Rab10 인 산화 탐지 LRRK2 활동 인산 염-바인딩 태그와 SDS 페이지를 사용 하 여

이 실험의 전반적인 목표는 인산염 결합 태그가 있는 SDS-PAGE를 사용하여 LRRK2에 의한 Rab10 인산화를 검출하는 것입니다. 이 방법은 LRRK2의 질병 돌연변이가 Rab10 인산화에 미치는 영향과 같은 파킨슨병 연구 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 간단한 웨스턴 블롯을 사용하여 Rab10 인산화의 화학량론을 대략적으로 추정할 수 있다는 것입니다.

이 프로토콜의 많은 단계는 상당히 표준적이며 이 비디오와 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 의해 충분히 자세히 설명되어 있습니다. 여기에서는 시각적 교육의 이점을 가장 많이 받는 단계를 보여주고자 합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 transfection된 HEK293 세포의 플레이트를 준비합니다.

얼음 위에 접시를 놓고 미디어를 흡인하고 버립니다. 다음으로, 각 플레이트의 모서리에 2ml의 DPBS를 조심스럽게 추가하고 플레이트를 흔들어 용액을 펴 바릅니다. 그런 다음 DPBS를 제거하고 폐기합니다.

다음으로, 각 플레이트에 100마이크로리터의 용해 완충액을 추가합니다. 플레이트를 기울이고 스크레이퍼를 사용하여 완충액을 펴고 세포 용해물을 방출합니다. 그런 다음 용해물을 흡인하고 얼음에서 미리 식힌 마이크로분리 튜브로 옮기고 10분 동안 기다립니다.

다음으로, 튜브를 원심분리하고 상층액을 얼음 위의 새 튜브로 옮겨 파편이 없는 세포 용해물을 수집합니다. 그런 다음 Bradford 분석을 사용하여 세척된 용해물의 단백질 농도를 측정합니다. 농도 데이터의 경우 겔 분석을 위해 100마이크로리터의 용해물 샘플을 준비합니다.

과발현된 헤마글루티닌 Rab10과 비교하여 내인성 Rab10을 측정하기 위해 더 조밀한 용해물을 준비합니다. 섭씨 100도에서 5분 동안 배양하여 샘플 준비를 마칩니다. 그런 다음 최대 6개월 이상 필요할 때까지 샘플을 섭씨 영하 20도 이하에서 보관하십시오.

시작하려면 텍스트 프로토콜에 따라 SDS-PAGE 셀을 준비합니다. 그런 다음 젤을 탱크에 넣고 바인더 클립으로 고정합니다. 다음으로, 탱크에 흐르는 버퍼를 채우고 주사기에 부착 된 바늘을 사용하여 우물과 젤 아래의 기포를 제거합니다.

이제 샘플에 염화망간을 추가하고 스핀다운하여 침전물을 제거합니다. 그런 다음 동일한 부피의 샘플, 과발현된 헤마글루티닌 Rab10을 분석하기 위해 10마이크로그램의 단백질을 겔에 로드하거나 내인성 Rab10을 분석하기 위해 30마이크로그램의 단백질을 로드합니다. 빈 레인에 염화망간이 포함된 샘플 버퍼를 로드합니다.

또한 분자량 마커에 완충액과 염화망간을 보충하여 샘플과 동일한 부피로 만듭니다. 이제 50볼트에서 젤을 작동시키기 시작합니다. 샘플 스택 후 전압을 120으로 높여 분리합니다.

염료 전면이 젤 바닥에 도달하면 전압을 차단하십시오. 그런 다음 젤을 다음과 같이 세 번 씻습니다. EDTA 및 SDS가 첨가된 깨끗한 전달 완충액의 수조에 분리 겔을 로드합니다.

그런 다음 실온에서 10분 동안 셰이커에 흔들어 놓습니다. 세 번 세척한 후 SDS가 추가되었지만 EDTA 없이 전달 버퍼를 사용하여 한 번 더 세척을 수행합니다. 그런 다음 젖은 탱크를 사용하여 젤을 옮깁니다.

얼음처럼 차가운 물로 채워진 거품 상자에 탱크를 넣고 탱크를 전원 공급 장치에 연결한 다음 전송을 시작합니다. 효율적인 냉각을 통한 긴 이송은 절차에 필수적입니다. 이송 후 Ponceau S로 멤브레인을 염색한 다음 텍스트 프로토콜에 따라 TBST를 세척하여 이송을 확인합니다.

다음으로 블록을 적용합니다. 유백색 TBST에 블롯을 담그고 실온에서 한 시간 동안 셰이커에 블롯을 흔듭니다. 그런 다음 차단 용액을 제거 및 폐기하고 1차 항체 용액을 도포합니다.

이제 밤새 섭씨 4도에서 멤브레인을 흔듭니다. 다음 날, 1차 항체 용액을 제거합니다. 그런 다음 이전과 같이 신선한 TBST로 멤브레인을 세 번 세척합니다.

세척 후 블롯을 2차 항체 용액에 담그고 실온에서 약 1시간 동안 로커에 멤브레인을 배양합니다. 배양 후 TBST로 멤브레인을 다시 한 번 세 번 세척합니다. 이제 멤브레인을 개발하십시오.

큰 플라스틱 랩에 1ml의 ECL 용액을 추가합니다. 그런 다음 멤브레인을 ECL에 놓고 빠르게 뒤집어 양면을 적십니다. 그런 다음 멤브레인을 들어 올려 배수시킵니다.

물기를 뺀 후 한쪽 가장자리가 종이 타월에 약 5초 동안 닿도록 하여 과도한 용액을 흡수합니다. 그런 다음 멤브레인을 주름이 없는 뻣뻣하고 투명한 필름으로 감싸고 이미징을 위해 검은색 트레이로 옮깁니다. HEK293 세포는 헤마글루티닌 Rab10 야생형 및 3xFLAG-LRRK2로 형질주입되었습니다.

LRRK2의 가족성 파킨슨병 돌연변이에서 비활성 야생형 키나아제를 테스트했습니다. LRRK2와 Rab10의 동시 발현은 P-태그 겔에서 주요 띠 이동을 초래했습니다. 대조적으로, kinase 비활성 돌연변이와의 동시 발현은 Rab10 이동성에 변화를 일으키지 않았으며, 이는 kinase가 밴드 이동의 원인임을 암시합니다.

또한 예상했던 대로, 가족성 PD 돌연변이는 모두 밴드 이동을 증가시켰다. P-태그 겔 시스템은 LRRK2 억제제로 처리된 마우스 3T3-스위스 알비노 배아 섬유아세포 세포를 분석하는 데에도 사용되었습니다. 인산화된 내인성 Rab10에 해당하는 띠 이동은 세포를 GSK2578215A로 처리했을 때 사라졌습니다.

동일한 테스트가 인간 A549 세포를 사용하여 수행되었습니다. 이 실험에서 LRRK2 억제제의 효능은 LRRK2 억제의 잘 확립된 마커인 anti-p serine 935 LRRK2 항체를 사용하여 검증되었습니다. 일단 마스터하면 이 기술은 전사 전에 젤을 세척하는 일반 웨스턴 블로팅 절차에 비해 14분만 추가로 필요합니다.

이 절차에 따라 FPD 돌연변이가 Rab10의 동일한 잔류물을 인산화하는지 여부와 같은 추가 질문에 답하기 위해 질량 분석법과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 파킨슨병 연구 분야의 연구자들이 배양된 세포와 조직에서 Rab10 인산화의 내인성 수준을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 용해 완충액에 microcystin을 첨가하여 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 세포 용해물을 준비하는 동안 항상 적절한 개인 보호 장비를 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 한다는 점을 잊지 마십시오.