Name: Rab10 인 산화 탐지 LRRK2 활동 인산 염-바인딩 태그와 SDS 페이지를 사용 하 여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 학습하세요 인산염-바인딩 태그와 SDS-PAGE를 사용하여 LRRK2에 의한 Rab10 인산화를 탐지하는 방법을. 이 기술은 파킨슨병 연구에서 LRRK2 돌연변이가 Rab10 인산화에 미치는 영향을 분석하는 데 활용됩니다.

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우리는 친절 하 게 제공 하는 인코딩 3xFLAG LRRK2 WT 및 돌연변이 플라스 미드에 대 한 박사 타 케시 Iwatsubo (동경, 일본) 감사 합니다. 우리는 또한 친절 하 게 제공 MLi-2와 HA Rab10 인코딩 플라스 미드에 대 한 박사 다리오 Alessi (던 디 대학, 영국) 감사 합니다. 이 작품 과학 진흥 (JSP) KAKENHI 보조금 번호 JP17K08265 (병사는)에 대 한 일본 사회에 의해 지원 되었다.

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</ol>

저자는 공개 없다.

여기, 우리 감지 LRRK2 P 태그 방법론에 따라 내 생 수준에 의해 인 산화 Rab10 손쉬운 강력한 방법을 설명 합니다. Phosphorylated Rab10에 대 한 현재 사용할 수 있는 항 체 overexpressed 단백질15만으로 작동을 하기 때문에 P 태그 SDS 페이지를 활용 하 여 현재 메서드 Rab10 인 산화의 내 생 수준을 평가 하는 유일한 방법입니다. 또한, 현재 메서드는 셀에 Rab10 인 산화의 산출할 추정 수 있습니다. P 태그 방법론 인 단백질에 일반적으로 적용할 수 있기 때문에, 현재 프로토콜 "프로토 타입" 다른 인 단백질 유사한 방법 수립에 대 한 수 있습니다.
프로토콜에 중요 한 단계는 주조 젤과 샘플의 준비. P 태그 아크릴 상대적으로 사진 정한 시 약 이며 phosphorylated 단백질 전기 이동 기동성을 지체 하는 능력은 4 ° c.에 장기 저장 후 손실 때로는 연구원 P 태그 아크릴 빛에...

PD 주로 영향을 미치는 dopaminergic 신경은 midbrain에 노인1모터 시스템의 장애에서 발생 하는 가장 흔한 신경 퇴행 성 질환 중 하나입니다. 대부분의 환자는 산발적으로 PD를 개발, 질병을 상속 하는 가족이 있습니다. FPD2연결 될 몇몇 유전자에 돌연변이 발견 되었습니다. FPD에 대 한 원인 유전자 중 하나입니다 LRRK2, 8 개의 missense 돌연변이 (N1437H, R1441C/G/H/S, Y1699C, G2019S, 및 I2020T) 라는 PARK8 지배적 상속된 FPD에 연결 보고3,,45를 지금까지 있다. 여러 게놈 넓은 협회 연구 결과 (GWAS) 산발적 PD 환자 또한 식별 LRRK2 로커 스에서 게놈 변이 위험 요인으로 PD, 제안 LRRK2의 기능에 이상이 모두 산발적 neurodegeneration의 일반적인 원인에 대 한 그리고 PARK8 FPD6,,78.
LRRK2 신 부유한 반복 도메인, 복잡 한 단백질 (ROC) 도메인, ROC (오호) 도메인, 떠들고/트레오닌 단백질 키 니 아 제 도메인 및 WD40 반복 도메인9의 C-터미널의 GTP 바인딩 Ras 구성 된 큰 단백질 (2,527 아미노산) 이다. 8 FPD 돌연변이 찾을 이러한 기능 도메인; N1437H 그리고 R1441C/G/H/S ROC 도메인, 오호 도메인, G2019S 및 I2020T 키 도메인에서 Y1699C. 가정 했다 이후로 PD 환자10,,1112에 돌연변이 발견 가장 자주, G2019S 돌연변이 체 외에서2-3 배13LRRK2의 키 니 아 제 활동 증가, LRRK2 substrate(s)의 인 산화의 비정상적인 증가 신경에 독성입니다. 그러나, 그것은 되었습니다 하지 순수 관련 LRRK2 기판의 인 산화 환자 파생된 샘플에서 평가 하는 방법의 부족으로 인해 가족/산발적 PD 환자에서 변경 여부를 공부 하.
단백질 인 산화는 일반적으로 immunoblotting 또는 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 특히 대량 spectrometric 분석 하거나 단백질의 phosphorylated 상태를 인식 하는 항 체를 사용 하 여 검색 됩니다. 그러나, 전 전략 때로는 적용할 수 없습니다 인 산화 특정 항 체를 만드는 어려움 때문에. 방사성 인산 염 세포의 신진 대사 라벨 인 산화 특정 항 체는 쉽게 사용할 수 때 인 산화의 생리 적 수준 검사 다른 옵션입니다. 그러나, 그것은 많은 양의 방사성 물질을 필요로 하 고 따라서 radioprotection14에 대 한 몇 가지 특수 장비를 포함 한다. 대량 spectrometric 분석은 더 민감한이 토론 방법에 비해 고 단백질 인 산화 분석에서 대중적 되었다. 그러나, 샘플 준비 시간 이다-소모, 그리고 비싼 악기는 분석을 위해 필요 합니다.
직접적인 생리 기판 LRRK2 대규모 phosphoproteomic 분석15의 결과에 따라 Rab10와 Rab8를 포함 하 여 랩 GTPase 가족의 부분 집합 최근에 알려졌다. 우리는 다음 Rab10 인 산화 FPD 돌연변이 마우스16를 쫓 고의 폐와 마우스 미 발달 섬유 아 세포에 의해 증가 되었다 설명 했다. 이 보고서에서 우리는 나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지)을 선택-P 태그 분자는 SDS 페이지 젤 (P 태그 SDS 페이지) 검색 Rab10 인 산화의 내 생 수준으로 공동 polymerized 메서드를 기반으로 때문에 phosphorylated Rab10에 대 한 특정 높게 과민 한 항 체는 여전히 부족 했다. 우리는 총 Rab8에 대 한 현재 사용할 수 있는 항 체의 가난한 선택으로 인해 생 Rab8의 인 산화를 감지 하지 못했습니다. 따라서, 우리는 Rab10 인 산화에 집중 하기로 결정 했다. LRRK2는 Thr73 높은 보존 "스위치" II 영역의 중간 위치에서 Rab10를 phosphorylates. Rab 단백질 중 인 산화 위치의 높은 보존 별개 Rab 단백질을 인식 하는 phosphospecific 항 체 확인 하기 어려운 이유 중 하나를 수 있습니다.
LRRK2에 의해 Rab8A의 인 산화 Rabin8, 구 아닌 뉴클레오티드 교환 요인 (GEF) GTP15바인딩된 GDP를 교환 하 여 Rab8A를 활성화의 바인딩을 억제. Rab10 및 Rab8A LRRK2에 의해의 인 산화는 또한 GDP 분리 억제제 (GDIs),이 Rab 단백질의 활성화에 필수적인 막15에서 GDP 바인딩된 Rab 단백질을 추출 하 여 바인딩을 억제. 그 랩으로 LRRK2 단백질의 인 산화에서에서 그들을 방지 활성화는 정확한 분자 메커니즘 및 생리 적인 결과 인 산화의 불분명 남아 있지만 가정은 했다.
P 태그 SDS 페이지 기노시타 외. 2006 년에 발명 했다:이 방법에서는, 아크릴은 covalently와 결합 하 여 P 태그, 캡처 SDS 페이지에 copolymerized 높은 선호도와 인산 염 분자 젤17. SDS 페이지 젤에서 P 태그 분자는 선택적으로 phosphorylated 단백질 전기 이동 기동성을 지체, 때문에 P 태그 SDS 페이지 phosphorylated 아닌 것 들 로부터 phosphorylated 단백질을 분리할 수 있습니다 (그림 1). 관심의 단백질은 여러 잔류물에 phosphorylated, 차동 phosphorylated 모양에 해당 하는 밴드의 사다리 관찰 됩니다. Rab10의 경우 우리는 Rab10 Thr73에만 phosphorylated는 나타내는 하나만 이동된 밴드를 관찰 합니다. 인 산화 특정 항 체와 immunoblotting P 태그 SDS 페이지의 주요 장점은 phosphorylated Rab10 immunoblotting 비 인 산화 특정 항 체 (즉, 인식 총 Rab10)와 의해 검출 될 수 있다 세포 막에 전송 되 고, 후는 일반적으로 더 민감한, 구체적이 고 사용할 수 있는 상업/학술 소스에서. P 태그 SDS 페이지를 사용 하 여의 또 다른 장점은 이다 그 하나 얻을 수 있다 인 산화를의 산출할의 대략적인 추정 인 산화 특정 항 체와 immunoblotting 또는 방사성을 가진 세포의 신진 대사 라벨는 불가능 인산 염입니다.
저렴 한 P 태그 아크릴 및 그것에 관련 된 몇 가지 사소한 수정 사용 떨어져 LRRK2 여 Rab10 인 산화의 검출에 대 한 현재 메서드 immunoblotting의 일반 프로토콜을 다음과 같습니다.따라서, 간단 하 고 쉽게 실행 immunoblotting은 평소 연습, 순화 된 단백질, 세포 lysates 조직 homogenates를 포함 하는 샘플의 어떤 종류와 어떤 실험실에서 이어야 한다.

<table><tbody><tr><td>시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)</td><td>수제</td><td></td><td>150 mM NaCl, 8 mM Na2HPO4-12H2O, 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4 MilliQ 물에 넣고 염화</td></tr><tr><td>나트륨</td><td>Nacalai를 고압증기멸균하여 살균합니다. Tesque</td><td>31320-34</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 인산이나트륨 12-물</td><td>Wako</td><td>196-02835</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Wako</td><td>163-03545</td><td></td></tr><tr><td>인산이수소 칼</td><td>륨 Wako</td><td>169-04245</td><td></td></tr><tr><td>2.5% 트립신(10X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4549</td><td>작업 용액</td></tr> <tr><td>준비를 위한 멸균 DPBS로 10배 희석Dulbecco의 변형 된 Eagle medium (DMEM)</td> <td>Wako</td><td>044-29765</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>BioWest</td><td>S1560</td><td>56 &deg에서 열 비활성화; C 30분 페</td></tr><tr><td>니실린-스트렙토마이신(100X)</td><td>Wako</td><td>168-23191</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Wako</td><td>342-01375</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>Wako</td><td>198-13765</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 HCl MAX, 선형, Mw 40,000(PEI MAX 40000)</td><td>PolySciences, Inc.</td><td>24765-1</td><td>원액을 20mM HEPES-NaOH pH 7.0에서 1mg/mL로 제조한 다음 NaOH 디메틸설폭사이드로 pH를 7.0으로 조정했습니다</td></tr>. <tr><td></td><td>Wako</td><td>045-28335</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>STAR</td><td>RSP-THA500G</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Wako</td><td>080-01066</td><td></td></tr><tr><td>폴리옥시에틸렌(10) 옥틸페닐 에테르</td><td>Wako</td><td>160-24751</td><td>Triton X-100과 동등합니다</td></tr>.<tr><td>에틸렌 글리콜 -비스 (2- 아미노 에틸 에테르) -N, N, N', N'-테트라 아세트산 (EGTA)</td> <td>Wako</td><td>346-01312</td><td></td></tr><tr><td>오르토 바나 데이트 나트륨 (V)</td> <td>Wako</td><td>198-09752</td><td></td></tr><tr><td>불화 나트륨</td><td>간토 화학 물질</td><td>37174-20</td><td></td></tr><tr><td>&beta; -글리세로 인산 나트륨 염 펜타 하이드레이트</td><td>Nacalai Tesque</td><td>17103-82</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 피로인산염 데카하이드레이트</td><td>Kokusan Chemical</td><td>2113899</td><td></td></tr><tr><td>Microcystin-LR</td><td>Wako</td><td>136-12241</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>Wako</td><td>196-00015</td><td></td></tr><tr><td>완전한 EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>-20°C에서 저장할 수 있는 1 mL 물에 한 정제를 용해; C를 한 달 동안 사용합니다. 세포 용해를 위해 1:50 희석으로 사용</td></tr><tr><td>Pierce Coomassie (Bradford) 단백질 분석 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23200</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 도데실 설페이</td>트 <td>Nacalai Tesque</td><td>31607-65</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Wako</td><td>075-00616</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol 블루</td><td>Wako</td><td>021-02911</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-메르캅토에탄올</td><td>Kanto Chemical</td><td>25099-00</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Wako</td><td>056-06967</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Wako</td><td>136-01837</td><td></td></tr><tr><td>인산염 결합 태그 아크릴아미드</td><td>Wako</td><td>AAL-107</td><td>P-태그 아크릴아미드</td></tr><tr><td>40%(w/v) 아크릴아미드 용액</td><td>Nacalai Tesque</td><td>06119-45</td><td>아크릴아미드:Bis = 29:1</td></tr><tr><td>테트라메틸에틸렌디아민(TEMED)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>33401-72</td><td></td></tr><tr><td>과황산암모늄(APS)</td><td>Wako</td><td>016-08021</td><td>10%(w/v) 용액을 과황산암모늄 분말을 MilliQ 물</td></tr><tr><td>2-프로판올</td>에 용해시켜 제조했습니다. <td>Wako</td><td>166-04831</td><td></td></tr><tr><td>염화망간 사수화물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3634</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Prestained Standard</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374, 1610373, 1610377</td><td>프로토콜에 사용되는 분자량 마커</td></tr><tr><td>: WIDE-VIEW Prestained Protein Size Marker III</td>, <td>Wako</td><td>230-02461</td><td></td></tr>, <tr><td>Glycine</td>, <td>Nacalai Tesque</td><td>17109-64</td><td></td></tr>, <tr><td>Amersham, Protran, NC 0.45</td>, <td>GE Healthcare</td><td>10600007</td><td>니트로 셀룰로오스 멤브레인</td></tr>, <tr><td>Durapore 멤브레인 필터</td>, <td>EMD Millipore</td><td>GVHP00010</td><td>PVDF 멤브레인</td></tr><tr><td>필터 Papers No.1</td><td>Advantec</td><td>00013600</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Nacalai Tesque</td><td>28322-72</td><td></td></tr><tr><td>아세트산</td><td>Wako</td><td>017-00251</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>폴리옥시에틸렌소르비탄 모노라우레이트</td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)</td><td>Wako</td><td>345-01865</td><td></td></tr><tr><td>탈지 분유</td><td>Difco Laboratories</td><td>232100</td><td></td></tr><tr><td>Immunostar</td><td>Wako</td><td>291-55203</td><td>ECL 용액(보통 감도)</td></tr><tr><td>Immunostar LD</td><td>Wako</td><td>290-69904</td><td>ECL 용액(고감도)</td></tr><tr><td>CBB 염색 용액</td><td>수제</td><td></td><td>1g CBB R-250, 50%(v/v) 메탄올, 10%(v/v) 아세트산 MilliQ 물 1L,</td></tr><tr><td>CBB R-250</td><td>Wako</td><td>031-17922</td><td></td></tr><tr><td>CBB 탈색 용액</td><td>수제</td><td></td><td>12 % (V / V) 메탄올, 7 % (V/V) 아세트산 1 L MilliQ 물</td></tr> <tr><td>< 강> 이름 < / 강한></td> <td>< 강한> 회사 < / 강한> <</td> <td>강한>카탈로그 번호 < / 강한></td> <td>< 강> 코멘트 < / 강></td></tr> <tr><td>< 강한> 항체 < / 강></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>안티 HA 항체</td><td>시그마 알드리치</td><td>11583816001</td><td>0.2 &mu; 면역 블로팅을 위한 g/mL.</td></tr><tr><td>항-Rab10 항체</td><td>세포 신호 기술</td><td>#8127</td><td>면역블로팅을 위해 1:1000에 사용됨. 특이성은 CRISPR KO에 의해 확인되었습니다.</td></tr><tr><td>anti-pSer935 항체</td><td>Abcam</td><td>ab133450</td><td>1 &mu에서 사용; 면역 블로팅을 위한 g/mL.</td></tr><tr><td>항-LRRK2 항체</td><td>Abcam</td><td>ab133518</td><td>1 &mu에서 사용; 면역 블로팅을 위한 g/mL.</td></tr><tr><td>항 -& 알파; - 튜불린 항체</td><td>시그마 - Aldrich</td><td>T9026</td><td>1 &mu; 면역 블로팅을 위한 g/mL.</td></tr><tr><td>anti-GAPDH 항체</td><td>Santa-Cruz</td><td>sc-32233</td><td>0.02 &mu; 면역 블로팅을 위한 g/mL.</td></tr><tr><td>Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>515-035-003</td><td>0.16 &mu에서 사용됨; 면역 블로팅을 위한 g/mL.</td></tr><tr><td>Peroxidase Affini순수 염소 안티 토끼 IgG (H + L)</td> <td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-035-003</td><td>0.16 &mu에서 사용; 면역 블로팅을 위한 g/mL.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호<</td><td>strong>Comments</td></tr><tr><td>Inhibitors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GSK2578215A</td><td>MedChem Express</td><td>HY-13237</td><td>원액을 DMSO에서 10mM로 제조하고 -80°C에서 저장했습니다. C</td></tr><tr><td>MLi-2</td><td>Dr Dario Alessi (University of Dundee)에 의해 제공됨</td><td></td><td>스톡 용액은 10 mM에서 DMSO에서 준비되고 -80°C에서 저장되었습니다. C</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Plasmids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rab10/pcDNA5 FRT TO HA</td><td>제공: Dr Dario Alessi (University of Dundee)</td><td></td><td>이 플라스미드는 아미노 말단에 HA로 표지된 human Rab10을 발현합니다.</td></tr><tr><td>LRRK2 WT/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Dr Takeshi Iwatsubo (도쿄 대학) 제공Ito</td><td></td> <td>et al., Biochemistry, 46: 1380&ndash; 1388 (2007). 이 플라스미드는 아미노 말단 3xFLAG 태그가 지정된 야생형 인간 LRRK2를 발현합니다.</td></tr><tr><td>LRRK2 K1906M/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Dr Takeshi Iwatsubo (도쿄 대학)</td><td></td> <td>제공 Ito et al., Biochemistry, 46: 1380&ndash; 1388 (2007). 이 플라스미드는 인간 LRRK2의 아미노 말단 3xFLAG 태그가 붙은 K1906M 키나아제 비활성 돌연변이를 발현합니다.</td></tr><tr><td>LRRK2 N1437H/p3xFLAG-CMV-10</td><td></td><td></td><td>이 논문. 이 플라스미드는 인간 LRRK2의 아미노 말단 3xFLAG 태그가 지정된 N1437H FPD 돌연변이를 발현합니다.</td></tr><tr><td>LRRK2 R1441C/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Dr Takeshi Iwatsubo (도쿄 대학)</td> 제공Kamikawaji <td></td><td>et al., Biochemistry, 48: 10963&ndash; 10975 (2013). 이 플라스미드는 인간 LRRK2의 아미노 말단 3xFLAG 태그가 지정된 R1441C FPD 돌연변이를 발현합니다.</td></tr><tr><td>LRRK2 R1441G/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Dr Takeshi Iwatsubo (도쿄 대학)</td> 제공Kamikawaji <td></td><td>et al., Biochemistry, 48: 10963&ndash; 10975 (2013). 이 플라스미드는 인간 LRRK2의 아미노 말단 3xFLAG 태그가 지정된 R1441G FPD 돌연변이를 발현합니다.</td></tr><tr><td>LRRK2 R1441H/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Dr Takeshi Iwatsubo (도쿄 대학) 제공Kamikawaji</td><td></td> <td>et al., Biochemistry, 48: 10963&ndash; 10975 (2013). 이 플라스미드는 인간 LRRK2의 아미노 말단 3xFLAG 태그가 붙은 R1441H FPD 돌연변이를 발현합니다.</td></tr><tr><td>LRRK2 R1441S/p3xFLAG-CMV-10</td><td></td><td></td><td>이 논문. 이 플라스미드는 인간 LRRK2의 아미노 말단 3xFLAG 태그가 지정된 R1441S FPD 돌연변이를 발현합니다.</td></tr><tr><td>LRRK2 Y1699C/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Dr Takeshi Iwatsubo (도쿄 대학)</td> 제공Kamikawaji <td></td><td>et al., Biochemistry, 48: 10963&ndash; 10975 (2013). 이 플라스미드는 인간 LRRK2의 아미노 말단 3xFLAG 태그가 지정된 Y1699C FPD 돌연변이를 발현합니다.</td></tr><tr><td>LRRK2 G2019S/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Dr Takeshi Iwatsubo (도쿄 대학) 제공Kamikawaji</td><td></td> <td>et al., Biochemistry, 48: 10963&ndash; 10975 (2013). 이 플라스미드는 인간 LRRK2의 아미노 말단 3xFLAG 태그가 붙은 G2019S FPD 돌연변이를 발현합니다.</td></tr><tr><td>LRRK2 I2020T/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Dr Takeshi Iwatsubo (도쿄 대학) 제공Kamikawaji</td><td></td> <td>et al., Biochemistry, 48: 10963&ndash; 10975 (2013). 이 플라스미드는 인간 LRRK2의 아미노 말단 3xFLAG 태그가 붙은 I2020T FPD 돌연변이를 발현합니다.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Forma Series II 3110 Water-Jacketed</td><td></td></tr><tr><td>Auto</td><td>Pipette Drummond</td><td>Pipet-Aid PA-400</td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫 P10</td><td>Nichiryo</td><td>00-NPX2-10</td><td>0.5&ndash; 10 &뮤; L</td></tr><tr><td>마이크로피펫 P200</td><td>Nichiryo</td><td>00-NPX2-200</td><td>20&ndash; 200 &뮤; L</td></tr><tr><td>마이크로피펫 P1000</td><td>Nichiryo</td><td>00-NPX2-1000</td><td>100&ndash; 1000 &뮤; </td></tr><tr><td>L 마이크로피펫용 팁 P10</td><td>STAR</td><td>RST-481LCRST</td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫용 멸균 팁 P200</td><td>FUKAEKASEI</td><td>1201-705YS</td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫용 멸균 팁 P1000</td><td>STAR</td><td>RST-4810BRST</td><td>멸균</td></tr><tr><td>5mL 분무성 피펫</td><td>Greiner</td><td>606180</td><td>멸균</td></tr><tr><td>10mL 분무성 피펫</td><td>Greiner</td><td>607180</td><td>멸균</td></tr><tr><td>25 mL 디스퍼저블 피펫</td><td>Falcon</td><td>357535</td><td>멸균</td></tr><tr><td>혈액 세포 분석기</td><td>Sunlead Glass</td><td>A126</td><td>개선 된 Neubeuer</td></tr><tr><td>현미경</td><td>Olympus</td><td>CKX53</td><td></td></tr><tr><td>10cm 접시</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td>조직 배양 용</td></tr><tr><td>6 웰 플레이트</td><td>AGC Techno Glass</td><td>3810-006</td><td>조직 배양 용</td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Scientific Industries</td><td>Vortex-Genie 2</td><td></td></tr><tr><td>셀 스크레이퍼</td><td>Sumitomo Bakelite</td><td>MS-93100</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 튜브</td><td>STAR</td><td>RSV-MTT1.5</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 튜브</td><td>AGC Techno Glass</td><td>2323-015</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 튜브</td><td>AGC Techno Glass</td><td>2343-050</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>TOMY</td><td>MX-307</td><td></td></tr><tr><td>96-웰 플레이트</td><td>Greiner</td><td>655061</td><td>조직 배양용이 아님</td></tr><tr><td>플레이트 리더</td><td>분자 장치</td><td>SpectraMax M2e</td><td></td></tr><tr><td>SDS&ndash; PAGE 탱크</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1010</td><td></td></tr><tr><td>이송 탱크</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1510B</td><td></td></tr><tr><td>겔 플레이트 (노치)</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1000-1</td><td></td></tr><tr><td>겔 플레이트 (일반)</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1000-2</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 스페이서</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1000-16</td><td></td></tr><tr><td>17-well combs</td><td>Nihon Eido</td><td>Custom made</td><td></td></tr><tr><td>바인더 클립</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1000-15</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 주사기</td><td>Terumo</td><td>SS-05SZ</td><td></td></tr><tr><td>21G</td><td>Terumo</td><td>NN-2138R</td><td></td></tr><tr><td>Power Station 1000 VC</td><td>ATTO</td><td>AE-8450</td><td>전원 공급 장치 SDS&ndash; PAGE and transfer</td></tr><tr><td>대형 계량 보트</td><td>Ina Optika</td><td>AS-DL</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 용기</td><td>AS ONE</td><td>PS CASE No.4</td><td>10 x 80 x 50 mm</td></tr><tr><td>흔들림 쉐이커</td><td>Titech</td><td>NR-10</td><td></td></tr><tr><td>스티렌 폼 박스</td><td>일반</td><td></td><td>내부 치수는 하나의 이송 탱크(200 x 250 x 250mm)에 맞아야 합니다.</td></tr><tr><td>ImageQuant LAS-4000</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>ECL 감지를 위한 냉각식 CCD 카메라가 장착된 이미저</td></tr></tbody></table>

rab10 인 산화 탐지 lrrk2 활동 인산 염-바인딩 태그와 sds 페이지를 사용 하 여

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

신 부유한 반복 키 2 (LRRK2)에 돌연변이 가족성 파 킨 슨 병 (FPD) 연결 될 표시 되었습니다. LRRK2의 키 니 아 제 활동의 비정상적인 활성화 PD의 병 인에 연루 되어, 이후 LRRK2의 키 니 아 제 활동의 생리 적인 수준을 평가 하는 방법을 확립 필수적입니다. 최근 연구는 LRRK2 랩 GTPase 가족, Rab10를 포함 하 여 생리 적 조건 하에서 phosphorylates 밝혔다. Immunoblotting에 대 한 현재 사용할 수 있는 인 산화 특정 항 체의 불 쌍 한 감도 때문에 의해 그것을 감지 하기 어려운 되었습니다 LRRK2 경작된 한 세포에 의해 내 생 Rab10의 인 산화는 질량 분석에 의해 검출 될 수, 있지만 Rab10입니다. 여기, 우리는 간단한 설명 LRRK2 여 Rab10 인 산화의 내 생 수준 감지 방식의 immunoblotting 나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 영동 (SDS-PAGE) 인산 염-바인딩 태그 (태그 P)를 함께 활용 하 여 기반을 N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl)-N,N',N'-트리 스 (pyridin-2-yl-메 틸)-1, 3-diaminopropan-2-올. 현재 프로토콜 P 태그를 활용 하는 방법의 예제를 제공 뿐만 아니라 또한 어떻게 돌연변이 억제 물 치료/관리 또는 어떤 다른 요인 든 지의 세포와 조직에 LRRK2 하류 신호을 변경의 평가 가능 하 게 .

Overexpression 시스템: 하-Rab10 3의 인 산화 × 플래그 LRRK2 HEK293에 셀:
HEK293 세포 0.266 µ g의 HA Rab10 야생-타입 및 1.066 µ g 3 × 플래그 LRRK2 (야생-타입, 니 비활성 돌연변이 (K1906M), 또는 FPD 돌연변이)와 페 했다. Rab10 인 산화는 P 태그 SDS 페이지 immunoblotting 안티를 사용 하 여 다음에 의해 시험 되었다-하 항 체 (그림 2). 10 µ g 단백질의 포함 된 50 µ M P 태그 아크릴 100 µ M MnCl210% 젤 (80 x 100 x 1 m m)에 실행 되었다. P-태그 젤 (맨 위 패널)에 대 한 노출 시간이 10 s 표준 ECL 솔루션을 사용 하 여. LRRK2 Rab10와...

현재 연구 신 부유한 반복 키 2 Rab10 인 산화의 내 생 레벨을 탐지 하는 간단한 방법을 설명 합니다.

Rab10 인 산화 탐지 LRRK2 활동 인산 염-바인딩 태그와 SDS 페이지를 사용 하 여

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

이 실험의 전반적인 목표는 인산염 결합 태그가 있는 SDS-PAGE를 사용하여 LRRK2에 의한 Rab10 인산화를 검출하는 것입니다. 이 방법은 LRRK2의 질병 돌연변이가 Rab10 인산화에 미치는 영향과 같은 파킨슨병 연구 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 간단한 웨스턴 블롯을 사용하여 Rab10 인산화의 화학량론을 대략적으로 추정할 수 있다는 것입니다.이 프로토콜의 많은 단계는 상당히 표준적이며 이 비디오와 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 의해 충분히 자세히 설명되어 있습니다. 여기에서는 시각적 교육의 이점을 가장 많이 받는 단계를 보여주고자 합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 transfection된 HEK293 세포의 플레이트를 준비합니다.얼음 위에 접시를 놓고 미디어를 흡인하고 버립니다. 다음으로, 각 플레이트의 모서리에 2ml의 DPBS를 조심스럽게 추가하고 플레이트를 흔들어 용액을 펴 바릅니다. 그런 다음 DPBS를 제거하고 폐기합니다.다음으로, 각 플레이트에 100마이크로리터의 용해 완충액을 추가합니다. 플레이트를 기울이고 스크레이퍼를 사용하여 완충액을 펴고 세포 용해물을 방출합니다. 그런 다음 용해물을 흡인하고 얼음에서 미리 식힌 마이크로분리 튜브로 옮기고 10분 동안 기다립니다.다음으로, 튜브를 원심분리하고 상층액을 얼음 위의 새 튜브로 옮겨 파편이 없는 세포 용해물을 수집합니다. 그런 다음 Bradford 분석을 사용하여 세척된 용해물의 단백질 농도를 측정합니다. 농도 데이터의 경우 겔 분석을 위해 100마이크로리터의 용해물 샘플을 준비합니다.과발현된 헤마글루티닌 Rab10과 비교하여 내인성 Rab10을 측정하기 위해 더 조밀한 용해물을 준비합니다. 섭씨 100도에서 5분 동안 배양하여 샘플 준비를 마칩니다. 그런 다음 최대 6개월 이상 필요할 때까지 샘플을 섭씨 영하 20도 이하에서 보관하십시오.시작하려면 텍스트 프로토콜에 따라 SDS-PAGE 셀을 준비합니다. 그런 다음 젤을 탱크에 넣고 바인더 클립으로 고정합니다. 다음으로, 탱크에 흐르는 버퍼를 채우고 주사기에 부착 된 바늘을 사용하여 우물과 젤 아래의 기포를 제거합니다.이제 샘플에 염화망간을 추가하고 스핀다운하여 침전물을 제거합니다. 그런 다음 동일한 부피의 샘플, 과발현된 헤마글루티닌 Rab10을 분석하기 위해 10마이크로그램의 단백질을 겔에 로드하거나 내인성 Rab10을 분석하기 위해 30마이크로그램의 단백질을 로드합니다. 빈 레인에 염화망간이 포함된 샘플 버퍼를 로드합니다.또한 분자량 마커에 완충액과 염화망간을 보충하여 샘플과 동일한 부피로 만듭니다. 이제 50볼트에서 젤을 작동시키기 시작합니다. 샘플 스택 후 전압을 120으로 높여 분리합니다.염료 전면이 젤 바닥에 도달하면 전압을 차단하십시오. 그런 다음 젤을 다음과 같이 세 번 씻습니다. EDTA 및 SDS가 첨가된 깨끗한 전달 완충액의 수조에 분리 겔을 로드합니다.그런 다음 실온에서 10분 동안 셰이커에 흔들어 놓습니다. 세 번 세척한 후 SDS가 추가되었지만 EDTA 없이 전달 버퍼를 사용하여 한 번 더 세척을 수행합니다. 그런 다음 젖은 탱크를 사용하여 젤을 옮깁니다.얼음처럼 차가운 물로 채워진 거품 상자에 탱크를 넣고 탱크를 전원 공급 장치에 연결한 다음 전송을 시작합니다. 효율적인 냉각을 통한 긴 이송은 절차에 필수적입니다. 이송 후 Ponceau S로 멤브레인을 염색한 다음 텍스트 프로토콜에 따라 TBST를 세척하여 이송을 확인합니다.다음으로 블록을 적용합니다. 유백색 TBST에 블롯을 담그고 실온에서 한 시간 동안 셰이커에 블롯을 흔듭니다. 그런 다음 차단 용액을 제거 및 폐기하고 1차 항체 용액을 도포합니다.이제 밤새 섭씨 4도에서 멤브레인을 흔듭니다. 다음 날, 1차 항체 용액을 제거합니다. 그런 다음 이전과 같이 신선한 TBST로 멤브레인을 세 번 세척합니다.세척 후 블롯을 2차 항체 용액에 담그고 실온에서 약 1시간 동안 로커에 멤브레인을 배양합니다. 배양 후 TBST로 멤브레인을 다시 한 번 세 번 세척합니다. 이제 멤브레인을 개발하십시오.큰 플라스틱 랩에 1ml의 ECL 용액을 추가합니다. 그런 다음 멤브레인을 ECL에 놓고 빠르게 뒤집어 양면을 적십니다. 그런 다음 멤브레인을 들어 올려 배수시킵니다.물기를 뺀 후 한쪽 가장자리가 종이 타월에 약 5초 동안 닿도록 하여 과도한 용액을 흡수합니다. 그런 다음 멤브레인을 주름이 없는 뻣뻣하고 투명한 필름으로 감싸고 이미징을 위해 검은색 트레이로 옮깁니다. HEK293 세포는 헤마글루티닌 Rab10 야생형 및 3xFLAG-LRRK2로 형질주입되었습니다.LRRK2의 가족성 파킨슨병 돌연변이에서 비활성 야생형 키나아제를 테스트했습니다. LRRK2와 Rab10의 동시 발현은 P-태그 겔에서 주요 띠 이동을 초래했습니다. 대조적으로, kinase 비활성 돌연변이와의 동시 발현은 Rab10 이동성에 변화를 일으키지 않았으며, 이는 kinase가 밴드 이동의 원인임을 암시합니다.또한 예상했던 대로, 가족성 PD 돌연변이는 모두 밴드 이동을 증가시켰다. P-태그 겔 시스템은 LRRK2 억제제로 처리된 마우스 3T3-스위스 알비노 배아 섬유아세포 세포를 분석하는 데에도 사용되었습니다. 인산화된 내인성 Rab10에 해당하는 띠 이동은 세포를 GSK2578215A로 처리했을 때 사라졌습니다.동일한 테스트가 인간 A549 세포를 사용하여 수행되었습니다. 이 실험에서 LRRK2 억제제의 효능은 LRRK2 억제의 잘 확립된 마커인 anti-p serine 935 LRRK2 항체를 사용하여 검증되었습니다. 일단 마스터하면 이 기술은 전사 전에 젤을 세척하는 일반 웨스턴 블로팅 절차에 비해 14분만 추가로 필요합니다.이 절차에 따라 FPD 돌연변이가 Rab10의 동일한 잔류물을 인산화하는지 여부와 같은 추가 질문에 답하기 위해 질량 분석법과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 파킨슨병 연구 분야의 연구자들이 배양된 세포와 조직에서 Rab10 인산화의 내인성 수준을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 용해 완충액에 microcystin을 첨가하여 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 세포 용해물을 준비하는 동안 항상 적절한 개인 보호 장비를 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 한다는 점을 잊지 마십시오.

rab10-phosphorylation-detection-lrrk2-activity-using-sds-page-with

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

류신 리치 반복 키나제 2 큰 multidomain의 키나제이며, 돌연변이가있는 파킨슨병의 가​​장 흔한 유전적 원인이됩니다. 이 단백질 키나제의 활동 분석은이 단백질의 생물학과 장애를 이해하는 중요한 도구로 입증되었습니다. 본...

LRRK2의 키나제 활동 시금 체외에서</em

이 동영상은 단일 분자 풀다운 분석을 사용한 단백질 인산화의 민감한 정량화 기술을 보여줍니다. 폴리에틸렌 글리콜-비오틴의 기능화와 표지된 항체의 사용은 특이성을 가진 인산화 티로신의 검출을 증가시킵니다.

단백질 인산화 분석을 위한 Single-molecule pull-down assay: 세포 용해물에서 단백질 인산화를 정량화하기 위한 고처리량 기법

류신이 풍부한 반복 키나아제 1 및 2 (LRRK1 및 LRRK2는) GTPase의 키나제 도메인을 모두 인코딩 세포에서 인산화되는 멀티 도메인 단백질입니다. 여기, 우리는 따라서 전반적인 휴대 phophorylation 수준을 측정 할 수있는 수단을 제공, 32 P 오르토와 세포 LRRK1 및 LRRK2 레이블을하는 프로토콜을 제시한다.

류신 리치의 신진 대사 라벨링 방사성 인산과 키니 아제 1과 2를 반복

여기에서는 IRF3 전사 인자의 인산화 의존적 활성화에 대한 자세한 분석을 허용하는 절차를 설명합니다. 이는 여러 인특이성 항체를 사용하여 면역블롯에 결합된 고분해능 SDS-PAGE와 native-PAGE의 조합을 통해 달성됩니다.

고해상도 방법 IRF3의 인산화에 의존 활성화를 모니터링하려면

펩타이드 경쟁 분석은 다양한 분자 및 면역 학적 실험에 널리 사용됩니다. 이 논문은 in vitro 올리고 펩티드 - 경쟁 키나아제 분석 및 특정 인산화 부위를 찾는 데 유용한 관련 검증 절차에 대한 상세한 방법을 기술한다.

인산화 부위 결정을위한 올리고 펩타이드 경쟁 분석

류신이 풍부한 반복 키나아제 2 유전자(LRRK2)의 돌연변이는 유전성 파킨슨병을 일으킨다. 우리는 인간 말초 혈액 호중구에서 Rab10의 LRRK2 대조 인산화를 평가하기위한 쉽고 강력한 방법을 개발했습니다. 이 증가 LRRK2 키 나 제 통로 활동을 가진 개인을 식별 하는 데 도움이 수 있습니다.

Rab10 인산화를 평가하여 파킨슨병 관련 LRRK2 키나아제 경로를 심문하기 위한 인간 말초 혈액 호중구 격리

이 프로토콜의 목적은 레이블, 풍부, 및 단백질 키 니 아 CK2 세포 lysate 또는 조직 homogenate 같은 복잡 한 생물학 견본에서의 기판 확인 하는 것 이다. 이 메서드는이 목적을 위해 CK2 생물학의 독특한 측면을 활용합니다.

다양 한 생 화 확 적인 접근을 사용 하 여 소설 CK2 키 기판의 식별

우리는 강력한 생화확적인 접근을 사용하여 새로운 키나아제 단백질을 특징으로 했습니다: 다른 세포주 및 조직에 있는 전용적인 항체를 가진 서쪽 얼룩 분석, coimmunocipation 실험에 의하여 상호 작용, 서쪽에 의해 검출된 키나아제 활동 인광 특이적 항체를 사용하여 블롯[32 P] ATP 라벨링에 의해.

새로운 키나제 단백질의 강력한 생화학 적 접근법을 사용하여 분자 수준에서특성화

이 프로토콜은 주문품 휴대용 FRET 분석기를 사용하여 포스터 공명 에너지 전달 (FRET) 센서 데이터의 신속한 고감도 정량 설명한다. 장치는 당도 실용적이고 효율적인 평가를 가능하게 검출 감도를 최대화하는 임계 온도 범위 내에서 말토오스를 검출하기 위해 사용 하였다.

휴대용 FRET 분석과 고감도 및 고속 형광 검출

이 연구는 산성 pH 조건 하에서 대장균 HdeB의 보호자 활동을 특성화, 생물 물리학, 생화학 및 분자 기술에 대해 설명합니다. 이러한 방법은 성공적 HdeA 다른 산 보호 샤페론에 적용되었고, 다른 보호자 스트레스 조건 작동하도록 변경 될 수있다.

의 pH에 ​​의존 활동의 검출<em&gt; 대장균</em&gt; 보호자 HdeB<em&gt; 체외</em&gt; 및<em&gt; 생체</em

학습하세요 인산염-바인딩 태그와 SDS-PAGE를 사용하여 LRRK2에 의한 Rab10 인산화를 탐지하는 방법을. 이 기술은 파킨슨병 연구에서 LRRK2 돌연변이가 Rab10 인산화에 미치는 영향을 분석하는 데 활용됩니다.

Rab10 인 산화 탐지 LRRK2 활동 인산 염-바인딩 태그와 SDS 페이지를 사용 하 여

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