Name: Photoactivatable 길 항 제를 사용 하 여 T 세포 활성화의 공간 및 시간 제어 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: 배우세요 광활성화 가능한 펩타이드-MHC를 사용하여 T 세포 활성화의 공간적 및 시간적 제어를 구현하는 방법을. 이 기술은 면역 세포 신호 전달의 정확한 역학과 극성화를 연구하는 데 활용됩니다.

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우리는 조언과 지원을 위한 Huse 실험실의 구성원 감사. 미국 국립 보건원 (R01-AI087644 수소) 및 P30-CA008748 기념 슬로 안-Kettering 암 센터에 의해 지원.

1입니다. 물질로 유리 표면 준비
<ol><li>Biotinylated 폴 리-L-리 신 (바이오-PLL)와 코트 8 잘 연 발 coverglass 희석 증류수, 이온을 제거 된 물 (ddH2O) 1: 500. 실 온 (RT)에서 30 분 동안 품 어.</li>
	<li>H2o. 세척</li>
	<li>실시간에서 2 시간 건조</li>
	<li>블록 바이오-PLL 실시간에서 30 분 동안 차단 버퍼 (HEPES 버퍼링 염 분 [10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl], 2 %BSA)와 표면 코팅<ol>
<li>폴 리-L-리 신 hydrobromide 10mm NaPO4, pH 8.5의 1 ml에서의 5 mg을 디졸브.</li>
		<li>(에서 DMSO에 100mg/mL 주식) NHS-비오 틴의 125 μmol (0.55 밀리 그램)를 추가 하 고 반응의 pH를 확인. PH 8.5이 하 있는 경우에, pH 8.5와 9.5 사이 그것을 인상 4 N NaOH의 2 μ를 추가 합니다.</li>
		<li>30 분 동안 소용돌이입니다.</li>
		<li>20 mM Tris pH 8.0에에서 녹아 100mm 글리신의 50 μ와 반응을 끄다.</li>
		<li>10 분에 대 한 전체 전력에서 회전 시키십시오 그리고 새로운 튜브에는 상쾌한 전송. 참고: 바이오-PLL 품질은 일반적으로에 비해 이전 준비 직렬 2 배 희석 96-잘 ELISA 접시에 재료의 코팅 및 알칼리 성 인산 가수분해 효소를 가진 외피 streptavidin 결합 후 biotin 콘텐츠 측정.</li>
	</ol>
</li>
	<li>블로킹 버퍼를 제거 합니다. 웰 스 건조를 허용 하지 않습니다. Streptavidin (블로킹 버퍼에서 100 µ g/mL)를 추가 합니다. 1 h 4 ° c.에 품 어</li>
	<li>HBS에 씻어. 와 반전 챔버 슬라이드 웰 스 4-5 번, 우물에서 HBS를 제거. 웰 스 건조를 허용 하지 않습니다.</li>
	<li>표면에 biotinylated pMHC ligands 및 접착 분자를 추가 합니다. 참고: MCC 및 OVA 수 직교-nitrobenzyl를 추가 하 여 photocaged 기반 키 lysines의 ε 아미노 그룹을 보호 그룹 (예: nitrophenylethyl (NPE) 또는 nitroveratryloxycarbonyl (NVOC)) (고객 센터, OVA에서 k 7에에서 K12). Photocaged 고객 센터 및 OVA 상업용 공급 업체에서 얻을 수 있습니다. 수성 버퍼에서 재구성, 후 bacterially 표현된-Ek 와 h 2 Kb 설립된 접근11,12를 사용 하 여 refolded 있습니다 그들은.</li>
	<li>Photoactivatable 고객 센터 또는 OVA 펩타이드의 유효성 검사<ol>
<li>휴대용 UV 램프와 UV 해 여 NVOC 보호 펩 티 드 decage ( 재료의 표참조) 실시간에서 20 분</li>
		<li>펄스 1.0 x 105 APCs nonstimulatory 펩 티 드 (부정적인 컨트롤, 예를 들면 Hb)의 1 개의 µ M를 1 시간에 대 한 조사 photoactivatable 펩 티 드, 펩 티 드 photoactivatable 그리고 주 작동 근 펩 티 드 (긍정적인 통제, 예를 들어, 고객 센터) unirradiated 37 ° c.에서 하룻밤</li>
		<li>5 c.를 표현 하는 T 세포를 자극 하 C7/2B4/앤 TCR, CH12 또는 CH27 B 세포를 사용 합니다. OT1 T 세포를 자극, RMA s 또는 EL4 thymoma 셀을 사용 합니다.</li>
		<li>T 세포에의 동등한 수와 함께 펄스 APCs를 혼합 96-200의 최종 볼륨 하단 플레이트 라운드 잘 µ L. 12-24 h에 대 한 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>각 우물에서는 supernatants 복구와 streptavidin 양 고추냉이 과산화 효소 색도계 검출 ELISA에 의해 일리노이-2를 분석 합니다. 참고: 모든 펩 티 드 MHC 복합물으로 refolding 전에 분무 질량 분석에 의해 배우면 자격의 확인이 좋습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>폴딩 및 빛에 노출을 최소화 하기 위하여 MHC의 정화를 수행 합니다. 예를 들어 포장 알루미늄 호 일에 반응을 접는 고 오프 UV 램프와 젤 여과 크로마토그래피를 실시. 참고: 그것은 그 photoactivatable 고객 센터-난-Ek 를 발견 되었으며 OVA-H2-Kb 불완전 한 기능 고른다면으로 인해 높은 밀도에서 UV 독립 T 세포 활성화를 유도 합니다. 따라서, photoactivatable pMHC nonstimulatory pMHC (예: -Ek 헤모글로빈64-76 펩 티 드 (Hb) 포함)의 10-30 x 초과로 동원 정지 단계 희석은. 이 신호 대 잡음 비 후속 이미징 실험의 향상.</li>
	<li>Photoactivate CD4+ T 총칭 biotinylated Hb-난-Ek (3 µ g/mL), biotinylated photoactivatable 고객 센터-난-Ek (0.1 µ g/mL), 및 biotinylated 클래스에 대 한 항 체의 혼합물을 사용 하는 세포, MHC H2-Kk I (0.5 µ g / mL). 안티-H2-Kk 항 체 장려 5 c. C7/2B4/와 T 세포 H2-Kk, 정품 인증을 진행 하지 않고 유리 표면에 확산을 표현.</li>
	<li>CD8에 대 한+ T 세포, biotinylated h 2 Db 펩 티 드 KAVYDFATL 베어링의 혼합 사용 (1 µ g/mL), biotinylated photoactivatable OVA-H2-Kb (0.1 µ g/mL), 및 접착 분자 ICAM-1의 세포 외 도메인 (2 µ g/mL 곤충 세포 문화13생산). ICAM-1 T 세포 표면에서 LFA1 integrin 참여 하 여 가까운 접촉 형성을 장려 한다.</li>
	<li>RT에 1 시간 또는 2 시간 이상 4 ° c.에 외피 다음 블로킹 버퍼에 모든 단백질 혼합물을 적용 참고: 수 µ m2 당 8000 ~ 이런이 종류의 표면에 분자 밀도 이전 결정된6되었습니다. Photoactivatable pMHC ~1/30 대표는일 biotinylated 단백질 표면에, 그것의 밀도의 µ m2, decaging 이전 당 ~ 267 분자를 될 것입니다.</li>
	<li>1.6 단계에서 세척 하 고 사용 하 여 준비까지 HBS에 두고.</li>
	<li>200000 CD4 추가+ 또는 CD8+ T 세포 각 우물에 적절 한 TCR을 표현 하 고 15 분 동안 37 ° C에서 준수 하는 셀. 일단 세포는에 연결 하 고 표면에 확산, 그들은 photoactivation 및 이미징에 대 한 준비가 되었습니다. 참고: 효과 기 T 세포 형광 이미징 프로브와 Retroviral 변환 세부 elswhere6,7에 설명 되어 있습니다. 칼슘 신호 수 있습니다 또한 공부 될 칼슘 민감한 염료 Fluo-46로드 untransduced T 세포를 사용 하 여. 비율 염료 Fura-2 decaging photoactivatable pMHC의 유도 또한 UV 범위에서 여기 필요 하기 때문에 권장 하지 않습니다.</li>
</ol>2. 이미지 수집
<ol><li>거꾸로 TIRF 현미경 이미지 수집을 위한 UV 호환 150 X 객관적 렌즈와 복을 사용 합니다. UV 100 W 수은 램프 (HBO)에 연결 된 디지털 다이어 프 램 시스템을 사용 하 여 사용자 정의 영역을 비추는. UV 400 nm 긴 패스 미러를 사용 하 여 샘플에이 램프에서 빛을 직접.</li>
	<li>이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 지역화 된 photoactivation 및 시간 경과 수집에 대 한. 대부분 실험에서 모두는 녹색 및 빨강 채널에서 488를 사용 하 여 프로브를 모니터링 및 561 nm 여기 레이저, 각각. 레이저 빛은 또한 UV 범위 (decaging 사용)에서 전송 듀얼 대역 통과 dichroic 거울을 사용 하 여 샘플에 지시 된다. 현미경 구성에 대 한 자세한 내용은 테이블의 자료 와 그림 6 을 참조 하십시오.</li>
	<li>T 세포를 포함 하는 챔버 슬라이드를 장착, TIRF 또는 epifluorescence 조명, 필요에 따라 얻기 위해 설정을 조정 합니다. 라이브 모드로 형광 probe(s)을 표현 하는 셀의 필드를 선택 합니다. 소프트웨어 제어를 사용 하 여 개별 셀 아래 photoactivation 미크론 단위 영역을 설정 합니다.</li>
	<li>시간 경과 수집을 시작 합니다. 일반적으로, 5의 간격 80 timepoints 인수는 각 시간 포인트 사이 s. 이것은 순차적 488에 대 한 더 충분 한 시간 및 듀얼 컬러 실험의 경우 563 nm 노출.</li>
	<li>10 timepoints, photoactivate 디지털 다이어 프 램을 열어서 선택된 영역 1-1.5 s 셔터 후</li>
	<li>시간 경과 후 셀의 새 필드를 선택 하 고 과정을 반복.</li>
</ol>3. 데이터 분석
참고: 고정된 ligands의 지역화 된 photoactivation 신호 응답 cytoskeletal 개장 이벤트의 정량 분석을 위해 사용 될 수 있는 잘 정의 된, 고정 된 물질로 영역을 만듭니다. 프로토콜은 일반적으로 조사 지역 내에서 형광 강도 측정 하거나 위치 끝점으로 거리 측정을 위한 조사 영역을 사용 하 여 포함 하는 분석 (예. 분극에 centrosome의 평가 조사 지역)입니다. 두 분석 프로토콜은 아래 설명 되어 있습니다. 강도 및 거리 측정, 다음 추가 처리 및 분석에 대 한 출력 수 있는 다양 한 대화형 이미지 분석 프로그램을 사용할 수 있습니다.
<ol><li>
형광 강도
	<ol>
<li>셀 (FIb) 밖에 배경 영역의 형광 강도 (FI)를 결정 합니다. 이 배경 보정을 위해 사용 됩니다.<ol>
<li>셀 외부 미크론 크기의 사각형 영역을 그릴 하 고 마스크. 형광 강도 확인 하려면 분석 클릭 | 통계를 마스크. 형광 강도 의미 를 선택 하 고 값을 내보냅니다. 참고: 절차 세부 정보 (예: 3.1.1.1) Slidebook 소프트웨어를 참조 하십시오 ( 재료의 표참조). 다른 소프트웨어 패키지를 사용 하 여이 프로토콜의 구현 (예., 피지) 약간 다를 수 것입니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>각 시간 지점에 대 한 photoactivated 지역 내에서 인터넷을 결정 합니다.<ol>
<li>마스크 는 photoactivated 영역을 강조 표시를 선택 합니다. 형광 강도 확인 하려면 분석 클릭 | 통계를 마스크. 형광 강도 의미 를 선택 하 고 값을 내보냅니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>배경을 FI 지역 내에서 측정된 된 FI 값에서 뺍니다. 그런 다음 평균으로 나누어 수정된 FI 측정 표준화, 배경 수정 photoactivation 전에 처음 9 프레임의 FI. Δ/F = ((FI-FIb)/mean(FI1-9)-FIb)). 참고: 그래프 δ/F 시간의 기능으로.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
거리
	<ol>
<li>X 및 y 좌표는 photoactivated 지역의 중심의.<ol>
<li>X 및 y를 확인 하려면 photoactivated 지역의 중심의 좌표 마스크 는 photoactivated 영역을 강조 표시를 선택. Photoactivation의 지역 강조 되 면 선택 분석 | 통계를 마스크 | 지역 센터 내보낼 값.</li>
		</ol>
</li>
		<li>X 및 y 결정 각 시간 지점에 대 한 관심의 형광 프로브에 대 한 좌표. 이것은 수동 또는 자동 입자 추적을 통해 일반적으로 달성 된다.<ol>
<li>X 및 y를 확인 관심, 형광 프로브의 좌표 수동 입자 추적 을 선택 하 고 시간이 지남에 따라 관심의 형광 프로브에 클릭. 일단 모든 시간 포인트 추적 된 선택 분석 | 통계를 마스크 | 지역 센터 내보낼 값.</li>
		</ol>
</li>
		<li>관심사의 형광 단백질 및 방정식을 사용 하 여 각 시간 지점에 photoactivated 지역의 중심 사이의 거리를 계산: 거리 = √ ((2x x-1)2+ (y2y-1)2), x2 와 y는2 에 관심과 x1 과 y1 의 형광 단백질의 좌표는 photoactivated 지역의 중심의 좌표.</li>
		<li>시간의 기능으로 거리 그래프입니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+structure+and+function+of+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.Perspect.Biol%22%5BJournal%5D)">Understanding the structure and function of the immunological synapse.</a> Cold Spring Harb.Perspect.Biol. 2, a002311(2010).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

최근 몇 년 동안, 라이트는 세포질 과정의 spatiotemporally 제어 활성화를 위한 훌륭한 도구로 떠오르고 있다. 다양 한 방법론 개발 되었습니다, 각각 관련 장점과 단점. 고정, extracellular ligands의 decaging에, 기반으로, 여기에 설명 된 시스템은 급속 한, subcellular, 편광 신호 응답의 분석에 대 한 이상적으로 적합 합니다. 이 방법은 위에서 설명한 T 세포에는 대형 검사에 적용 되었습니다. 또한, 다른 수용 체에 대 한 갇힌된 ligands가 설계 되었습니다, 우리 수용 체 전화를 자연 살해 세포와 응답에 녹음 방송 요인 NF-κB의 핵 전 좌에 억제 신호를 평가 하기 위해 동일한 전략을 적용할 수 있도록 14,15신호.
이 프로토콜에서 물질로 ligands 그들은 이미징 실험의 기간에 대 한 자극의 고정, 편광 소스로 유지...

T 림프 톨 (T 세포) 항 원 펩 티 드의 세포 표면 MHC 컨텍스트에서 표시를 인식 하 여 세포 면역에 중심 역할을 재생 합니다. TCR에 의해 중재 되는 항 원 인식, naïve T 세포의 분화를 구동 하 고 이펙터 인구에 의해 cytolytic와 의사 소통 응답의 납품을 촉진. TCR 참여는 또한 세포질 구조에 극적인 변화를 유도 한다. 분 이내에, T 세포 면역학 시 냅 스 (IS)1,2로 알려진 편광된 인터페이스를 형성 하는 항 원 제시 세포 (APC)의 측에 gloms. IS cytokines의, 또는 세포 독성 T 세포 (Ctl), 송출 파괴 용균성 단백질의 경우 방향 릴리스를 사용 하 여 T 세포 효과 기 응답을 potentiates.
PMHC에 의해 TCR 참여 활성화의 T 세포 (위도), 궁극적으로 시 냅 스 골격2의 강력한 리 모델링 추진에 대 한 링커를 포함 한 여러 다운스트림 어댑터 분자의 급속 한 인 산화를 유도 한다. 대뇌 피 질의 filamentous 말라 (F-말라) T 세포 APC 표면 확산을 다음 IS 주변 및 중앙에서 고갈에 F-말라 축적으로 특징 고리 모양의 구조를 확인 한다. F-말라 반지 형성 인터페이스의 중심 바로 아래 위치에 microtubule 조직 센터 (MTOC, T 세포에서는 centrosome 라고도)의 재교육에 밀접 하 게 결합 이다. 두 이벤트는 초기 항 원 인식의 분 이내 발생 하 고 후속 활성화 이벤트와 이펙터 응답 발생 건축 컨텍스트 설정.
공부 하 고는 형성, 다양 한 실험실 접근 송출 고정된 TCR ligands를 포함 하거나 지원 자체 ligands3,4를 포함 하는 지질 bilayer 유리 표면에 의해 대체 됩니다 개발 했습니다. T 세포는 총 내부 반사 형광 현미경 (TIRF) 또는 confocal 현미경 검사 법, 초기 T 세포 활성화 및 IS 형성의 고해상도 연구를 활성화 하 여 몇 군데 수 있습니다이 표면에 IS 같은 연락처를 형성 합니다.
하지만이 방법을 완벽 하 게 조립된 IS의 뛰어난 시각화에 대 한 허용, 신호 다음 TCR:pMHC 결 찰의 많은 초 이내에, TCR 활성화를 정확 하 게 다음 사건의 순서를 결정 하는 노력을 복잡 하 게 발생 . 이 문제를 우회 하는 photoactivation 방식 개발 되었습니다, TCR 활성화5,,67의 spatiotemporal 제어를 달성 하기 위해 사용 되는 photoactivatable pMHC. 이 시스템에서 T 세포는 비 물질로 TCR까지 자외선 (UV)을 조사 하는 photoactivatable pMHC를 포함 하는 유리 표면에 부착 됩니다. UV 방사선의 T 세포 아래 표면 미크론 크기의 지역 T 세포에 의해 인식 될 수 있는 물질로 영역을 만드는 photocage를 제거 합니다. 이후 신호 이벤트와 cytoskeletal 개장 다음 유전자 인코딩된 형광 기자를 사용 하 여 모니터링 됩니다. 항 원 펩 티 드, 엄 시 토 크롬 c88-103 (MCC)와 ovalbumin257-264 (OVA), 선물 된다 II MHC-Ek 클래스와 클래스의 맥락에서 나 MHC H2-Kb, 각각의 2 개의 photoactivatable 버전 되었습니다 (그림 1)를 개발 했다. 그러면 두 CD4의 분석+ T 세포 (표현 5 C. 고객 센터-난-Ek 에 대 한 특정 C7, 2B4, 또는 모양과 TCRs)와 CD8+ T 세포 OVA-H2-Kb (OT1 TCR 표현)에 대 한 특정.
지난 10 년간, TCR photoactivation 및 이미징 접근은 이용 되어 신호 단계 초기 TCR의 정확한 활동을 설정 하 고 또한 편광된 cytoskeletal 개장5, 를 경 세 하는 분자 경로 식별 하 6 , 7 , 8 , 9 , 10. 예를 들어 분석 결과 그 centrosome 결정에서 쓸모 있었다 송출 쪽으로 재교육 가운데는 IS에 지질 두 번째 메신저 diacylglycerol의 지역화 된 그라데이션에 의해 중재입니다. 이 방법론의 T 세포 기능 고해상도 이미징 분석을 요구 하는 응용 프로그램에 대 한 가치가 있을 나갈 것입니다 예상 된다.

<table><tbody><tr><td>Nunc Lab-Tek 챔버 커버 글라스</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>155361</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine hydrobromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td>Biotinylated Poly-L-Lysine</td></tr><tr><td>EZ-Link NHS-Biotin</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>20217</td><td>Biotinylated Poly-L-Lysine</td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>434301</td><td></td></tr><tr><td>BirA-500: BirA 비오틴-단백질 리가제 표준 반응 키트</td><td>Avidity</td><td>BirA500</td><td>은 단백질을 비오틴화하는 데 사용될 것입니다</td></tr>. 비<tr><td>오틴화된 Hb I-EK&nbsp; </td><td></td><td></td><td>단백질 접힘에 대해서는 참고 문헌 6을 참조하십시오. 비오틴화의 경우, BirA 키트</td></tr><tr><td>비오틴화 NPE-MCC I-EK&nbsp; </td><td>Anaspec</td><td></td><td>Custom NPE-MCC(H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH)는 Anaspec</td></tr><tr><td>Biotinylated &alpha에서 구입할 수 있습니다. H2-Kk 항체</td><td>BD Biosciences</td><td>553591</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated NPE-OVA H2-Kb</td><td>Anaspec</td><td></td><td>Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH)는 Anaspec</td></tr><tr><td>Biotinylated KAVY H2-Db&nbsp;</td><td>Anaspec</td><td></td><td>맞춤형 합성 단백질(KAVYDFATL)은 Anaspec</td></tr><tr><td>Biotinylated ICAM1에서</td> 구입할 수 있습니다.<td></td><td></td><td>단백질 접힘에 대해서는 프로토콜의 참조를 참조하십시오. 비오틴화의 경우 BirA 키트</td></tr><tr><td>휴대용 UV 램프</td>를 사용하십시오. <td>UVP</td><td>UVGL-25</td><td>램프는 샘플에서 < 1cm 떨어져 있습니다.&nbsp; 365광의 30초는 검출 가능한 디케이징에 충분하며 정량적 디케이징에는 20분이 소요됩니다.</td></tr><tr><td>올림푸스 IX-81 OMAC TIRF 시스템.</td><td>Olympus</td><td></td><td>이미징 시스템에 대한 추가 정보는 그림 6</td></tr><tr><td>Mosaic 디지털 다이어프램</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slidebook 소프트웨어</td><td>Intelligent Imaging Innovations</td>에서 확인할 수 있습니다.<td></td><td></td></tr></tbody></table>

photoactivatable 길 항 제를 사용 하 여 t 세포 활성화의 공간 및 시간 제어

Spatial and Temporal Control of T Cell Activation Using a Photoactivatable Agonist

T 림프 톨 급속 하 고, 편광 신호에 종사 하는 TCR 활성화 다음 분 이내 발생. 이 면역 시 냅 스, T 세포 활성화를 조절 하 고 이펙터 응답을 대상으로 하는 진부한 셀 교차로의 형성을 유도 합니다. 이러한 프로세스를 효과적으로 공부 하기 빠르고, 편광 응답 캡처에 맞춤화 된 이미징 접근 필요 하다. 이 프로토콜 기반으로 photoactivatable 펩 티 드-주요 조직 적합성 복잡 한 (pMHC)는 자외선에 노출 될 때까지 비 물질로 이러한 시스템을 설명 합니다. Videomicroscopy 실험 동안 타겟 decaging이 시 약의 TCR 활성화의 정확한 spatiotemporal 제어 및 고해상도 이미징 총 내부 반사 (TIRF) 이후 세포 응답의 모니터링 수 있습니다. 이 방법은 또한 유전과 약리 섭 동 전략와 호환 됩니다. 면역학 시 냅 스의 기반이 되는 편광 cytoskeletal 구조의 형성에 TCR 신호를 연결 하는 잘 정의 된 분자 통로의 어셈블리에 대 한 수 있습니다.

Photoactivation 및 이미징 접근 관찰과 급속 하 고, 편광 신호 응답의 손쉬운 정량화 할 수 있습니다. 복제의 기능을 설명 하기 위해 여기 TCR 유도 DAG 축적과 centrosome 재교육 사이 spatiotemporal 상관 관계를 조사 하는 실험 이다. 5 C. C7 T 셀 폭발 했다 2 명의 형광 기자 불리고 retrovirally: 단백질 키 니 아 제 C θ에서에서 탠덤 C1 도메인 포함 된 DAG 바이오 센서는 centrosome 모니터링 GFP (C1-GFP) RFP tubulin에 연결. T 세포 다음 photoactivatable 고객 센터-난-Ek를 포함 하는 연 발된 coverglass에 붙어 있었다. C1-GFP는 TIRF 현미경 및 RFP tubulin epifluorescence 모드에서 사용 하 여 몇 군데. 그림 2에서 같이, T 셀 아래 표면의 지역화 ...

이 프로토콜 photoactivatable 펩 티 드-MHC T 세포 활성화의 정확한 spatiotemporal 제어 활성화를 사용 하 여 T 세포를 활성화 하는 영상 기반 방법을 설명 합니다.

Photoactivatable 길 항 제를 사용 하 여 T 세포 활성화의 공간 및 시간 제어

T lymphocytes engage in rapid, polarized signaling, occurring within minutes following TCR activation. This induces formation of the immunological ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 T 림프구에서 편광 신호를 유도하기 위해 광활성성 펩타이드 MHC를 사용하는 방법을 설명하는 것입니다. 이 방법은 림프구가 어떻게 빠른 국소 신호를 전달한 다음 이러한 신호에 편광 세포 반응을 탑재하는지와 같은 면역 세포 신호 전달의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 T 세포 신호의 공간적 시간 제어를 제공한다는 것입니다.T 세포 수용체 활성화의 정확한 시간과 위치를 고정하여 이를 수행합니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 Elisa Sanchez입니다. 먼저 증류된 탈이온수에 1-500으로 희석한 biotinylated poly-L-lysine 또는 bio-PLL을 8웰 챔버 커버 유리에 첨가합니다.실온에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후에는 증류수 탈이온수로 세척한 후 실온에서 2시간 동안 건조시킵니다. 실온에서 30분 동안 2% BSA가 함유된 HEPES 완충 식염수로 구성된 차단 버퍼로 bio-PLL 코팅 표면을 차단합니다.배양 후 웰이 건조되지 않도록 bio-PLL 코팅 표면에서 차단 완충액을 제거합니다. 그런 다음 스트렙타비딘을 추가하고 섭씨 4도에서 배양합니다. 한 시간 후 HBS로 코팅된 표면을 세척합니다.챔버 슬라이드 웰을 4-5회 채우고 뒤집어 웰에서 HBS를 제거합니다. 우물이 마르지 않도록 하십시오. CD4 양성 T 세포 또는 CD8 양성 세포에 대한 특정 비오틴화 광활성 펩타이드 주요 조직적합성 복합체 리간드 및 접착 분자를 bio-PLL 코팅 표면에 추가합니다.빛을 피하고 실온에서 1시간 동안 배양하십시오. 배양 후에는 이전과 같이 세척하고 씨를 뿌릴 준비가 될 때까지 HBS에 그대로 두십시오. 마지막으로, 적절한 TCR을 발현하는 200, 000 CD4 양성 또는 CD8 양성 T 세포를 올바른 웰에 추가하고 세포가 섭씨 37도에서 15분 동안 부착되도록 합니다.세포가 표면에 부착되어 퍼지면 광활성화 및 이미징을 위한 준비가 된 것입니다. 이미지 획득을 위해 UV 호환 150X 대물 렌즈가 장착된 도립 전반사 형광 현미경을 사용하십시오. 각각 488 나노미터 및 561 나노미터 여기 레이저를 사용하여 녹색 및 적색 채널 모두에서 프로브를 모니터링합니다.T 세포가 포함된 챔버 슬라이드를 장착한 후 필요에 따라 현미경 설정을 조정하여 TIRF 또는 에피 형광 조명을 얻습니다. Live mode(라이브 모드)에서 관심 있는 형광 프로브를 발현하는 세포 필드를 선택합니다. 소프트웨어 제어를 사용하여 개별 세포 아래에 광활성화를 위한 미크론 규모의 영역을 설정합니다.그런 다음 인수를 시작합니다. 일반적으로 80개의 시간 지점이 필요하며 각 시간 간격은 5초입니다. 이로 인해 이중 색상 실험의 경우 488 나노 미터 및 563 나노 미터를 순차적으로 노출 할 시간이 남습니다.그런 다음 10개의 타임 포인트를 획득한 후 디지털 다이어프램 셔터를 1초에서 1.5초 동안 열어 선택한 영역을 광활성화합니다. 시간 경과가 완료되면 새 셀 필드를 선택하고 프로세스를 반복합니다. 먼저 배경 보정에 사용할 세포 외부의 배경 영역의 형광 강도를 결정합니다.세포 외부에 미크론 크기의 정사각형 영역을 그리고 마스크를 만듭니다. 형광 강도를 결정하려면 Analyze(분석), Mask Statistics(마스크 통계)를 클릭합니다. Mean fluorescence intensity(평균 형광 강도)를 선택하고 값을 내보냅니다.각 시점에 대한 광활성화 영역 내의 형광 강도를 측정합니다. 마스크를 선택하여 광활성화된 영역을 강조 표시합니다. 형광 강도를 결정하려면 Analyze(분석), Mask Statistics(마스크 통계)를 클릭합니다.Mean fluorescence intensity(평균 형광 강도)를 선택하고 값을 내보냅니다. 광활성화된 영역을 강조하기 위해 Mask를 선택하여 광활성화된 영역 중심의 X 및 Y 좌표를 구합니다. 광활성화 영역이 강조 표시되면 Analyze(분석), Mask Statistics(마스크 통계), Center of Area(영역 중심) 및 Export(값 내보내기)를 선택합니다.관심 있는 형광 프로브의 X 및 Y 좌표를 결정합니다. Manual Particle Tracking을 선택하고 시간 경과에 따른 관심 있는 형광 프로브를 클릭합니다. 모든 시점을 추적했으면 Analyze(분석), Mask Statistics(통계량 마스크), Center of Area(영역 중심) 및 Export the values(값 내보내기)를 선택합니다.T 세포는 광활성성 MCC-IEFK를 함유하는 챔버 커버 유리에 부착되었습니다. 지질 2차 메신저 DAG에 대한 프로브인 C1-GFP는 상피 형광 모드에서 TIRF 현미경 및 RFP-Tubulin을 사용하여 이미지화되었습니다. T 세포 아래 표면의 국부적인 광활성화는 조사된 영역에서 DAG의 축적을 유도합니다.그 다음에는 몇 초 안에 중심체가 동일한 영역으로 재배치됩니다. C1-GFP 축적은 시간 경과에 따른 광활성화 영역의 중심에서 배경 보정 후 정규화된 형광 강도를 계산하여 정량화할 수 있습니다. 광활성화에 대한 반응으로 중심체의 방향 전환은 중심체와 광활성화 영역의 중심 사이의 거리를 시간의 함수로 계산하여 정량화할 수 있습니다.이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 하루 이내에 완료할 수 있습니다. 일반적으로 이 시간 동안 분석을 위해 15-20개의 타임랩스 동영상을 생성합니다. 이 접근법은 연구자들이 T 세포에서 신호 활성화의 정확한 동역학과 분극을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.또한 자연 살해 세포의 억제 신호 전달을 연구하는 데 적용되었습니다. 그 결과, 우리는 이제 의사 소통 면역 세포 세포 상호 작용이 어떻게 조립되고 용해되는지에 대해 더 잘 이해할 수 있게 되었습니다.

spatial-temporal-control-t-cell-activation-using-photoactivatable

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

빛으로 작은 GTPase 활동 spatio-시간적 제어를위한 방법을 설명합니다. 이 방법은 rapamycin-유도 FKBP-FRB의 heterodimerization 및 사진 caging 시스템을 기반으로합니다. 빛을 조사의 최적화는 subcellular 수준에서 작은 GTPases의 spatio-temporally 제어 활성화를 가능하게합니다.

리빙 셀의 Subcellular 수준과 초 Timescale에 작은 GTPase 활동의 Spatio-시간적 조작

따라서, 그것이 관여 단백질의 공간적 및 시간적 행위를 파악하는 것이 중요 신호 전달 이해하기 위해, 플라즈마 막 내에서 또는 세포 내 위치에 두 단백질의 compartmentalization 크게 신호 결과에 영향을 미칠 수있는 규제 메커니즘입니다. 우리는 여기서 T 세포의 신호 전달을 연구하는 TIRF 현미경 기반 시스템을 설명하지만, 광범위하게 적용됩니다.

실시간, TCR의 동시 이미징 및 관련 신호 전달 단백질에 대한 TIRF 현미경 기법

이 비디오는 UV 조사를 사용하여 광활성 펩타이드-주요 조직적합성 복합체를 감소시키는 방법을 보여줍니다. 디케이징 과정은 네이티브 펩타이드 염기서열을 노출시켜 정확한 T 세포 활성화를 가능하게 합니다.

광활성성 펩타이드 MHC를 사용한 제어된 T 세포 활성화 평가

우리는 T 세포 활성화 과정 중에 단백질 역학에 대한 통찰력을 제공하는 라이브 세포 이미징 방법을 설명합니다. 우리는 정량적 인 결과는 T 세포 활성화에 걸쳐 복잡한 형성 신호를 따라 열매를 산출하는 T 세포의 확산 분석, 공 촛점 현미경 및 이미징 분석의 결합 사용을 보여줍니다.

T 세포의 실시간 라이브 영상은 복잡한 형성을 신호

여기에서는 배양 또는 생체 내에서 뉴런에서 발현되는 표적 뉴런 단백질에 광반응성 비천연 아미노산을 유전적으로 암호화하여 짧은 광 펄스로 뉴런 단백질을 선택적으로 활성화하는 절차를 제시합니다.

뉴런의 유전자 인코딩 된 부 자연스러운 아미노산을 사용하여 신경 세포 단백질의 광 제어

이 프로토콜에 갇힌된 단백질 키 니 아 제 A (PKA), 셀룰러 신호 변환 bioeffector 나노 입자 표면에 움직일, cytosol에 microinjected 이었고 upconverted 근처-적외선 (NIR) 방사선에서 자외선에 의해 활성화 유도 다운스트림 스트레스는 cytosol에서 섬유 분해.

원격으로 업 컨버전 나노 중재 니 Photoactivation에 의해 세포내 신호 변환 하는 통합된 시스템

여기, 우리 optogenetic 컨트롤의 진동 정보 셀 전송 분석 및 유전자 발현의 모니터링 라이브 프로토콜을 제시. 이 방법은 다세포 시스템에서 동적 유전자 식 프로그램의 기능적 중요성을 테스트 하려면 독특한 플랫폼을 제공 합니다.

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공동-agonism 인간 CD8 + T 세포 활성화에 조사를 단일 체인 MHC 기술의 사용

이 프로토콜 어떤 autoreactive 세포 photoactivatable 녹색 형광 단백질 (GFP PA) 기자를가지고 자연 면역 어린 싹 센터와 혼합된 murine 골 키메라의 생성을 설명 합니다. 이 다운스트림 분자 및 기능 분석 조직에 세포 위치를 연결 하는 기능을 제공 합니다.

면역의 혼합된 공상 모델에 Photoactivation에 의해 개별 Autoreactive 어린 싹 센터 질문

이 프로토콜은 단백질 활성의 가역적 시공간 제어를 위해 엔지니어링된 청색광 활성화 알로스테릭 스위치(LightR) 도메인의 적용을 설명합니다. 이 연구는 Src 티로신 키나아제를 모델로 활용하여 광 조절 Src(LightR-Src)를 개발하고 특성화하기 위한 정교한 프로토콜을 제공합니다. 이는 효소 종류 전반에 걸쳐 이 접근법의 다양성을 보여줍니다.

Optogenetic Allosteric Regulation을 통한 단백질 활성의 시공간 제어

이 프로토콜은 mRNA 전기천공에 의한 일차 T 세포의 분리, 활성화, 증식, 일시적 형질전환 등 원차 T 세포 배양의 필수 단계를 설명합니다. 또한, 표현형, 활성화 마커, 생존 가능성 및 키메라 항원 수용체(CAR) 발현의 유동 세포 분석을 위한 워크플로우 및 항체 패널도 제안됩니다.

1차 인간 T 세포의 분리, 배양 및 일시적 형질인화를 통해 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포를 생성하는 방법

배우세요 광활성화 가능한 펩타이드-MHC를 사용하여 T 세포 활성화의 공간적 및 시간적 제어를 구현하는 방법을. 이 기술은 면역 세포 신호 전달의 정확한 역학과 극성화를 연구하는 데 활용됩니다.

Photoactivatable 길 항 제를 사용 하 여 T 세포 활성화의 공간 및 시간 제어

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