헬리 우스 진 건을 사용하여 양파 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용에 대한 Bimolecular 형광 Complementation (BiFC) 어세이

이 절차는 두 개의 애기장대 전사 조절자인 seus(seus)와 줄여서 SEU(줄여서 lu holog 또는 LUH) 사이의 생체 내 단백질 단백질 상호 작용을 테스트합니다. 생체 분자 형광 보완을 활용하여 seus는 노란색 형광 단백질의 말단 단편 또는 YFP 및 LUH가 두 플라스미드 구조체의 Y-F-P-D-N-A의 C 말단 단편에 융합됩니다. 수스(Seuss), 뉴욕(NYFP), L-U-H-C-Y-F-P를 양파 표피 세포에 주입하여 이들의 상호작용을 테스트합니다.

Seuss와 LUH 사이의 상호 작용은 핵에서 YFP의 말단 말단과 C 말단 단편의 연관을 일으켜 핵에서 YFP 형광을 일으킵니다. 어둠 속에서 16-20시간 동안 배양한 후, 형광을 시각화하기 위해 형광 현미경으로 양파 표피 껍질을 관찰합니다. 안녕하세요, 저는 메릴랜드 대학교 세포 생물학 및 분자 유전학과의 Zhi Lu 박사 실험실의 Courtney Hollander입니다.

오늘은 BioRad Helios 유전자 총을 사용하여 양파 세포에서 단백질-단백질 상호 작용을 테스트하는 절차를 보여드리겠습니다. 우리는 식물 세포에서 단백질-단백질 상호 작용 및 단백질 국소화를 테스트하기 위해 실험실에서 이 절차를 사용합니다. 시작하겠습니다.

이 절차를 시작하려면 각 카트리지 준비에 대한 카트리지 준비 절차를 자세히 보여주는 Woods와 Zeto 2008의 Joe Video Protocol에 따라 Helios 유전자 총용 카트리지를 준비합니다. 총 혈장 DNA 50마이크로그램을 BIFC용 PVP 용액 12.5mg과 12.5mg의 금 입자와 혼합합니다. 동일한 카트리지 제제를 결합하여, 추정되는 상호 작용 단백질 Seuss의 두 개의 플라즈마 DNA는 YFP의 N 말단 절반에 융합되었고, 약칭 seus, NYFP 및 LU Homolog는 YFP의 C 말단 절반에 융합되었습니다.

결합된 양은 준비당 50마이크로그램이며, 카트리지당 금 0.25밀리그램당 DNA 1마이크로그램에서 최대 50개의 카트리지를 산출할 수 있습니다. 각 카트리지는 1발용입니다. 카트리지 준비 후 카트리지를 테스트하여 금 입자가 효율적으로 추진되는지 확인합니다.

페트리 접시에 사각형 파라폼 조각을 감쌉니다. 그런 다음 헬륨 압력을 150에서 200PSI 사이로 설정하고 새로 만든 카트리지를 매개변수 사각형으로 발사합니다. 퍼퓸에서 희미한 금 입자를 관찰하십시오.

다른 양의 금 입자가 다른 헬륨 압력에서 퍼퓸으로 추진 될 수 있습니다. 그러나 큰 차이가 없다면 포격을 위해 더 낮은 압력을 선택하십시오. 이 테스트는 또한 각 샷이 진행되는 영역을 나타냅니다.

양파 티슈를 준비하려면 깨끗하고 날카로운 면도날을 사용하여 큰 노란 양파의 바깥쪽 피부를 벗겨냅니다. 2 x 8cm 크기의 직사각형 영역을 4-5개 층 깊이로 자릅니다. 직사각형 양파 조직을 꺼내고 바깥쪽 두 층을 버립니다.

양파의 나머지 층을 약 1.5cm 정사각형 조각으로 자릅니다. 3mm 여과지로 된 원이 들어 있는 페트리 접시에 양파 조각을 넣습니다. 멸균 물로 적셔 페트리 접시를 덮습니다.

양파 조각은 폭격을 가할 준비가 되었습니다. 먼저 카트리지를 흰색 원형 카트리지 홀더에 로드하고 다른 플라스미드 구조가 포함된 카트리지를 다른 카트리지 홀더에 로드합니다. 각 카트리지 홀더는 12발에 최대 12개의 카트리지를 수용할 수 있습니다.

여기에는 세 가지 다른 홀더가 로드됩니다. 첫 번째 홀더에는 콜리플라워 모자이크 바이러스의 강력하고 구성적인 프로모터 35개가 들어 있는 카트리지가 있습니다. 이 플라스미드는 양성 대조군 역할을 합니다.

두 번째 홀더에는 동일한 양의 S-E-U-N-Y-F-P 및 L-U-H-C-Y-F-P가 들어 있는 실험용 카트리지가 로드됩니다. 세 번째 카트리지 홀더에는 퍽 척추 벡터와 LUH 퍽 향신료의 동일한 어금니 혼합물이 포함된 카트리지가 로드됩니다. 이것은 또한 음의 통제 역할을합니다.

배터리와 새 배럴 라이너를 Helios 유전자 총에 삽입합니다. 배럴 라이너와 건에 각각 O-링이 부착되어 있는지 확인하십시오. 다음으로, 빈 카트리지 홀더를 건 상단을 향하는 카트리지 홀더의 마크 번호 12가 있는 유전자 건에 삽입합니다.

카트리지 홀더를 한두 번 전진시켜 올바르게 삽입되었는지 확인하십시오. 그런 다음 총을 헬륨 탱크에 부착하고 압력을 150에서 200 PS 사이로 조정하십시오. 나는 귀마개를 착용하고 방아쇠를 당기는 동안 측면 버튼을 누른 상태에서 총을 몇 번 발사합니다. 빈 카트리지 홀더로 총을 발사하고 장전하면 총실이 청소되고 압력이 안정적입니다.

DNA를 촬영하기 전에 여기에서 양파 조각을 촬영하는 것은 배경 형광에 대한 음성 대조군이 될 수 있습니다. DNA로 코팅된 금 입자를 쏘려면 빈 카트리지 홀더를 제거하고 양성 대조군이 포함된 첫 번째 로드된 카트리지 홀더를 삽입합니다. 발사용 카트리지가 카트리지 홀더 하단에 위치하도록 카트리지 홀더를 전진시킵니다.

이제 양파의 가장 안쪽 층이 위를 향하도록 빈 페트리 접시 중앙에 양파 조각을 놓습니다. 유전자 총의 배럴 라이너를 페트리 접시에 놓고 총을 발사합니다. 다음 카트리지로 이동하여 다른 양파 조각을 쏘십시오.

양파 4-5개를 쏠 때까지 이 단계를 반복합니다. 각 양파 조각은 촬영 후에만 한 번 쏩니다. 포격된 양파 조각을 촉촉한 3mm 여과지가 들어 있는 페트리 접시에 옮겨 실험용 카트리지를 발사합니다.

카트리지 Holden으로 변경합니다. 둘째, 오염을 방지하기 위해 배럴 라이너를 교체하는 것을 잊지 마십시오. 포지티브 컨트롤을 위해 표시된 대로 4-5개의 양파 조각을 쏘십시오.

그런 다음 카트리지 Holden으로 변경합니다. 세 번째는 음성 대조군 DNA를 포함하고 있습니다. 그리고 다시 4-5 개의 양파 조각을 쏘십시오.

오염을 방지하기 위해 배럴 라이너를 교체하십시오. 포격 후. 양파 조각이 들어있는 페트리 접시를 뚜껑으로 덮습니다.

건조를 방지하기 위해 파라폼으로 감쌉니다. 양파 조각을 실온의 어두운 곳에서 16-48시간 동안 배양합니다. 포격이 끝나면 헬륨 탱크에서 유전자 총을 분리하기 전에 가스를 끄고 압력을 해제하고 배럴 라이너의 나사를 풀고 카트리지 홀더와 사용한 카트리지를 제거하십시오.

마지막으로 카트리지 홀더와 배럴 라이너를 비눗물과 초음파 처리와 함께 비커에 담가 청소합니다. 20분 동안. 그런 다음 물로 헹구어 모든 비누 잔여물을 제거하십시오.

70% 에탄올에 한 시간 동안 담근 다음 종이 타월로 말리십시오. 포격 후 16-20 시간 후에 양파 조각을 관찰하십시오. 충격을 받은 양파 조각을 실온에서 16-20시간 동안 배양한 후 끝이 평평한 집게를 사용하여 양파의 내부 표피에서 단일 세포층을 천천히 벗겨냅니다.

이것은 포격 중에 총을 직접 향하는 층입니다. 벗겨진 층을 커버 슬립으로 슬라이드 커버의 물 한 방울 위에 놓습니다. 그러나 거품을 최소화하도록 주의하십시오.

zes axio observer와 같은 형광 현미경을 사용하여 GFP 또는 YFP 형광을 관찰합니다(여기에 현미경의 명시야 아래에 표시된 Z 포인트 1). 먼저 세포질 스트리밍을 확인하여 세포가 살아 있는지 확인합니다. 그렇게하기 위해.

슬라이드를 명시야광에 몇 분 동안 노출시켜 양파 조직을 따뜻하게 한 다음 움직이는 플라스틱을 찾으십시오 세포질 스트리밍은 항상 쉽게 볼 수 있는 것은 아니므로 명확하게 보이지 않더라도 낙담하지 마십시오. 형광 검출의 경우 GFP 또는 YFP에 적합한 여기 및 검출 필터를 사용하십시오. 또한 비형광 플라스미드로 촬영한 양파 조각인 네거티브 컨트롤을 확인하십시오.

세포와 파편, 양파에서 희미한 노란색 신호가 나타날 수 있습니다. 또한 양수 컨트롤을 확인하십시오. 상기 플라스미드는 구성적으로 발현된 형광 리포터를 함유

GFP 형광은 일부 세포에서 볼 수 있지만 모든 세포는 아닙니다. 기포는 또한 배경 형광을 생성할 수 있습니다. 양파 표피 세포에서 눈에 보이는 GFP 신호는 카트리지, 양파 조직 및 유전자 총 발사가 제대로 준비되고 실행된다는 것을 나타냅니다.

여기에 표시된 것은 35 SGFP 양성 플라스미드에서 관찰된 강한 형광입니다. 강한 형광은 핵과 세포질을 포함한 전체 세포에서 볼 수 있습니다. 명시야 이미지를 통해 세포와 핵의 해당 윤곽을 볼 수 있습니다.

모든 세포가 변형되는 것은 아닙니다. YFP 형광 신호는 실험 조합인 Seuss, NYFP 및 L-U-H-C-Y-F-P가 양파 세포에 충격을 가할 때 양파 세포핵에서 검출되며, 이는 Seuss NYFP와 L-U-H-C-Y-F-P가 생체 내에서 상호 작용함을 나타냅니다. 그러나 이러한 상호 작용 매개 형광은 양성 대조군에서 35 SGFP 매개 형광보다 현저히 약합니다.

또한, SEUS 및 LUH 전사 인자는 핵에 국한되어 있습니다. 따라서 YFP 형광은 핵에서만 관찰됩니다. 또한, 형광 세포의 수는 35 SGFP 양성 대조군의 수보다 현저히 적습니다.

이는 B FFC가 두 파트너 플라스미드가 동일한 양파 세포에서 발현될 때만 작용하기 때문입니다. 양파에서는 형광 신호가 감지되지 않으며, 퍽 척추, 벡터 및 L-U-H-C-Y-F-P가 혼합된 카트리지 홀더 번호 3으로 포격을 가합니다. BioRad Helios 유전자 총 시스템을 사용하여 단백질 단백질 상호 작용을 테스트하기 위해 양파 세포를 폭격하는 방법을 보여드렸습니다.

이 절차를 수행할 때 적절한 양성 및 음성 대조군을 사용하고 BIFC 형광이 신호가 더 약하고 형광 세포의 수가 적을 수 있음을 기억하는 것이 중요합니다. 그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.