포에서 표현하는 경우 BiFC에만 작동하기 때문에 또한, 형광 세포의 숫자는 BiFC에 대해 상당히 낮습니다. <img src="/files/ftp_upload/1963/1963fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 형광등 (A, B, C)과 명시야 (D, E, F) 양파 세포의 이미지는 다른 플라스미드 구조 공세. (A)와 (D), 양파 세포는 35S 공세 : : GFP. GFP는 세포질과 핵 밖으로 diffuses. (B)와 (E), 양파 세포는 35S 동등한 어금니 믹스 공세 : 겁쟁이 - pSPYNE (겁쟁이가 YFP의 N - 터미널 파편 융합)와 35S : LUH - pSPYCE (LUH는 C - 말단 조각을 융합 ) 플라스미드 DNA. 겁쟁이 - pSPYNE 및 LUH - pSPYCE 간의 상호 작용은 형광등 핵으로 표시됩니다. (C)와 (F), 양파 세포를 보여주는 부정적인 제어 벡터 pUC19 - SPYNE 및 LUH - pSPYCE plasmi의 믹스 공세DS. 아무 형광 신호가 감지되지 않습니다.

<ol><li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol Cell. 9 (4), 789-789 (2002).</li>
<li>Sitaraman, J., Bui, M., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LEUNIG_HOMOLOG+and+LEUNIG+perform+partially+redundant+functions+during+Arabidopsis+embryo+and+floral+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">LEUNIG_HOMOLOG and LEUNIG perform partially redundant functions during Arabidopsis embryo and floral development.</a> Plant Physiol. 147 (2), 672-672 (2008).</li>
<li>Walter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+protein+interactions+in+living+plant+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant J. 40 (3), 428-428 (2004).</li>
<li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Azhakanandam, S., Nole-Wilson, S., Bao, F., Franks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SEUSS+and+AINTEGUMENTA+mediate+patterning+and+ovule+initiation+during+gynoecium+medial+domain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">SEUSS and AINTEGUMENTA mediate patterning and ovule initiation during gynoecium medial domain development.</a> Plant Physiol. 146 (3), 1165-1165 (2008).</li>
<li>Zhang, X. N., Mount, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+alternatively+spliced+isoforms+of+the+Arabidopsis+SR45+protein+have+distinct+roles+during+normal+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Two alternatively spliced isoforms of the Arabidopsis SR45 protein have distinct roles during normal plant development.</a> Plant Physiol. 150 (3), 1450-1450 (2009).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

<ol><li> : GFP 또는 35S : : : 거스 처음 사용자를 위해, 우리는 35S와 같은 하나의 플라스미드 제정 기자와 카트리지 준비에서 관찰하는 전체 절차를 연습하는 것이 좋습니다. 우리는 35S 사용 : 플라스미드 GFP는 DRS 얻은. 스티브 마운트 및 Xiaoning 장 6 (그림 1A, D). RioRad (CAT 165-2244)에서 판매하고 유전자 촬영 제어 카트리지 공장에 적합하지 않습니다. </li><li> BiFC 들어, 두 번째 긍정적인 제어가 각각 YFP의 C - 터미널과 N - 터미널 조각 융합이 알려진 상호 작용하는 파트너로 구성해야하는, 필요합니다. </li><li> BiFC 들어, 몇 가지 부정적인 컨트롤을 포함하는 것이 필요합니다 : (1) 단백질의 X는 YFP의 N - 터미널 조각 플러스 C - 말단 조각에 대한 코딩 벡터로 융합, (2) 단백질 Y가의 C - 말단 조각을 융합 YFP 플러스 N - 말단 조각에 대한 코딩 벡터는, 전용 (3) 벡터. </li><li> 조직 손상을 줄이기 위해 제공하는 기회를 발...

<table><tbody><tr><td>황양파</td><td>모든 공급업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Helios Gene Gun</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP 또는 YFP용 적절한 필터가 장착된 형광 현미경</td><td>Zeiss, Nikon, Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

헬리 우스 진 건을 사용하여 양파 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용에 대한 bimolecular 형광 complementation (bifc) 어세이

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

다양한 생물의 유전자 기능을 조사 유전자 제품들이 정상 세포 환경에서 서로 상호 작용하는 방법에 대한 지식에 의존하고 있습니다. Bimolecular 형광 Complementation (BiFC) 어세이<sup&gt; 1</sup&gt; 연구자들이 살아있는 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 시각화 수 있도록하고 필수적인 연구 도구가되었습니다. 이 분석은 각 잠재적인 상호 작용하는 단백질 파트너 융합하는 형광 단백질 (GFP)의 두 조각의 촉진 협회를 기반으로합니다. 두 단백질 파트너의 상호 작용 형광로 이어지는, N - 터미널과 GFP의 C - 말단 조각의 연결을 용이하게합니다. 식물 연구원, 양파 표피 세포 때문에 양파 조직을 얻는 방법과 준비의 용이성과 최소한의 배경 형광과 형광의 직접적인 시각화의 BiFC 분석을 실시를위한 이상적인 실험 시스템입니다. 헬리 우스 진 건 (BioRad)은 일반적으로 양파 세포에 플라스미드 DNA를 bombarding에 사용됩니다. 우리의 사용 두 개의 상호 작용에 대한 플라스미드 구조를 소개 진 건 헬리 우스 입증<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; 전사 요소 수스 (겁쟁이)와 LEUNIG의 상동체 (LUH)<sup&gt; 2</sup&gt;와 양파 표피 세포에 의해 매개 BiFC들의 상호 작용의 시각화.

이 문서는 제대로 BioRad는 양파 표피 세포에 플라스미드 DNA을 소개하는 진 건 헬리 우스 및 Bimolecular 형광 Complementation의 원칙 (BiFC)를 기반으로 양파 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용에 대한 테스트를 사용하는 방법을 보여줍니다

헬리 우스 진 건을 사용하여 양파 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용에 대한 Bimolecular 형광 Complementation (BiFC) 어세이

다양한 생물체 내 유전자 기능 연구는 유전자 산물이 정상적인 세포 내에서 서로 어떻게 상호작용하는지에 대한 지식에 의존합니다...

이 절차는 두 가지 Arabidopsis 전사 조절인자인 SEU 및 LUH 사이의 생체 내(in vivo) 단백질-단백질 상호작용을 테스트합니다. 생분자 형광 보완법(biomolecular fluorescence complementation)을 활용하여, SEU는 황색 형광 단백질(YFP)의 N-말단 단편에 융합시키고, LUH는 YFP의 C-말단 단편에 융합시키기 위해 두 가지 플라스미드 컨스트럭트의 DNA를 사용합니다. 상호작용 여부를 테스트하기 위해 SEU-NYFP 및 LUH-CYFP를 양파 표피 세포에 bombardment 방식으로 도입합니다.Seuss와 LUH 사이의 상호작용은 핵 내에서 YFP의 말단 단편과 C-말단 단편의 결합을 유도하여 핵 내 YFP 형광을 발생시킵니다. 암실에서 16~20시간 동안 배양한 후, 양파 표피 박편을 형광 현미경으로 관찰하여 형광을 시각화합니다. 안녕하세요, 메릴랜드 대학교 세포생물학 및 분자유전학과의 Zhi Lu 교수님 연구실 소속 Courtney Hollander입니다.오늘은 BioRad Helios 유전자 총(gene gun)을 사용하여 양파 세포 내의 단백질-단백질 상호작용을 테스트하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 식물 세포 내의 단백질-단백질 상호작용 및 단백질 위치를 테스트하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.이 절차를 시작하려면, 각 카트리지 준비 과정을 상세히 보여주는 Woods와 Zeto(2008)의 JoVE 프로토콜에 따라 Helios 유전자 총(gene gun)용 카트리지를 준비하십시오. BIFC를 위해 50 µg의 총 플라스미드 DNA를 12.5 mg의 금 입자 및 0.5 mg/mL의 PVP 용액과 혼합합니다. 동일한 카트리지 준비 방식으로, YFP의 N-말단 절반에 융합된 추정 상호작용 단백질 Seuss(약어: seus-NYFP)와 YFP의 C-말단 절반에 융합된 LU Homolog(약어: L-U-H-C-Y-F-P)의 두 플라스미드 DNA를 결합합니다.총량은 prep당 50 µg이며, 카트리지당 0.25 mg의 금당 1 µg의 DNA 비율로 최대 50개의 카트리지를 제작할 수 있습니다. 각 카트리지는 1회 사용 분량입니다. 카트리지 제작 후, 금 입자가 효율적으로 추진되는지 확인하기 위해 카트리지를 테스트하십시오.페트리 접시를 정사각형 모양의 파라필름(paraform)으로 감쌉니다. 그다음 헬륨 압력을 150에서 200 PSI 사이로 설정하고, 새로 제작한 카트리지를 파라필름 사각형 위로 발사합니다. 파라필름 위에 나타나는 희미한 금 입자들을 관찰합니다.헬륨 압력에 따라 서로 다른 양의 금 입자가 파퓸(parfum) 위로 추진될 수 있습니다. 하지만 유의미한 차이가 없다면, 충돌 시 더 낮은 압력을 선택하십시오. 이 테스트는 각 샷 과정에서 커버되는 영역 또한 나타냅니다.양파 조직을 준비하려면, 깨끗하고 날카로운 면도날을 사용하여 커다란 황양파의 겉껍질을 벗겨냅니다. 4~5층 깊이로 2 x 8 cm 크기의 직사각형 영역을 절개합니다. 직사각형 모양의 양파 조직을 꺼낸 후 바깥쪽 두 층은 버립니다.양파의 남은 층들을 약 1.5 centimeter 정사각형 모양으로 자릅니다. 3 mm 여과지 원형 조각들이 들어 있는 Petri 접시에 양파 조각들을 놓습니다. 멸균수로 적신 후 Petri 접시의 덮개를 닫습니다.양파 조각들이 입자 충격 준비가 되었습니다. 먼저, 흰색 원형 카트리지 홀더에 카트리지를 장착하십시오. 서로 다른 플라스미드 컨스트럭트가 들어 있는 카트리지를 각각 다른 카트리지 홀더에 장착합니다. 각 카트리지 홀더에는 12회의 샷을 위해 최대 12개의 카트리지를 장착할 수 있습니다.여기에서는 세 가지 서로 다른 홀더를 장착합니다. 첫 번째 홀더에는 콜리플라워 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래의 강력하고 구성적인 프로모터인 35 S-G-F-P-A를 포함하는 카트리지가 들어 있습니다. 이 플라스미드는 양성 대조군으로 사용됩니다.두 번째 홀더에는 동일한 양의 S-E-U-N-Y-F-P와 L-U-H-C-Y-F-P가 포함된 실험용 카트리지를 장착합니다. 세 번째 카트리지 홀더에는 puck spine 벡터와 LUH puck spice가 동일한 몰 농도로 혼합된 카트리지를 장착합니다. 이는 음성 대조군으로도 사용됩니다.배터리와 새 배럴 라이너를 Helios 유전자 총에 삽입하십시오. 배럴 라이너와 유전자 총 모두에 각각의 O-링이 장착되어 있는지 확인하십시오. 다음으로, 카트리지 홀더의 숫자 12 표시가 유전자 총의 상단을 향하도록 하여 빈 카트리지 홀더를 유전자 총에 삽입하십시오.카트리지 홀더를 한두 번 전진시켜 제대로 삽입되었는지 확인합니다. 그런 다음 건을 헬륨 탱크에 연결하고 압력을 150에서 200 PSI 사이로 조절합니다. 귀 보호구를 착용한 상태에서 트리거를 당기면서 측면 버튼을 눌러 건을 여러 번 발사합니다. 빈 카트리지 홀더가 장착된 상태에서 건을 발사하면 건 챔버 내부가 세척되고 압력이 안정되었는지 확인할 수 있습니다.DNA를 발사하기 전, 양파 조각을 발사하여 배경 형광에 대한 음성 대조군으로 사용할 수 있습니다. DNA가 코팅된 금 입자를 발사하려면 빈 카트리지 홀더를 제거하고 양성 대조군이 들어 있는 첫 번째 로드된 카트리지 홀더를 삽입하십시오. 발사하려는 카트리지가 카트리지 홀더의 바닥에 위치하도록 카트리지 홀더를 전진시키십시오.이제 양파 조각을 빈 페트리 접시 중앙에 놓되, 양파의 가장 안쪽 층이 위를 향하게 하십시오. 유전자 총의 배럴 라이너를 페트리 접시 위에 올리고 총을 발사합니다. 다음 카트리지로 이동하여 다른 양파 조각에 발사하십시오.양파 조각 4~5개를 처리할 때까지 이 단계를 반복하십시오. 각 양파 조각은 처리 후 단 한 번만 조사합니다. 조사된 양파 조각을 습윤한 3 mm 필터 페이퍼가 들어 있는 페트리 접시로 옮겨 실험용 카트리지를 조사하십시오.카트리지를 Holden으로 교체하십시오. 둘째, 오염을 방지하기 위해 배럴 라이너를 교체하는 것을 잊지 마십시오. 양성 대조군을 위해 방금 보여드린 것과 같이 양파 조각 4~5개를 촬영하십시오.그 다음, 음성 대조군 DNA가 포함된 3번 Holden 카트리지로 교체합니다. 그리고 다시 양파 조각 4~5개를 분사합니다.오염을 방지하기 위해 배럴 라이너를 교체하십시오. 조사(bombardment) 후, 양파 조각이 들어 있는 페트리 접시를 덮개로 덮으십시오.건조를 방지하기 위해 파라필름으로 감쌉니다. 양파 조각을 실온의 암소에서 16~48시간 동안 배양합니다. 충격 처리가 완료되면 가스를 끄고 압력을 해제한 후, 헬륨 탱크에서 유전자 총을 분리하고 배럴 라이너의 나사를 풀어 카트리지 홀더와 사용한 카트리지를 제거합니다.마지막으로, 카트리지 홀더와 배럴 라이너를 비누물이 담긴 비커에 담근 후 20분 동안 초음파 세척하십시오. 그 후, 물로 헹구어 모든 비누 잔여물을 제거하십시오.70% ethanol에 1시간 동안 담근 후 페이퍼 타월로 건조합니다. 입자 총격 후 16~20시간이 지나면 양파 조각을 관찰합니다. 총격 처리한 양파 조각을 실온에서 16~20시간 동안 배양한 후, 평편한 끝단을 가진 핀셋을 사용하여 양파의 내부 표피에서 단일 세포층을 천천히 벗겨냅니다.이 층은 포격 시 총구와 직접 마주하는 층입니다. 박리된 층을 슬라이드 글라스 위의 물 한 방울 위에 올리고 커버 슬립으로 덮으십시오. 이때 기포가 최소화되도록 주의하십시오.여기에 제시된 zes axio observer, point Z one과 같은 형광 현미경을 사용하여 현미경의 명시야 상태에서 GFP 또는 YFP 형광을 관찰하십시오. 먼저 세포가 살아 있는지 확인하기 위해 세포질 유동을 확인하십시오. 확인 방법은 다음과 같습니다.슬라이드를 명시야 조명에 몇 분 동안 노출시켜 양파 조직을 가온한 후, 이동하는 플라스미드를 관찰하십시오. 세포질 유동(cytoplasmic streaming)은 항상 쉽게 관찰되는 것은 아니므로, 명확하게 보이지 않더라도 낙담하지 마십시오. 형광 검출을 위해서는 GFP 또는 YFP에 적합한 여기 및 검출 필터를 사용하십시오. 또한, 형광 플라스미드가 아닌 플라스미드로 촬영한 양파 조각인 음성 대조군도 확인하십시오.손상된 세포, 잔해 및 양파에서 옅은 노란색 신호가 나타날 수 있습니다. 또한, 지속적으로 발현되는 형광 리포터를 포함하는 플라스미드인 양성 대조군을 확인하십시오.GFP 형광은 모든 세포가 아닌 일부 세포에서만 관찰됩니다. 기포 또한 배경 형광을 유발할 수 있습니다. 양파 표피 세포에서 GFP 신호가 확인되면 카트리지, 양파 조직 및 유전자 총 발사가 적절하게 준비되고 실행되었음을 의미합니다.여기 35 SGFP 양성 플라스미드에서 관찰되는 강한 형광이 나타나 있습니다. 강한 형광은 핵과 세포질 모두를 포함하여 세포 전체에서 관찰됩니다. 명시야 이미지를 통해 세포와 핵의 해당 윤곽을 확인할 수 있습니다.모든 세포가 형질전환되는 것은 아닙니다. Seuss, NYFP 및 L-U-H-C-Y-F-P의 실험적 조합을 양파 세포에 폭격(bombard)했을 때 양파 세포 핵에서 YFP 형광 신호가 검출되었으며, 이는 Seuss NYFP와 L-U-H-C-Y-F-P가 in vivo에서 상호작용함을 나타냅니다. 하지만, 이러한 상호작용에 의해 매개된 형광은 양성 대조군인 35 SGFP 매개 형광보다 현저히 약합니다.또한, SEUS 및 LUH 전사 인자는 핵에 국소화되어 있습니다. 따라서 YFP 형광은 핵에서만 관찰됩니다. 또한, 형광 세포의 수는 35 SGFP 양성 대조군보다 현저히 적습니다.이는 B FFC가 두 파트너 플라스미드가 동일한 양파 세포 내에서 모두 발현될 때만 작동하기 때문입니다. 음성 대조군에서 예상되는 바와 같이, puck spine, 벡터 및 L-U-H-C-Y-F-P의 혼합물이 포함된 3번 카트리지 홀더로 입자 총 조사를 실시한 양파에서는 형광 신호가 검출되지 않았습니다. 지금까지 BioRad Helios 유전자 총 시스템을 사용하여 단백질-단백질 상호작용을 테스트하기 위해 양파 세포에 입자 총 조사를 수행하는 방법을 보여드렸습니다.이 절차를 수행할 때, 적절한 양성 및 음성 대조군을 사용하는 것이 중요하며, BIFC 형광은 신호가 더 약하고 형광 세포의 수가 더 적을 수 있다는 점을 유의하십시오. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

bimolecular-fluorescence-complementation-bifc-assay-for-protein

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 프로토콜은 걱정 기반의 근접 분석을 사용하는 방법에 이미지 단백질 단백질 상호 작용을 설명합니다.

이미징 단백질 - 단백질 상호 작용 생체내에</em

단백질의 subcellular 지방화는 세포 신호의 spatio - 시간적 규정을 결정 중요합니다. 여기, 우리는 세포에있는 단백질의 공간적 상호 작용을 모니터링을위한 간단한 방법으로 bimolecular 형광 complementation (BiFC)를 설명합니다.

Bimolecular 형광 Complementation

우리는 공장에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 테스트하는 기술을 개발했습니다. 노란색 형광 단백질 (YFP은) 2 비 중복 조각으로 분할합니다. 각 조각은 융합 단백질의 표현을 활성화, 게이트웨이 시스템을 통해 관심의 유전자에 프레임에 복제됩니다. 심리 단백질이 상호 작용을 때 YFP 신호의 Reconstitution에만 발생합니다.

게이트웨이 가능 Bimolecular의 형광 Complementation (BiFC) 시스템을 사용하여 공장에서 단백질 상호 작용의 검출

이분자 형광 보완의 유세포 분석은 단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하는 높은 처리량 정량 방법을 제공합니다. 이 방법은 매핑 단백질 결합 부위와 단백질 - 단백질 상호 작용을 조절하는 요인을 선별 적용 할 수 있습니다.

이분자 형광 보완의 유세포 분석 : 단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하는 높은 처리량 정량 방법

생체 내에서 단백질 복합체의 형성은 이분자 형광 보완하여 시각하실 수 있습니다. 상호 작용 파트너는 형광 태그의 보완적인 부분에 융합 일시적으로 담배 잎으로 표현, 두 단백질의 근접에 따라 재구성 형광 신호의 결과로되어있다.

담배 원형질체 및 잎에 이분자 형광 보완에 의해 시각 단백질 - 단백질 상호 작용

단백질-단백질 상호 작용은 BiFC(bimolecular fluorescence complementation)와 PALM(photoactivated localization microscopy)을 결합하여 나노미터 공간 해상도로 세포에서 시각화됩니다. 여기에서는 개별 Ras-Raf 복합체의 나노 스케일 클러스터링 및 확산을 시각화하기 위해 U2OS 세포에서 Ras-Raf 상호 작용을 이미징하기 위해 BiFC-PALM을 사용하는 방법에 대해 설명합니다.

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Luciferase 보완성 이미징 분석 결과 Nicotiana benthamiana 잎 뚜렷이 결정 단백질 단백질 상호 작용 역동성에 대 한

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식물에는 효율적인 방법으로 여러 공상 형광 성 융해 단백질의 공동 식

이 프로토콜은 C. elegans 생식선에서 의한 체르메게에서 단백질-단백질 상호작용을 조사하기 위한 근접 결찰 분석법의 사용을 입증한다.

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여기서 우리는 BiFC 기반 FRET-FLIM 분석법에 의한 형광 태그 단백질을 사용하여 3개의 단백질 파트너 간의 삼차 복합 형성을 시각화하는 방법을 제시합니다. 이 방법은 생체 내에서단백질 단백질 상호 작용 복합체를 연구하는 데 유용합니다.

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이 프로토콜은 관심 단백질에 융합된 비오틴 리가아제에 대한 근접성을 기반으로 단백질에 비오틴의 생체 내 공유 결합 방법을 제시합니다. 이 변형을 통해 단백질 상호작용 연구에서 필요에 따라 스트렙타비딘 비드를 사용하여 단백질을 선택적으로 농축할 수 있습니다.

생체 내 Paramecium tetraurelia의 단백질 상호 작용 연구를 위한 근접 비오티닐화

배우세요 양파 세포에서 BiFC 기법을 활용한 단백질-단백질 상호작용 분석 방법을 Helios Gene Gun으로 유전자 전달하여 형광 현미경으로 상호작용을 검증하는 실험 기술입니다.

헬리 우스 진 건을 사용하여 양파 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용에 대한 Bimolecular 형광 Complementation (BiFC) 어세이

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