Name: 제어 하 고 셀 상호 작용에서 유전자 표현 패턴을 분석 하는 Optogenetic 메서드 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: 배우세요 옵토제네틱스를 활용한 C2C12 세포 간 진동 정보 전달 분석 방법입니다. Notch 신호 경로를 통해 세포 간 통신을 정밀하게 제어하고 관찰하여 다세포 시스템의 유전자 발현 역학을 연구할 수 있습니다.

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이 작품은 진화 과학 및 기술 (JPMJCR12W2 (R.K.)), 과학 연구 혁신 분야 (교육, 문화, 스포츠, 과학, 및 기술 (MEXT), 일본에 대 한 특정 JST, 프레스 토 (A.I.), 핵심 연구에 의해 지원 되었다 26119708 (A.I.) 및 16 H 06480 (R.K.)), 과학 연구 (A) (일본 사회 과학 (JSP) 24240049의 승진에 대 한 (R.K.)), 그리고 젊은 과학자 (A) (JSP 15 H 05326 (A.I.)), 그리고 혁신적인 지역 "형광에 대 한 과학적 연구에 대 한 특정 라이브 이미지 "문 부 과학성, 일본, 그리고 플랫폼의 동적 접근에 대 한 생활 시스템을 문 부 과학성, 일본에서에서입니다.

1. Tol2 시스템으로 안정적인 셀 라인의 세대
<ol><li>
C2C12 셀에 transposase (Tol2) 식 벡터 (pCAGGS-mT2TP)와 Tol2 기반의 optogenetic 모듈의 플라스 미드 벡터 (그림 1A)를 transfect. 모든 단계, 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 37 ° C (표 1), 5% CO2, 그렇지 않으면 표시의 존재에서 페니실린 스 보충 DMEM 매체와 문화 셀.
	<ol>
<li>셀 카운터, trypsinized 세포와 당 12-잘 접시에 잘 플레이트 5 x 104 C2C12 세포 transfection 전에 1 일 계산.</li>
		<li>Lipofection 시 약을 사용 하 여 optogenetic Tol2 기반 벡터 (pAI177 또는 pAI218), 약물 선택 벡터 (pAI170)의 0.125 μ g과 pCAGGS mT2TP 벡터의 0.5 μ g의 0.375 μ g를 transfect 공동.</li>
		<li>Transfected 세포, trypsinize 그리고 그들을 transfection 후 1 일 100mm 문화 요리에 접시.</li>
		<li>문화 매체 100 mg/mL hygromycin 보충 transfected 세포에 대 한 문화 매체를 교환 합니다.</li>
		<li>3 일 취소 transfected 세포를 제거 하기 위한 문화 셀. 참고 중간 변경 필요 하지 않습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trypsinize transfected 세포 고 정화 선택을 위해 형광 단백질을 표현 하는 세포의 인구. 수신기 세포 pAI177를 들고, 그린 PE 채널 mCherry-긍정적인 세포 인구의 정화에 대 한 정렬 게이트를 설정 합니다. 사진에 민감한 보낸 셀 pAI218 운반, 송출 채널 iRFP713-긍정적인 세포 인구의 정화에 대 한 정렬 게이트를 설정 합니다.</li>
	<li>(선택 사항) 표준 메서드를 제한 희석 또는 단일 셀 FACS에 의해 정렬 하 여 클론 세포 인구를 구축.</li>
</ol>2. 사진-감도 인구 수준에서 설계 된 셀의 평가
참고:이 부분에서는 생 화 확 적인 분석 실험, 정량 등 서양 blotting에 의해 블루 빛 조명에 따라 Dll1 ligand 단백질의 동적 유도 확인 하려면 프로토콜을 설명 합니다.
<ol><li>각각 두 가지 유형의 광원 없이 incubators 빛 유도 조건 또는 어두운 상태에 대 한 설정. 설치는 파란 LED 트랜스-조명 기, 그림 1B와 같이 노출 계를 사용 하 여의 빛 강도. 프로그램 타이밍 및 조명 (그림 1C)에 대 한 프로그래밍 가능한 일정 수를 단일 보드 마이크로-컨트롤러 제어 스크립트를 로드 하 여 빛 조명 기간</li>
	<li>셀 카운터 trypsinized 셀과 판 1.0 x 105 사진-민감한 보낸 셀 pAI218과 pAI170 35 m m 직경 플라스틱 문화 요리 (빛 조건에 대 한 이상 12 요리와 어두운 조건에 대 한 1 접시)에 고 요리를 설정 어둠/빛의 조건에 대 한 incubators 구분 합니다. 요리를 설정한 후 세포 lysates 수집까지 산부인과의 문을 유지.</li>
	<li>도금, 후 하나 30 일 시작 빛 조명 (셀 80% 이상이 될 것으로 예상 된다 confluent). 셀을 바람직하지 않은 사진-자극을 피하기 위해 빛을 노출 하지 마십시오. 참고: 일정 조명에 대 한 실험의 목적에 따라 달라 집니다. 지속적인된 조명 조건 (예. 1-분 기간 및 10 분 간격으로 40 µ / m2/s 빛 강도) 사진-유도, 그리고 그 강한 빛 조명에 대 한 간단한 검사는 셀에 대 한 충분 한가. 따라서, 조명에 대 한 무해 매개 변수 선택 되어 있는지 확인 합니다.</li>
	<li>도금, 후에 2 일 약 30 분 간격으로 세포 lysate 준비. 얼음, 그리고 세포 lysates 추가 분석을 위해 준비 시작을 인큐베이터에서 샘플 요리를 이동 합니다.</li>
</ol>3. 인구 수준에서 분석 결과 동적 발신자-수신자: PMT에 의해 광 자극에 세포질 응답의 실시간 모니터링
<ol><li>Trypsinize 및 발신자와 수신기 셀의 숫자 표준 방법. 혼합 104 수신기와 1.25 x 10 x 2.5의5 보낸 셀 (1:5 비율)의 1 mL 전체 볼륨을 준비 합니다. 참고: 2:1, 1:1 또는 1:2 보낸 사람 수신기 비율 또한 작동 1.5 x 10의 전체 휴대폰 번호5. 10
</li>
	<li>플레이트 1 m m의 소를 포함 하는 문화 매체와 셀에 24-잘 블랙 플레이트의 각 잘 혼합.</li>
	<li>플레이트 리더 luciferase 분석 결과 대 한 셀을 분석 하 고 출력 신호 기록 시스템에 대 한 너무 높은 되는지 확인. 참고: 출력 신호 1 x 106 광자 수/s 보다 더 높은 경우에, 그들은 수 수 포화. 이 경우, 출력 신호는 1 x 106 광자 수/s 보다 낮은 최적의 값으로 소의 농도 줄일.</li>
	<li>기록 시스템에 접시를 설정 하 고 녹음 프로그램 (그림 1D) 시작. 예를 들어 녹음 후 18 h에서 빛 조명을 시작 합니다. 참고: 임시 필터링와 같은 이동 평균 및 Savitzky Golay 필터링, 신호 트렌딩 웨이브 폼의 시각화를 위한 유용 피크 탐지.</li>
</ol>4. 단일 셀 수준에서 분석 결과 동적 발신자-수신자: 실시간 Optogenetic 섭 동 통제 단일 세포 응답의 이미징
<ol><li>플레이트 0.5 x 105 수신기 그리고 2.5 x 27 mm 직경 유리 베이스 35 m m 직경 요리에 105 보낸 사람 세포. 그 혼합 비율 및 총 세포 수 (셀 밀도) 올바르게 조정 됩니다 확인 하십시오.</li>
	<li>도금, 후에 1 일 교환 기록 매체의 2 mL와 매체 (페 놀 레드 무료 DMEM 매체 보충 5 %FBS, 페니실린-스와 1mm 소), 현미경에 유리-기본 요리를 설정. 필요한 경우, PBS (-)와 죽은 세포의 파편 세척 한다. 참고: 그것은 어두운 상태에서이 단계를 수행 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>37 ° C, 5% CO2환경 챔버를 장착 한 거꾸로 한 현미경을 설정 합니다.</li>
	<li>냉각된 CCD 카메라를 설정 합니다. 대상 값 (일반적으로-90 ° C) CCD 센서의 온도 아래로 냉각은 확인 하십시오.</li>
	<li>
5 분 간격으로 이미지와 보다 더 288를 자동 수집 소프트웨어에 "다차원 Timelapse" 창에 대 한 매개 변수 설정 (하나 이상의 야간 녹화) 시간.
	<ol>
<li>"다차원 Timelapse" 창을 열고, 풀 다운 메뉴에서 발광 채널 및 느린 50 kHz 읽기 모드를 선택 하 고 4 × 4 4 민 노출 binning 설정. 읽기 모드 읽어 소리를 약하게 발광 발광 빛을 감지를 줄이기 위한 중요 한 느린 50 kHz 모드로 설정 되어 있는지 확인 하십시오.</li>
		<li>"다차원 Timelapse" 창을 열고, 풀 다운 메뉴에서 형광 채널 및 고속 1mhz 읽기 모드를 선택 하 고 2 x 2 400 ms 노출 binning 설정. 읽기 모드 형광 영상에 필요한 시간을 줄이기 위해 빠른 1 MHz 모드로 설정 되어 있는지 확인 합니다.</li>
		<li>시간 경과 "취득" 버튼을 클릭 하 여 녹음 시작 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>다음과 같이 이미지 분석 소프트웨어, 시간 경과 영화에서 발광 채널의 단일 셀 자취를 추출 합니다. 먼저, 이미지 분석 소프트웨어를 이미지 데이터를 가져와서 발광 및 형광 스택 이미지를 확인 합니다. 발광 이미지에 대 한 ("SpikeNoise 필터"로 구현), 이전 및 다음 프레임의 시간 평균을 픽셀 값으로 바꿔 일시적으로 인접 한 이미지에서 픽셀의 농도 비교 하 여 우주선에서 파생 된 핫 픽셀 제거 이러한 처리 이미지 공간 스무 딩 필터를 적용 하 고 각 프레임에서 out-field 뷰의 배경 픽셀 값을 뺍니다. 그런 다음, "관심 영역"을 결정 (투자 수익) 각 시간 지점에서 형광 이미지에 각 셀에 대 한 투자 수익 발광 이미지를 적용 하 고 각 투자 수익의 발광 강도 측정.</li>
</ol>

<ol><li>Hubaud, A., Pourquie, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+dynamics+in+vertebrate+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Signalling dynamics in vertebrate segmentation.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15, 709-721 (2014).</li>
<li>Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourquié, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronised+cycling+gene+oscillations+in+presomitic+mesoderm+cells+require+cell-cell+contact%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells require cell-cell contact.</a> Int. J. Dev. Biol. 49, 309-315 (2005).</li>
<li>Masamizu, Y., Ohtsuka, T., Takashima, Y., Nagahara, H., Takenaka, Y., Yoshikawa, K., Okamura, H., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+the+somite+segmentation+clock%3A+revelation+of+unstable+oscillators+in+the+individual+presomitic+mesoderm+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cell.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 1313-1318 (2006).</li>
<li>Tsiairis, C., Aulehla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Organization+of+Embryonic+Genetic+Oscillators+into+Spatiotemporal+Wave+Patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Self-Organization of Embryonic Genetic Oscillators into Spatiotemporal Wave Patterns.</a> Cell. 164, 656-667 (2016).</li>
<li>Jiang, Y. J., Aerne, B. L., Smithers, L., Haddon, C., Ish-Horowicz, D., Lewis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signalling+and+the+synchronization+of+the+somite+segmentation+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Notch signalling and the synchronization of the somite segmentation clock.</a> Nature. 408, 475-479 (2000).</li>
<li>Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell-resolution+imaging+of+the+impact+of+Notch+signaling+and+mitosis+on+segmentation+clock+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell-resolution imaging of the impact of Notch signaling and mitosis on segmentation clock dynamics.</a> Dev. Cell. 23, 995-1005 (2012).</li>
<li>Dale, J. K., Maroto, M., Dequeant, M. L., Malapert, P., McGrew, M., Pourquié, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periodic+inhibition+by+Lunatic+Fringe+underlies+the+chick+Segmentation+Clock%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Periodic inhibition by Lunatic Fringe underlies the chick Segmentation Clock.</a> Nature. 421, 275-278 (2003).</li>
<li>Okubo, Y., Sugawara, T., Abe-Koduka, N., Kanno, J., Kimura, A., Saga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lfng+regulates+the+synchronized+oscillation+of+the+mouse+segmentation+clock+via+trans-repression+of+Notch+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Lfng regulates the synchronized oscillation of the mouse segmentation clock via trans-repression of Notch signalling.</a> Nat. Commun. 3, 1141(2012).</li>
<li>Shimojo, H., Isomura, A., Ohtsuka, T., Kori, H., Miyachi, H., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillatory+control+of+Delta-like1+in+cell+interactions+regulates+dynamic+gene+expression+and+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis.</a> Genes Dev. 30, 102-116 (2016).</li>
<li>Isomura, A., Ogushi, F., Kori, H., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+perturbation+and+bioluminescence+imaging+to+analyze+cell-to-cell+transfer+of+oscillatory+information%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Optogenetic perturbation and bioluminescence imaging to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information.</a> Genes Dev. 31, 524-535 (2017).</li>
<li>Wang, X., Chen, X., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+control+of+gene+expression+by+a+light-switchable+transgene+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system.</a> Nat. Meth. 9, 266-269 (2012).</li>
<li>Imayoshi, I., Isomura, A., Harima, Y., Kawaguchi, K., Kori, H., Miyachi, H., Fujiwara, T. K., Ishidate, F., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillatory+control+of+factors+determining+multipotency+and+fate+in+mouse+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors.</a> Science. 342, 1203-1208 (2013).</li>
<li>Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tol2%3A+a+versatile+gene+transfer+vector+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates.</a> Genome Biol. 8, Suppl 1. S7(2007).</li>
<li>Yagita, K., Yamanaka, I., Emoto, N., Kawakami, K., Shimada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+circadian+clock+oscillations+in+primary+cultures+of+mammalian+cells+using+Tol2+transposon-mediated+gene+transfer+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using Tol2 transposon-mediated gene transfer strategy.</a> BMC Biotechnology. 10, 3(2010).</li>
<li>Filonov, G. S., Piatkevich, K. D., Ting, L. -M., Zhang, J., Kim, K., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bright+and+stable+near-infrared+fluorescent+protein+for+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging.</a> Nat. Biotechnol. 29, 757-761 (2011).</li>
<li>Gregor, T., Fujimoto, K., Masaki, N., Sawai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+onset+of+collective+behavior+in+social+amoebae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The onset of collective behavior in social amoebae.</a> Science. 328, 1021-1025 (2010).</li>
<li>Kellogg, R. A., Tay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+facilitates+transcriptional+control+under+dynamic+inputs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs.</a> Cell. 160, 381-392 (2015).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

우리는 유전자 식 역학 2 ~ 3 h의 주기를 제어 하는 방법을 보였다. 이 시간 단위 Tet에 시스템 및 원래 LightOn 시스템을 포함 하 여 다른 기존 시스템에 있는 것 들 보다 훨씬 짧습니다. Ultradian 시간의 척도 도달 주요 매개 변수는 분자 제품 사진 유도, mRNAs 및 단백질의 반감기. 이러한 운동 매개 변수 세포 유형 및 종에 달려 있습니다. 활동을 조정에 대 한 다른 시퀀스 Hes1 3' UTR 대체 시퀀스 및 대상 단백질의 기능 변경 되지 않습니다 때문에 스트레이트-앞으로 방법입니다. 다른 3' Utr 바람직한 타악기 패턴 특히 관심사의 세포를, 추구에 대 한 라이브 셀 모니터링 dLuc 빛 유도 의해 좋은 출발점 및 사용 검사 및 유효성 검사에 대 한.
빛에 민감한 세포의 일일 처리에 대 한 가장 자주 묻는 질문 중 하나입니다. 노치 신호 보낸 사람 수신기 동적 분석 결과 경우 우리가 우리의 시스템 (사진 유도할 수 있는 dLuc 또는 Dll1 전지...

셀 통신 발달 과정에서 배아 패턴에 중요 한 역할을 재생합니다. 척추 동물 배아 metameric 구조 somites 라는 세분화 시계1시간 유지 시계의 통제 정확한 시간 정확도 이전 후부 몸 축 형성 된다. 이 과정 presomitic mesoderm (PSM) 세포의 그룹 동기 방식에서 somites로 주기적으로 변환 됩니다. 이 프로세스 동기화 진동 유전자 발현 포함 하 고 단계에 진동 하는 PSM 셀 같은 somites 형성. 진동 유전자 발현의 기간은 약 2 ~ 3 h 쥐와 제 브라에서 약 30 분입니다. 해리, PSM 셀 손실 synchrony2,3, 하지만 그들은 다시 집계 하는 때, 그들은 자체 구성 하 고 인구 synchrony4, 셀 커플링 하자는 동기화에 대 한 키 복구 진동입니다.
광범위 한 노력 델타-노치 통로 신호 분자 세분화 시계 유전자의 동기화 된 진동에 단단히 연결 되어 있는지 밝혀. 약리학 억제제 또는 노치 신호의 유전자 변이 발진기의 인구 desynchronize. Zebrafish, 노치 신호 구성 요소, DeltaC, DeltaD, Notch1a, 등의 돌연변이 비동기 진동5,6표시 합니다. 여자 또는 마우스 배아에서 노치 ligand 델타-like1 (Dll1) 뿐만 아니라 노치 변조기 미치광이 프린지 (Lfng)는 동기화 된 진동7,,89필요 합니다. 그러나 유전자 규칙 역학의 기존의 섭 동의 시간적 해상도 조사 하는 데 충분 하지 않았기 때문에, 그것은 셀을 동적 정보 전송에 대 한 이러한 분자의 기능 기능을 테스트 하기 어려운 되었습니다는 2-3 h (ultradian 리듬)의 계획의 프로세스.
최근 포유류 세포10제어 및 모니터 유전자 표현 패턴을 통합된 방법을 개발 했습니다. 이 기술은 ultradian 시간의 척도에 주기적인 빛 조명에 의해 유도를 유전자 식 펄스의 수 있습니다. 이 프로토콜은 감광 세포 선 확립 및 라이브 셀 발광 셀 통신의 문맥에서 모니터링 하 여 기자 세포의 동적 응답을 관찰 하는 방법을 나타냅니다. 이 방법은 많은 다른 신호 통로의 분석에 적용 됩니다.

<table><tbody><tr><td>FACS</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>FACSAriaII SORP</td><td></td></tr><tr><td>카메라</td><td>Andor</td><td>iKon M-934</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Olympus</td><td>IX-81 ZDC</td><td></td></tr><tr><td>PMT 장치</td><td>Churitsu eletric corp.</td><td>CL24B-LIC/B</td><td></td></tr><tr><td>블루 LED 조명기</td><td>OptoCode</td><td>LEDB-SBOXH</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Nacalai</td><td>08459-35</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Nacalai</td><td>26253-84</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>시그마</td><td>172012</td><td></td></tr><tr><td>KRYSTAL24(블랙 24웰 플레이트)</td> <td>하이테크</td><td>303012</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin 칼륨 Salt</td><td>Nacalai</td><td>20028-24</td><td></td></tr><tr><td>조도계</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>LI-250A</td><td></td></tr><tr><td>항-HA-과산화효소 항체</td><td>Roche</td><td>클론 3F10</td><td></td></tr><tr><td>항-Actin-Peroxidase 항체</td><td>Wako</td><td>클론 2F3</td><td></td></tr></tbody></table>

제어 하 고 셀 상호 작용에서 유전자 표현 패턴을 분석 하는 optogenetic 메서드

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

셀은 일시적으로 셀 주변에서 다양 한 요인에 의해 영향을 환경 변화에 제대로 응답 해야 합니다. 노치 신호 전달 경로 같은 필수 분자 기계 셀 통신, 태아의 정상적인 발전에 핵심 역할 중 하나입니다. 이 통로 포함 ultradian 리듬, 진동 정보 셀을 전송 하지만 분자 생물학 기술에 있는 진도도 불구 하 고 그것은 되었습니다 도전 진동 유전자에 다세포 상호 작용의 영향을 명료 하 게 역학입니다. 여기, 우리는 optogenetic 제어 및 정확한 시간적으로 유전자 표현 패턴을 라이브 감시를 허용 하는 프로토콜을 제시. 이 메서드는 성공적으로 노치 신호의 세포내와 세포 주기 입력 기본 진동 주파수 튜닝 및 위상 단일 셀 해상도에서 이동 하 여 끌고가 다 밝혔다. 이 방식은 다세포 시스템에서 동적 유전자 식 프로그램의 기능적 중요성을 테스트 하려면 독특한 플랫폼을 제공 하는 다양 한 신호 통로의 동적 특징의 분석에 적용 합니다.

우리는 LightOn 시스템11,12, 2-3 h 주기와 유전 발진기의 연구에 포유류 세포에 있는 사진 유도 유전자 발현을 가능 하 게 적응. 이 시스템은 두 부분: 사진 유도할 수 있는 transcriptional 활성 제 hGAVPO 및 드라이브의 임의 유전자의 전사를 UAS 발기인 카세트. 사진 유도 유전자 발현의 타악기 활동을 가속, UAS 발기인 카세트에 polyA 시퀀스 murine Hes1 3' UTR는 mRNA 반감기 murine fibroblasts에 20 분 단축에 의해 대체 되었다.
안정적인 셀 라인을 설정 하기 위해 Tol2 transposase 시스템에 따라 트라이 cistronic 벡터 사용된13</su...

여기, 우리 optogenetic 컨트롤의 진동 정보 셀 전송 분석 및 유전자 발현의 모니터링 라이브 프로토콜을 제시. 이 방법은 다세포 시스템에서 동적 유전자 식 프로그램의 기능적 중요성을 테스트 하려면 독특한 플랫폼을 제공 합니다.

제어 하 고 셀 상호 작용에서 유전자 표현 패턴을 분석 하는 Optogenetic 메서드

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

이 실험의 전반적인 목표는 광유전학적 제어 및 유전자 발현의 실시간 모니터링을 통해 진동 정보의 세포 간 이동을 관찰하는 것입니다. 이 방법은 세포가 노치 신호 경로를 통해 서로 통신하는 방법, 특히 세포가 진동 정보를 서로 전달하는 방법에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 매우 높은 정밀도로 유전자 발현 역학을 제어하고 모니터링할 수 있다는 것입니다.이 절차를 시연할 사람은 이 새로운 기술을 개발한 우리 연구실의 연구원인 이소무라 아키히로(Akihiro Isomura)입니다. Tol2 기반 광유전학 모듈의 플라스미드 벡터를 transposase 발현 벡터와 함께 C2C12 세포로 transfection하려면 먼저 세포 계수기로 트립신화된 세포를 계수합니다. 형질주입 하루 전에 12웰 플레이트에 웰당 50, 000개의 C2C12 세포를 플레이트화합니다.그런 다음 lipofection 시약을 사용하여 0.375 μg의 Tol2 기반 광유전 벡터, 0.125 μg의 약물 선택 벡터, 0.5 μg의 transposase 발현 벡터를 동시 transfection합니다. 형질주입된 세포를 트립신화하고 형질주입 하루 후 100mm 배양 접시에 플레이트를 만듭니다. 형질주입된 세포의 배양 배지를 밀리리터당 100mg의 하이그로마이신이 보충된 배양 배지로 교환합니다.형질 주입되지 않은 세포를 제거하기 위해 3일 동안 세포를 배양합니다. 중간 변경은 필요하지 않습니다. 다음으로, 형질주입된 세포를 트립신화하고, 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 수신기 세포와 감광성 세포를 분류하여 선택할 형광 단백질을 발현하는 세포 집단을 정제합니다.광 유도 상태 또는 어두운 상태에 대해 광원이 있거나 없는 두 가지 유형의 인큐베이터를 설정하십시오. 조도계를 사용하여 청색 LED 투과광기의 광도를 설정합니다. 문을 닫은 후 광도를 측정하십시오.조명 일정을 프로그래밍할 수 있는 단일 보드 마이크로 컨트롤러에 제어 스크립트를 로드하여 조명 조명의 타이밍과 지속 시간을 프로그래밍할 수 있습니다. 세포 계수기로 트립신화된 세포를 계수하고, 35mm 직경의 플라스틱 배양 접시에 pAI218 및 pAI170을 운반하는 감광성 발신세포를 100, 000개 플레이트로 만듭니다. 어두운 조건과 밝은 조건을 위해 접시를 별도의 인큐베이터에 넣으십시오.접시를 설치한 후에는 세포 용해물을 수집할 때까지 인큐베이터의 문을 닫아 두십시오. 도금 후 1 일 반이 지나면 조명 조명을 시작합니다. 원치 않는 광 자극을 피하기 위해 세포를 제어되지 않은 빛에 노출시키지 마십시오.따라서 문을 열지 않고 이 단계를 수행하십시오. 여기서 문을 여는 것은 시연용으로만 사용됩니다. 도금 후 약 2일 후에 30분 간격으로 샘플 플레이트를 인큐베이터에서 얼음으로 옮기고 추가 분석을 위해 세포 용해물 준비를 시작합니다.PMT에 의한 광 자극에 대한 세포 반응을 실시간으로 모니터링하려면 먼저 표준 방법으로 송신 및 수신 세포의 수를 트립신화하고 계수합니다. 25, 000의 수신기 및 125의 000의 발신자 세포의 1 밀리리터 총 양 중단을 준비하십시오. 24-well black plates의 각 well에 있는 혼합 세포를 1-millimolar luciferin을 함유한 배양 배지로 플레이트화합니다.루시퍼라제 분석을 위해 플레이트 리더의 세포를 분석하여 출력 신호가 기록 시스템에 비해 너무 높지 않은지 확인합니다. 그런 다음 녹음 시스템에 플레이트를 놓고 녹음 프로그램을 시작합니다. 예를 들어, 녹화를 설정한 후 18시간에 조명 조명을 시작합니다.광유전학 교란의 통제의 밑에 단 하나 세포 응답의 실시간 화상 진찰을 위해, 첫번째 판 50, 000의 수신기 및 250의 250의 27 밀리미터 직경 유리제 기초 35 밀리미터 직경 접시에 보내는 송신자 세포. 혼합 비율과 총 세포 수가 올바르게 조정되었는지 확인하십시오. 도금 후 1일, 2밀리리터의 기록 매체로 매체를 교환합니다.유리베이스 접시를 섭씨 37도의 환경 챔버와 5%의 이산화탄소가 있는 도립 현미경에 놓습니다. 냉각된 CCD 카메라를 설정합니다. CCD 센서의 온도가 목표 값까지 냉각되었는지 확인하십시오.자동 획득 소프트웨어에서 다차원 타임랩스 창에 대한 매개변수를 설정하여 5분 간격으로 288회 이상 이미지를 캡처할 수 있습니다. 다차원 타임랩스 창에서 발광 채널을 선택합니다. 판독 모드가 느린 50kHz 판독 모드로 설정되어 있는지 확인하며, 이는 판독 노이즈를 줄여 약하게 방출되는 생물 발광을 감지하는 데 중요합니다.multi-dimensional time-lapse window에서 fluorescence channels를 선택합니다. 판독 모드가 고속 1메가헤르츠 모드로 설정되어 형광 이미징에 필요한 시간을 줄이십시오. 마지막으로 400밀리초 노출로 2x2 비닝을 설정합니다.다음으로, 저널 탭을 선택하여 주기적인 청색광 조명으로 세포를 자극하는 일정을 설정합니다. 더하기 버튼을 클릭하여 새 저널 설정을 추가합니다. 저널 상자에서 저널 파일을 선택하고, 여러 시점을 선택하고, 초기점 및 구간 상자에 값을 설정하여 시뮬레이션을 스케줄링합니다.지정된 저널 파일에 조명, 셔터 열기, 지연, 셔터 닫기 및 지연을 선택하기 위한 순차적 프로토콜이 포함되어 있는지 확인합니다. 다음으로, 주기적인 청색광 조명으로 세포를 자극하기 위한 스케줄을 설정합니다. 마지막으로 Acquire 버튼을 클릭하여 타임랩스 녹화를 시작합니다.마지막으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 타임랩스 동영상에서 발광 채널의 단일 세포 흔적을 추출합니다. 광유전학적 송신자-수용자 분석의 대표적인 결과가 여기에 나와 있습니다. 광유도성 발신세포는 예상대로 주기적인 청색광 조명의 존재 하에서 델타 리간드 발현의 진동 패턴을 생성했습니다.수신기 세포가 감광성 송신기 세포와 공동 배양되고 반복적인 광 조명에 노출되면 실시간 생물 발광 기록 시스템이 다양한 혼합 비율 조건에서 수신기 세포의 주기적 반응을 감지합니다. 또한, 반복적인 광 조명을 사용한 타임 랩스 현미경은 단일 세포 수준에서 수신기 세포의 동기화된 반응을 보여줍니다. 개발 후 이 기술은 세포 생물학 분야의 연구자들이 유전자 발현의 동적 정보가 세포-세포 상호 작용에서 어떻게 전달되는지 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

an-optogenetic-method-to-control-analyze-gene-expression-patterns

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

유전학과 광학을 결합 신경 과학 도구의 최근 개발, 공간 및 시간 해상도의 전례없는 수준의 신경 회로의 활동을 제어 할 수 있습니다, "optogenetics"라고. 여기에서 우리는 전두엽 피질과 subicular 피라미드 뉴런의 유전 정의 된 부분 집합의 optogenetic 조작과 생체 녹화에 통합하기위한 프로토콜을 제공합니다.

개별 피라미드 뉴런의 고 충실도 Optogenetic 제어하는​​ 방법<em&gt; 생체 내</em

광유전학은 행동 신경과학 실험에 사용할 수 있는 강력한 도구가 되었습니다. 이 프로토콜은 레이저 시스템의 설계 및 설정에 대한 단계별 가이드를 제공하며, 대부분의 설치류 행동 테스트 패러다임과 호환되는 다중 및 동시 생체 내 광유전학적 자극을 수행하기 위한 전체 프로토콜을 제공합니다.

설치류 중추 신경계의 생체 Optogenetic 자극

이 프로토콜은 인공 예측에 관한 중재 RNA 간섭 그대로 신경 회로 내에서 선택적 gene(s)의 감소 식이 구체적으로 연 접 boutons를 자극 하는 optogenetics와 결합 하는 방법에 대 한 워크플로우를 제공 합니다.

연 접 기능 그대로 신경 회로 내에 유전자 최저 효과 특성 인공 microRNAs Optogenetics 결합

특정 신경 인구 또는 뇌 영역의 광유전학 적 조작으로, 행동은 자유롭게 움직이는 동물에 있는 높은 시간 및 공간 해상도로 수정될 수 있습니다. 만성 이식 된 광섬유와 함께 다른 광유전학 도구를 사용하여 다양한 신경 변조 및 행동 테스트를 수행 할 수 있습니다.

자유롭게 움직이는 마우스에 있는 행동을 조절하기 위하여 신경 활동의 광유전학 조작

광-반응성 포유동물 세포를 안정적으로 제어하려면 광유전학적 방법의 표준화가 필요하다. 이러한 목표를 향하여, 본 연구는 유전자 회로 구축, 세포 공학, 광유전학 장비 운영 및 검증 분석의 파이프라인을 개괄하여 네거티브 피드백 광유전학 유전자 회로를 이용한 광유도 유전자 발현 연구를 사례 연구로 표준화한다.

포유류 세포에서 안정적인 광유전학적 유전자 회로를 안정적으로 엔지니어링하고 제어합니다.

생체발광-루시퍼라제 효소에 의해 방출되는 광은 소분자 기질인 루시페린-광감각 단백질을 활성화시키기 위해 이용될 수 있고, 이로써 광 자극에 또 다른 차원을 추가하고 시간적 및 공간적 스케일에 걸쳐 세포에서 다수의 광-매개 기능의 조작을 가능하게 한다.

생체 발광 광유전학 2.0 : 생체 발광을 활용하여 체외 및 생체 내에서 광감각 단백질을 활성화 합니다.

미생물 대사의 광유전학적 조절은 발효 과정에 대한 유연한 동적 제어를 제공합니다. 여기의 프로토콜은 다양한 부피 규모에서 화학 및 단백질 생산을위한 청색광 조절 발효를 설정하는 방법을 보여줍니다.

미생물 화학 및 단백질 생산을 위한 광 조절 발효

이 프로토콜은 cAMP 센서와 광유전 단백질인 bPAC-nLuc를 transfection하여 세포 분포와 광 자극에 대한 반응을 정확하게 추적합니다. 포인트 스캐닝 시스템을 사용하여 cAMP 응답 맵을 만드는 혁신적인 접근 방식은 다양한 분야에서 광유전 단백질에 대한 연구를 발전시킬 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

광 자극 그리드를 사용한 광유전 단백질의 세포 분포 매핑

신호 전달 경로의 광유전학적 조작은 발달, 재생, 항상성 및 질병에서 신호전달이 어떻게 해독되는지 조사하는 강력한 전략이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 초기 제브라피시 배아에서 광-산소-전압 감지 도메인 기반 결절 및 뼈 형태 형성 단백질(BMP) 신호 활성제를 사용하기 위한 실용적인 지침을 제공합니다.

제브라피시 배아의 광유전학적 신호전달 활성화

이 프로토콜은 단백질 활성의 가역적 시공간 제어를 위해 엔지니어링된 청색광 활성화 알로스테릭 스위치(LightR) 도메인의 적용을 설명합니다. 이 연구는 Src 티로신 키나아제를 모델로 활용하여 광 조절 Src(LightR-Src)를 개발하고 특성화하기 위한 정교한 프로토콜을 제공합니다. 이는 효소 종류 전반에 걸쳐 이 접근법의 다양성을 보여줍니다.

Optogenetic Allosteric Regulation을 통한 단백질 활성의 시공간 제어

이 연구는 HEK293T 세포에서 빛 유도 유전자 발현을 최적화하기 위해 3D 프린팅 LED 어레이를 사용하는 고처리량 실험 방법을 설명합니다.

포유류 유전자 발현을 제어하기 위한 광유도 시스템의 신속한 최적화

배우세요 옵토제네틱스를 활용한 C2C12 세포 간 진동 정보 전달 분석 방법입니다. Notch 신호 경로를 통해 세포 간 통신을 정밀하게 제어하고 관찰하여 다세포 시스템의 유전자 발현 역학을 연구할 수 있습니다.

제어 하 고 셀 상호 작용에서 유전자 표현 패턴을 분석 하는 Optogenetic 메서드

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