Photoactivatable 길 항 제를 사용 하 여 T 세포 활성화의 공간 및 시간 제어

이 프로토콜 photoactivatable 펩 티 드-MHC T 세포 활성화의 정확한 spatiotemporal 제어 활성화를 사용 하 여 T 세포를 활성화 하는 영상 기반 방법을 설명 합니다.

이 프로토콜의 전반적인 목표는 T 림프구에서 편광 신호를 유도하기 위해 광활성성 펩타이드 MHC를 사용하는 방법을 설명하는 것입니다. 이 방법은 림프구가 어떻게 빠른 국소 신호를 전달한 다음 이러한 신호에 편광 세포 반응을 탑재하는지와 같은 면역 세포 신호 전달의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 T 세포 신호의 공간적 시간 제어를 제공한다는 것입니다.

T 세포 수용체 활성화의 정확한 시간과 위치를 고정하여 이를 수행합니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 Elisa Sanchez입니다. 먼저 증류된 탈이온수에 1-500으로 희석한 biotinylated poly-L-lysine 또는 bio-PLL을 8웰 챔버 커버 유리에 첨가합니다.

실온에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후에는 증류수 탈이온수로 세척한 후 실온에서 2시간 동안 건조시킵니다. 실온에서 30분 동안 2% BSA가 함유된 HEPES 완충 식염수로 구성된 차단 버퍼로 bio-PLL 코팅 표면을 차단합니다.

배양 후 웰이 건조되지 않도록 bio-PLL 코팅 표면에서 차단 완충액을 제거합니다. 그런 다음 스트렙타비딘을 추가하고 섭씨 4도에서 배양합니다. 한 시간 후 HBS로 코팅된 표면을 세척합니다.

챔버 슬라이드 웰을 4-5회 채우고 뒤집어 웰에서 HBS를 제거합니다. 우물이 마르지 않도록 하십시오. CD4 양성 T 세포 또는 CD8 양성 세포에 대한 특정 비오틴화 광활성 펩타이드 주요 조직적합성 복합체 리간드 및 접착 분자를 bio-PLL 코팅 표면에 추가합니다.

빛을 피하고 실온에서 1시간 동안 배양하십시오. 배양 후에는 이전과 같이 세척하고 씨를 뿌릴 준비가 될 때까지 HBS에 그대로 두십시오. 마지막으로, 적절한 TCR을 발현하는 200, 000 CD4 양성 또는 CD8 양성 T 세포를 올바른 웰에 추가하고 세포가 섭씨 37도에서 15분 동안 부착되도록 합니다.

세포가 표면에 부착되어 퍼지면 광활성화 및 이미징을 위한 준비가 된 것입니다. 이미지 획득을 위해 UV 호환 150X 대물 렌즈가 장착된 도립 전반사 형광 현미경을 사용하십시오. 각각 488 나노미터 및 561 나노미터 여기 레이저를 사용하여 녹색 및 적색 채널 모두에서 프로브를 모니터링합니다.

T 세포가 포함된 챔버 슬라이드를 장착한 후 필요에 따라 현미경 설정을 조정하여 TIRF 또는 에피 형광 조명을 얻습니다. Live mode(라이브 모드)에서 관심 있는 형광 프로브를 발현하는 세포 필드를 선택합니다. 소프트웨어 제어를 사용하여 개별 세포 아래에 광활성화를 위한 미크론 규모의 영역을 설정합니다.

그런 다음 인수를 시작합니다. 일반적으로 80개의 시간 지점이 필요하며 각 시간 간격은 5초입니다. 이로 인해 이중 색상 실험의 경우 488 나노 미터 및 563 나노 미터를 순차적으로 노출 할 시간이 남습니다.

그런 다음 10개의 타임 포인트를 획득한 후 디지털 다이어프램 셔터를 1초에서 1.5초 동안 열어 선택한 영역을 광활성화합니다. 시간 경과가 완료되면 새 셀 필드를 선택하고 프로세스를 반복합니다. 먼저 배경 보정에 사용할 세포 외부의 배경 영역의 형광 강도를 결정합니다.

세포 외부에 미크론 크기의 정사각형 영역을 그리고 마스크를 만듭니다. 형광 강도를 결정하려면 Analyze(분석), Mask Statistics(마스크 통계)를 클릭합니다. Mean fluorescence intensity(평균 형광 강도)를 선택하고 값을 내보냅니다.

각 시점에 대한 광활성화 영역 내의 형광 강도를 측정합니다. 마스크를 선택하여 광활성화된 영역을 강조 표시합니다. 형광 강도를 결정하려면 Analyze(분석), Mask Statistics(마스크 통계)를 클릭합니다.

Mean fluorescence intensity(평균 형광 강도)를 선택하고 값을 내보냅니다. 광활성화된 영역을 강조하기 위해 Mask를 선택하여 광활성화된 영역 중심의 X 및 Y 좌표를 구합니다. 광활성화 영역이 강조 표시되면 Analyze(분석), Mask Statistics(마스크 통계), Center of Area(영역 중심) 및 Export(값 내보내기)를 선택합니다.

관심 있는 형광 프로브의 X 및 Y 좌표를 결정합니다. Manual Particle Tracking을 선택하고 시간 경과에 따른 관심 있는 형광 프로브를 클릭합니다. 모든 시점을 추적했으면 Analyze(분석), Mask Statistics(통계량 마스크), Center of Area(영역 중심) 및 Export the values(값 내보내기)를 선택합니다.

T 세포는 광활성성 MCC-IEFK를 함유하는 챔버 커버 유리에 부착되었습니다. 지질 2차 메신저 DAG에 대한 프로브인 C1-GFP는 상피 형광 모드에서 TIRF 현미경 및 RFP-Tubulin을 사용하여 이미지화되었습니다. T 세포 아래 표면의 국부적인 광활성화는 조사된 영역에서 DAG의 축적을 유도합니다.

그 다음에는 몇 초 안에 중심체가 동일한 영역으로 재배치됩니다. C1-GFP 축적은 시간 경과에 따른 광활성화 영역의 중심에서 배경 보정 후 정규화된 형광 강도를 계산하여 정량화할 수 있습니다. 광활성화에 대한 반응으로 중심체의 방향 전환은 중심체와 광활성화 영역의 중심 사이의 거리를 시간의 함수로 계산하여 정량화할 수 있습니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 하루 이내에 완료할 수 있습니다. 일반적으로 이 시간 동안 분석을 위해 15-20개의 타임랩스 동영상을 생성합니다. 이 접근법은 연구자들이 T 세포에서 신호 활성화의 정확한 동역학과 분극을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

또한 자연 살해 세포의 억제 신호 전달을 연구하는 데 적용되었습니다. 그 결과, 우리는 이제 의사 소통 면역 세포 세포 상호 작용이 어떻게 조립되고 용해되는지에 대해 더 잘 이해할 수 있게 되었습니다.